全 文 ：第４３卷　第９期
２０１５年９月
西北农林科技大学学报（自然科学版）
Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ　Ａ＆Ｆ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔ．Ｓｃｉ．Ｅｄ．）
Ｖｏｌ．４３ Ｎｏ．９
Ｓｅｐ．２０１５
网络出版时间：２０１５－０８－０５　０８：５７ ＤＯＩ：１０．１３２０７／ｊ．ｃｎｋｉ．ｊｎｗａｆｕ．２０１５．０９．０２６
网络出版地址：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｋｃｍｓ／ｄｅｔａｉｌ／６１．１３９０．Ｓ．２０１５０８０５．０８５７．０５２．ｈｔｍｌ
柱前衍生ＲＰ－ＨＰＬＣ法测定狗尾草种子氨基酸含量
　［收稿日期］　２０１４－０１－２７
　［基金项目］　国家科技支撑计划项目（２０１１ＢＡＩ０３Ｂ０１）；国家公益性行业科研专项（２０１３０３１１１）；科技部科技人员服务企业项目
（２００９ＧＪＢ１００３１）；吉林省科技发展计划项目（２０１３０３０３０９４，２０１４０２０４０１３ＹＹ，ＹＹＺＸ２０１２５８，２０１４０３１１０５０ＹＹ）
　［作者简介］　赵　岩（１９７９－），男（满族），吉林长春人，副教授，博士，主要从事天然药物化学成分与生物活性研究。
Ｅ－ｍａｉｌ：ｚｈｙｊｌｕ７９＠１６３．ｃｏｍ
　［通信作者］　张连学（１９５５－），男，吉林长春人，教授，博士，主要从事药用植物栽培与加工研究。Ｅ－ｍａｉｌ：ｚｌｘ８６３＠１６３．ｃｏｍ
赵　岩１，唐国胜１，侯莹莹１，郜玉钢１，王士杰２，蔡恩博１，张连学１
（１吉林农业大学 中药材学院，吉林 长春１３０１１８；２吉林农业科技学院 中药学院，吉林 吉林１３２１０１）
［摘　要］　 【目的】采用柱前衍生反相高效液相色谱（ＲＰ－ＨＰＬＣ）法检测狗尾草种子中游离氨基酸和水解氨基酸
含量，为阐明其应用价值提供支撑。【方法】制备狗尾草种子的水解氨基酸样品溶液和游离氨基酸样品溶液，以异硫
氰酸苯酯和三乙胺进行柱前衍生，建立ＲＰ－ＨＰＬＣ法，检测方法的精密性、稳定性、重复性。利用ＲＰ－ＨＰＬＣ法，采用
梯度洗脱方法，检测狗尾草种子中游离氨基酸和水解氨基酸含量。【结果】２１种氨基酸的检测浓度线性范围为
０．００１　９～２．７００　０μｍｏｌ／ｍＬ，相关系数Ｒ
２ 均≥０．９９９　０。２１种游离氨基酸的平均加样回收率在８７．５０％～１００．２０％，
相对标准偏差（ＲＳＤ）在０．８２％～２．４６％；水解氨基酸的平均加样回收率在９１．１０％～１００．２１％，ＲＳＤ 在０．５２％～
２．０８％。必需氨基酸和半必需氨基酸在狗尾草２１种游离氨基酸和水解氨基酸中均含有，但水解后色氨酸、天冬酰胺、
组胺酰胺遭到了破坏，含量较低。【结论】建立的氨基酸测定方法稳定、快速、精密度高、线性范围宽，适合狗尾草种子
中游离氨基酸和水解氨基酸的含量测定。狗尾草种子中含有丰富的游离和水解氨基酸。
［关键词］　狗尾草种子；氨基酸；反相高效液相色谱法；柱前衍生化
［中图分类号］　Ｒ９１７ ［文献标志码］　Ａ ［文章编号］　１６７１－９３８７（２０１５）０９－０１８５－０６
Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ　ｉｎ　ｓｅｅｄｓ　ｏｆ　Ｓｅｔａｒｉａ　ｖｉｒｉｄｉｓ（Ｌ．）Ｂｅａｕｖ．
ｂｙ　ｐｒｅ－ｃｏｌｕｍｎ　ｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ　ＲＰ－ＨＰＬＣ
ＺＨＡＯ　Ｙａｎ１，ＴＡＮＧ　Ｇｕｏ－ｓｈｅｎｇ１，ＨＯＵ　Ｙｉｎｇ－ｙｉｎｇ１，ＧＡＯ　Ｙｕ－ｇａｎｇ１，
ＷＡＮＧ　Ｓｈｉ－ｊｉｅ２，ＣＡＩ　Ｅｎ－ｂｏ１，ＺＨＡＮＧ　Ｌｉａｎ－ｘｕｅ１
（１　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　Ｍａｔｅｒｉａｌ　Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｊｉｌｉｎ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ，Ｊｉｌｉｎ１３０１１８，Ｃｈｉｎａ；
２　Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｊｉｌｉｎ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｊｉｌｉｎ，Ｊｉｌｉｎ１３２１０１，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：【Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ】Ｔｈｉｓ　ｓｔｕｄｙ　ａｉｍｅｄ　ｔｏ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈ　ａ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｎｇ　ｔｈｅ　ｃｏｎｔｅｎｔｓ　ｏｆ　ｆｒｅｅ
ａｎｄ　ｈｙｄｒｏｌｙｚｅｄ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ　ｆｒｏｍ　ｓｅｅｄｓ　ｏｆ　Ｓｅｔａｒｉａ　ｖｉｒｉｄｉｓ （Ｌ．）Ｂｅａｕｖ．ｂｙ　ｐｒｅ－ｃｏｌｕｍｎ　ｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ　ＲＰ－
ＨＰＬＣ．【Ｍｅｔｈｏｄ】Ｔｈｅ　ｓａｍｐｌｅ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ　ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ　ｆｒｅｅ　ａｎｄ　ｈｙｄｒｏｌｙｚｅｄ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｓｅｅｄｓ　ｏｆ　Ｓｅｔａｒｉａ
ｖｉｒｉｄｉｓ（Ｌ．）Ｂｅａｕｖ　ｗａｓ　ｐｒｅｐａｒｅｄ　ｂｅｆｏｒｅ　ｂｅｉｎｇ　ｄｅｒｉｖｅｄ　ｗｉｔｈ　ｐｈｅｎｙｌ　ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ　ａｎｄ　ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ，ａｎｄ
ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｂｙ　ＨＰＬＣ．Ｔｈｅ　ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ，ｓｔａｂｉｌｉｔｙ，ａｎｄ　ｒｅｐｅａｔａｂｉｌｉｔｙ　ｗｅｒｅ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｂｅｆｏｒｅ　ｇｒａｄｉｅｎｔ　ｅｌｕｔｉｏｎ　ｃｈｒｏｍａ－
ｔｏｇｒａｐｈｙ　ｗａｓ　ａｐｐｌｉｅｄ　ｔｏ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ　ｔｈｅ　ｃｏｎｔｅｎｔｓ　ｏｆ　ｆｒｅｅ　ａｎｄ　ｈｙｄｒｏｌｙｚｅｄ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ．【Ｒｅｓｕｌｔ】Ｔｈｅ　２１ａｍｉｎｏ
ａｃｉｄｓ　ｈａｄ　ｇｏｏｄ　ｌｉｎｅａｒｉｔｙ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｒａｎｇｅ　ｏｆ　０．００１　９－２．７００　０μｍｏｌ／ｍＬ　ｗｉｔｈ　ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ　ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｓ　ａｌ　ｏｖｅｒ
０．９９９　０．Ｔｈｅ　ａｖｅｒａｇｅ　ｒｅｃｏｖｅｒｙ　ｏｆ　ｆｒｅｅ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ　ｗａｓ　８７．５０％－１００．２０％ （ＲＳＤ＝０．８２％－２．４６％）．Ｔｈｅ
ａｖｅｒａｇｅ　ｒｅｃｏｖｅｒｙ　ｏｆ　ｔｏｔａｌ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ　ｗａｓ　９１．１０％－１００．２１％（ＲＳＤ＝０．５２％－２．０８％）．Ｔｈｅｒｅ　ｗｅｒｅ　ｅｓｓｅｎ－
ｔｉａｌ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ　ａｎｄ　ｓｅｍｉ　ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ　ｆｏｒ　ｈｕｍａｎ　ｉｎ　ｓｅｅｄｓ　ｏｆ　Ｓｅｔａｒｉａ　ｖｉｒｉｄｉｓ（Ｌ．）Ｂｅａｕｖ．Ｂｕｔ　ｔｒｙｐ－
ｔｏｐｈａｎ，ａｓｐａｒａｇｉｎｅ，ａｎｄ　ｈｉｓｔａｍｉｎｅ　ａｍｉｄｅ　ｗｅｒｅ　ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅｄ　ａｆｔｅｒ　ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ．【Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ】Ｔｈｅ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ
ｍｅｔｈｏｄ　ｗａｓ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ，ａｃｃｕｒａｔｅ，ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｌｅ，ａｎｄ　ｒｅｌｉａｂｌｅ　ｆｏｒ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ．Ｂｏｔｈ　ｆｒｅｅ　ａｎｄ
ｈｙｄｒｏｌｙｚｅｄ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ　ｗｅｒｅ　ｒｉｃｈ　ｉｎ　ｓｅｅｄｓ　ｏｆ　Ｓｅｔａｒｉａ　ｖｉｒｉｄｉｓ（Ｌ．）Ｂｅａｕｖ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｓｅｅｄｓ　ｏｆ　Ｓｅｔａｒｉａ　ｖｉｒｉｄｉｓ（Ｌ．）Ｂｅａｕｖ．；ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ；ＲＰ－ＨＰＬＣ；ｐｒｅ－ｃｏｌｕｍｎ　ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ
　　狗尾草（Ｓｅｔａｒｉａ　ｖｉｒｉｄｉｓ（Ｌ．）Ｂｅａｕｖ．）为禾本
科狗尾草属一年生草本植物，在全球分布广泛，一直
被人们视为害草，而忽略了其药用价值。《本草纲
目》、《本草纲目拾遗》等中药典籍中有记载：狗尾草
具有除热、去湿、消肿、治痈肿、疮癣、赤眼的功效。
贤景春等［１］对狗尾草多酚提取及其抗氧化性进行了
研究，但对于狗尾草种子中游离氨基酸及水解氨基
酸含量尚未见相关报道。而氨基酸有多种药理作
用，例如：谷氨酸是生物机体内氮代谢的基本氨基酸
之一，是动物体内中枢神经系统的一种重要的兴奋
性神经递质，与脑蛋白质和糖代谢、促进氧化过程、
改善中枢神经系统紧密相关；亮氨酸可作为营养增
补剂、调味增香剂，也可配制氨基酸输液及综合氨基
酸制剂、降血糖剂、植物生长促进剂等。氨基酸水解
方法主要有酸水解法、氧化水解法、微波辅助水解
法［２－５］等，测定方法主要有氨基酸自动分析仪分析
法、高效液相色谱法、细管电泳法、紫外检测法
等［６－１０］。柱前衍生高效液相色谱法（ＲＰ－ＨＰＬＣ）测
定氨基酸具有选择性高、分析速度快和灵敏度高等
优点，在药物和临床样品氨基酸分析中得到了广泛
应用，已成为一种较为理想的氨基酸检测方法。本
试验利用ＲＰ－ＨＰＬＣ检测了狗尾草种子中的氨基酸
含量，以期为狗尾草种子的进一步研究和开发利用
提供参考。
１　材料与方法
１．１　材　料
狗尾草种子采收于吉林农业大学校园内，经该
校张连学教授鉴定，阴干，备用。
１．２　仪器与试剂
ＣＸＴＨ－３０００高效液相色谱仪（北京创新通恒科
技有限公司）；ＤＨＧ－９１４０Ａ型恒温干燥箱（上海精
宏实验设备有限公司）；２ＸＺ－４型旋片式真空泵（上
海博一泵业制造有限公司）；ＤＺＦ６０２０真空干燥器
（上海恒科学仪器有限公司）；氨基酸水解管（北京康
农科技发展有限公司）；ＰＨＳ－Ｗ 微机型Ｐｈ／ｍＶ酸
度剂（上海般特仪器有限公司）。甲醇、乙腈，色谱
纯；异硫氰酸苯酯（ＰＩＴＣ），化学纯；２１种氨基酸（国
药集团化学试剂有限公司），分析纯。其他试剂均为
分析纯试剂。
１．３　方　法
１．３．１　试剂的配制　流动相 Ａ：精密称取１５ｇ乙
酸钠，加纯净水溶解，用乙酸调ｐＨ 为６．５，加水至
１．８５Ｌ，加１４０ｍＬ乙腈，摇匀，０．４５μｍ滤膜过滤，
即得０．１ｍｏｌ／Ｌ乙酸钠（ｐＨ　６．５０）与乙腈体积比为
９３∶７的流动相Ａ。
流动相Ｂ：精密量取乙腈８００ｍＬ，水２００ｍＬ，
混匀，０．４５μｍ滤膜过滤，即得乙腈与水体积比为
４∶１的流动相Ｂ。
衍生试剂Ａ（即异硫氰酸苯酯试剂贮备液）：取
２ｍＬ异硫氰酸苯酯置１０ｍＬ量瓶中，用乙腈稀释
至刻度，即得。
衍生试剂Ｂ（即三乙胺试剂贮备液）：取２ｍＬ
三乙胺置１０ｍＬ容量瓶中，用乙腈稀释至刻度，即
得。
１．３．２　氨基酸标准溶液的配制　准确称取天冬氨
酸（Ａｓｐ）１６．７ｍｇ、谷氨酸（Ｇｌｕ）１８．４ｍｇ、丝氨酸
（Ｓｅｒ）１３．１３ｍｇ、甘氨酸（Ｇｌｙ）９．３８ｍｇ、组氨酸
（Ｈｉｓ）１９．３９ｍｇ、精氨酸（Ａｒｇ）２１．７７ｍｇ、苏氨酸
（Ｔｈｒ）１４．９０ｍｇ、丙氨酸（Ａｌａ）１１．１３ｍｇ、脯氨酸
（Ｐｒｏ）１４．３９ｍｇ、胱氨酸（Ｃｙｓ－Ｃｙｓ）１４．０２ｍｇ、半胱
氨酸（Ｃｙｓ）１５．１４ｍｇ、缬氨酸（Ｖａｌ）１４．６４ｍｇ、甲硫
氨酸（Ｍｅｔ）１８．６４ｍｇ、异亮氨酸（Ｌｌｅ）１６．３９ｍｇ、亮
氨酸（Ｌｅｕ）１６．３９ｍｇ、酪氨酸（Ｔｙｒ）２２．６４ｍｇ、苯丙
氨酸（Ｐｈｅ）２０．６４ｍｇ、色氨酸（Ｔｒｐ）２５．５１ｍｇ、赖氨
酸（Ｌｙｓ）１８．２７ｍｇ、天冬酰胺（Ａｓｎ）１６．７０ｍｇ和谷
氨酰胺（Ｇｌｎ）１８．２６ｍｇ，加０．１ｍｏｌ／Ｌ盐酸超声溶
解，配制胱氨酸浓度为０．６２５μｍｏｌ／ｍＬ、其他标样
浓度为１．２５μｍｏｌ／ｍＬ的标准溶液，４℃保存。
１．３．３　供试品溶液的制备与衍生　（１）游离氨基酸
供试品溶液。精密称取狗尾草种子样品０．５ｇ，加入
体积分数５０％乙醇溶液５０ｍＬ，超声提取３０ｍｉｎ，
用滤纸过滤，滤渣再加入体积分数５０％乙醇溶液３０
ｍＬ，超声提取３０ｍｉｎ，过滤，合并２次所得滤液于
８０℃水浴中挥发至近干，用体积分数５０％乙醇溶液
定容至１０ｍＬ。取１ｍＬ提取液，加入衍生试剂 Ａ
和Ｂ各１ｍＬ，于５０℃水浴中保持４５ｍｉｎ，加入正
己烷１ｍＬ萃取，取下层溶液用０．４５μｍ 滤膜过滤，
６８１ 西北农林科技大学学报（自然科学版） 第４３卷
进行 ＨＰＬＣ分析。
（２）水解氨基酸供试品溶液。采用酸水解的方
法处理狗尾草种子样品，参考李玉玲等［４］在吹 Ｎ２
状态下封口的方法，本试验采用抽真空后充氮气，保
证氮气充满水解管，以防止氨基酸氧化的方法进行
试验。具体操作是，精密称取样品０．１ｇ，置于氨基
酸水解管中，加入６ｍｏｌ／Ｌ盐酸１０ｍＬ、体积分数
１％苯酚１ｍＬ，重复抽真空充氮气３次，置于１１０℃
烘箱中水解２４ｈ；水解后置于８０℃水浴挥发干，加
入２ｍＬ水，重复该操作２次，尽可能多地挥发掉盐
酸；加入２ｍＬ水，超声１ｍｉｎ使溶解并定容于１０
ｍＬ容量瓶中，吸取１ｍＬ提取液，加入衍生试剂 Ａ
和Ｂ各１ｍＬ，于５０℃水浴中保持４５ｍｉｎ，加入正己
烷１ｍＬ萃取，取下层溶液用０．４５μｍ滤膜过滤，进
行 ＨＰＬＣ分析。
１．３．４　色谱条件　色谱柱：Ｕｌｔｉｍａｔｅ　Ａｍｉｎｏ　Ａｃｉｄ
氨基酸色谱专用柱（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ，５μｍ），流
速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ，检测波长：２５４ｎｍ，柱温：３６℃，进
样量：１０μＬ。流动相梯度为：０ｍｉｎ，Ａ；１１ｍｉｎ，
６．５％Ｂ＋９３．５％Ａ；１３．９ｍｉｎ，１１％Ｂ＋８９％Ａ；１７
ｍｉｎ，１３．４％Ｂ＋８６．６％Ａ；２９ｍｉｎ，３０％Ｂ＋７０％Ａ；
３２ｍｉｎ，７０％Ｂ＋３０％Ａ；３５ｍｉｎ，Ｂ；４２ｍｉｎ，Ｂ；４５
ｍｉｎ，Ａ；６０ｍｉｎ，Ａ。
１．４　ＨＰＬＣ方法考察
１．４．１　线性关系考察　分别取氨基酸标准溶液
０．０１，０．０５，０．１０，０．５０，１．００ｍＬ，按１．３．３节方法衍
生后进行 ＨＰＬＣ。以各氨基酸峰面积为纵坐标（ｙ），
氨基酸浓度（μｍｏｌ／ｍＬ）为横坐标（ｘ），做线性回归。
１．４．２　精密度试验　取混合氨基酸标准溶液１
ｍＬ，按１．３．３节方法衍生后进行 ＨＰＬＣ分析，连续
进样５次，测定峰面积，考察方法的精密度。
１．４．３　稳定性试验　取１．３．３节供试品溶液１
ｍＬ，分别于０，１，２，４，６，８，１２ｈ进行ＨＰＬＣ分析，测
定峰面积，考察方法的稳定性。
１．４．４　重复性试验　取同一批狗尾草种子粉末，按
１．３．３节方法制备游离氨基酸和水解氨基酸的供试
品溶液并衍生化，进行 ＨＰＬＣ分析，平行测６次，测
定峰面积，并计算氨基酸含量，考察方法的重复性。
１．４．５　加标回收率试验　（１）游离氨基酸加样回收
率。精密称取已知氨基酸含量的狗尾草种子粉末
（与重复性试验同批次）０．２５ｇ，加入混合氨基酸标
准溶液１ｍＬ，按游离氨基酸检测方法分别提取、衍
生、进样，平行６次，计算各氨基酸的回收率。
（２）精密称取已知氨基酸含量的狗尾草种子粉
末０．０５ｇ，加入混合氨基酸标准溶液１ｍＬ，按水解
氨基酸检测方法分别提取、衍生、进样，平行６次，计
算各氨基酸的回收率。
１．５　氨基酸含量测定
取狗尾草种子样品，按本研究建立的 ＲＰ－
ＨＰＬＣ法分别测其游离氨基酸和水解氨基酸含量。
２　结果与分析
２．１　ＨＰＬＣ方法考察
２．１．１　线性关系　由表１可见，２１种氨基酸的检
测浓度在０．００１　９～２．７００　０μｍｏｌ／ｍＬ内与各自峰
面积呈良好的线性关系，相关系数Ｒ２ 均≥０．９９９　０。
表１　２１种氨基酸的线性回归方程
Ｔａｂｌｅ　１　Ｌｉｎｅａｒ　ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ　ｅｑｕａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　２１ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ
氨基酸种类
Ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ
线性回归方程
Ｌｉｎｅａｒ　ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ　ｅｑｕａｔｉｏｎ
相关系数
Ｒ２
天冬氨酸 Ａｓｐ ｙ＝１　４７１　８８４．６３ｘ＋３．１８　 ０．９９９　８
谷氨酸 Ｇｌｕ　 ｙ＝１　１５５　２１６ｘ－１２５　 ０．９９９　４
天冬酰胺 Ａｓｎ　 ｙ＝１　１１１　８００．７５ｘ－１１０．０３　 ０．９９９　６
丝氨酸Ｓｅｒ　 ｙ＝１　０２１　３２３．８１ｘ＋９８．５７　 ０．９９９　８
甘氨酸 Ｇｌｙ ｙ＝９６８　１９９ｘ＋１５１．６　 ０．９９９　６
谷氨酰胺 Ｇｌｎ　 ｙ＝１　００５　９００．１４ｘ－１７９．０２　 ０．９９９　０
组氨酸 Ｈｉｓ　 ｙ＝１　０１６　０８１．３５ｘ－７６．６０　 ０．９９９　１
苏氨酸＋脯氨酸＋丙氨酸 Ｔｈｒ＋Ｐｒｏ＋Ａｌａ　 ｙ＝１　２１２　５１２．４１ｘ－２１４．２１　 ０．９９９　７
精氨酸 Ａｒｇ ｙ＝１　２８４　３００．３２ｘ＋６２．０６　 ０．９９９　７
酪氨酸 Ｔｙｒ ｙ＝１　５７４　２５９．２６ｘ＋１９６．７６　 ０．９９９　８
缬氨酸 Ｖａｌ　 ｙ＝１　６１０　７３６．８８ｘ＋１９９．７９　 ０．９９９　７
胱氨酸Ｃｙｓ－Ｃｙｓ ｙ＝８７２　３７０．８５ｘ－５４．２０　 ０．９９９　５
甲硫氨酸 Ｍｅｔ　 ｙ＝１　４９２　５２７．０７ｘ－４３９．２２　 ０．９９９　８
半胱氨酸＋亮氨酸＋异亮氨酸Ｃｙｓ＋Ｌｅｕ＋Ｌｌｅ　 ｙ＝１　３３８　７３１．３４ｘ－４１８．７８　 ０．９９９　７
苯丙氨酸Ｐｈｅ　 ｙ＝１　４０４　２９０．１７ｘ－５３０．４９　 ０．９９９　８
色氨酸Ｔｒｐ ｙ＝２　１００　５３８．４６ｘ＋２９６．６２　 ０．９９９　８
赖氨酸Ｌｙｓ ｙ＝２　４８１　１４２．２１ｘ－４１６．２９　 ０．９９９　８
７８１第９期 赵　岩，等：柱前衍生ＲＰ－ＨＰＬＣ法测定狗尾草种子氨基酸含量
２．１．２　精密度　２１种氨基酸峰面积的相对标准偏
差（ＲＳＤ）在０．６１％～１．１２％（ｎ＝５），表明仪器精密
度良好。
２．１．３　稳定性　在０～１２ｈ，２１种氨基酸峰面积的
ＲＳＤ在０．６２％～２．２３％（ｎ＝９），表明供试品溶液在
１２ｈ内比较稳定。
２．１．４　重复性　２１种游离氨基酸相对含量的ＲＳＤ
在０．９１％～２．４１％（ｎ＝６），２１种水解氨基酸相对含
量的ＲＳＤ在０．８２％～２．３１％（ｎ＝６），表明本方法
重复性良好。
２．１．５　加样回收率　２１种游离氨基酸的平均回收
率在 ８７．５０％ ～１００．２０％，ＲＳＤ 在 ０．８２％ ～
２．４６％。２１ 种 水 解 氨 基 酸 的 平 均 回 收 率 在
９１．１０％～１００．２１％，ＲＳＤ在０．５２％～２．０８％。
２．２　狗尾草种子中的氨基酸含量
样品色谱图见图１。
图１　狗尾草种子中氨基酸含量测定的高效液相色谱
ａ．标准品；ｂ．游离氨基酸；ｃ．水解氨基酸；１．天冬氨酸；２．谷氨酸；３．天冬酰胺；４．丝氨酸；５．甘氨酸；６．谷氨酰胺；７．组氨酸；
８．苏氨酸＋脯氨酸＋丙氨酸；９．精氨酸；１０．酪氨酸；１１．缬氨酸；１２．胱氨酸；１３．甲硫氨酸；
１４．半胱氨酸＋亮氨酸＋异亮氨酸；１５．苯丙氨酸；１６．色氨酸；１７．赖氨酸
Ｆｉｇ．１　ＨＰＬＣ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍｓ　ｆｏｒ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ｉｎ　ｓｅｅｄｓ　ｏｆ　Ｓｅｔａｒｉａ　ｖｉｒｉｄｉｓ（Ｌ．）Ｂｅａｕｖ
ａ．Ｓｔａｎｄａｒｄ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ；ｂ．Ｆｒｅｅ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ；ｃ．Ｈｙｄｒｏｌｙｚｅｄ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ；１．Ａｓｐ；２．Ｇｌｕ；３．Ａｓｎ；４．Ｓｅｒ；５．Ｇｌｙ；６．Ｇｌｎ；７．Ｈｉｓ；
８．Ｔｈｒ＋Ｐｒｏ＋Ａｌａ；９．Ａｒｇ；１０．Ｔｙｒ；１１．Ｖａｌ；１２．Ｃｙｓ－Ｃｙｓ；１３．Ｍｅｔ；１４．Ｃｙｓ＋Ｌｅｕ＋Ｌｌｅ；１５．Ｐｈｅ；１６．Ｔｒｐ；１７．Ｌｙｓ
　　狗尾草种子中游离氨基酸总量可达到５．４％，
水解后的氨基酸总量可达到４５．７％。由表２可见，
狗尾草种子中游离氨基酸含测定的全部２１种氨基
酸，氨基酸的含量丰富而全面；含量最高的为天冬酰
胺（２　２６０．１８ ｍｇ／ｈｇ），其次是精氨酸 （６３６．６６
ｍｇ／ｈｇ），胱氨酸的含量最低（２０．７１ｍｇ／ｈｇ）。
２１种水解氨基酸含量明显比游离氨基酸含量
高，在水解氨基酸中，人体必需的氨基酸如色氨酸、
亮氨酸、赖氨酸、苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、苯丙氨
酸和甲硫氨酸均有，且与其他氨基酸相比，必需氨基
酸含量都相对较高，色氨酸含量最低为５６２．８４
ｍｇ／ｈｇ。水解氨基酸也含有半必需氨基酸精氨酸、
组氨酸，其中精氨酸含量较高，达６　７３１．４９ｍｇ／ｈｇ，
在细胞分裂、伤口复原、免疫功能、激素分泌等方面
均有重要作用［１１－１４］。谷氨酸在生物体内的蛋白质代
谢过程中占重要地位，参与动物、植物和微生物中的
许多重要化学反应，因其特殊作用，在医药、食品及
化工等行业有着广泛的应用，并参与氨的去毒作
用［１５－１６］。狗 尾 草 种 子 中 谷 氨 酸 含 量 很 高，达
５　６７７．４８ｍｇ／ｈｇ。蛋白质酸水解氨基酸是一种常用
的方法，多数氨基酸在酸性条件下较稳定。但在酸
水解过程中，色氨酸会被破坏，天冬酰胺和谷氨酰胺
也会脱酰胺基，因此水解后这３种氨基酸含量较低。
８８１ 西北农林科技大学学报（自然科学版） 第４３卷
表２　狗尾草种子中游离氨基酸和水解氨基酸的种类及含量
Ｔａｂｌｅ　２　Ｔｙｐｅｓ　ａｎｄ　ｃｏｎｔｅｎｔｓ　ｏｆ　ｆｒｅｅ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ　ａｎｄ　ｔｏｔａｌ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ　ｉｎ　ｓｅｅｄｓ　ｏｆ　Ｓｅｔａｒｉａ　ｖｉｒｉｄｉｓ（Ｌ．）Ｂｅａｕｖ．　　ｍｇ／ｈｇ
氨基酸种类
Ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ
游离氨基酸
Ｆｒｅｅ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ
水解氨基酸
Ｔｏｔａｌ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ
天冬氨酸 Ａｓｐ ６９．４３　 ４　０５７．００
谷氨酸 Ｇｌｕ　 ９４．２９　 ５　６７７．４８
天冬酰胺 Ａｓｎ　 ２　２６０．１８　 ４８．１４
丝氨酸Ｓｅｒ　 ２７５．０２　 ３　２０４．０５
甘氨酸 Ｇｌｙ ５１．０４　 ２　２１３．４１
谷氨酰胺 Ｇｌｎ　 １９５．７４　 ４２５．５０
组氨酸 Ｈｉｓ　 ４８．６４　 １　６６３．４１
苏氨酸＊＋脯氨酸＋丙氨酸 Ｔｈｒ＋Ｐｒｏ＋Ａｌａ　 ６１７．５６　 ４　６７６．１８
精氨酸 Ａｒｇ ６３６．６６　 ６　７３１．４９
酪氨酸 Ｔｙｒ　 １３１．４６　 １　３５６．００
缬氨酸＊ Ｖａｌ　 ２２４．００　 ２　０２４．９８
胱氨酸Ｃｙｓ－Ｃｙｓ　 ２０．７１　 １　９９１．５５
甲硫氨酸＊ Ｍｅｔ　 ２４７．７９　 ２　０２４．１８
半胱氨酸＋亮氨酸＊＋异亮氨酸＊ Ｃｙｓ＋Ｌｅｕ＋Ｌｌｅ　 １１２．１１　 ４　２６８．３３
苯丙氨酸＊Ｐｈｅ　 １５８．２５　 ３　２３７．３５
色氨酸＊ Ｔｒｐ １２５．７８　 ５６２．８４
赖氨酸＊ Ｌｙｓ １２０．３４　 １　５５７．９３
　　注：＊代表必需氨基酸。
Ｎｏｔｅ：＊ｉｎｄｉｃａｔｅｓ　ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ．
３　讨　论
本研究在预试验中，对不同浓度盐酸进行了考
察，发现当盐酸浓度较低时，有利于色氨酸、天冬酰
胺、谷氨酰胺水解及检测，但整体水解效果不佳；当
盐酸浓度为６ｍｏｌ／Ｌ时，除色氨酸、天冬酰胺和谷氨
酰胺３种氨基酸外，其余氨基酸水解效果最佳，因此
本试验采用６ｍｏｌ／Ｌ盐酸水解氨基酸。在以往的研
究中，水解氨基酸时未对色氨酸、天冬酰胺和谷氨酰
胺进行测定［１７－１９］，本试验对这３种氨基酸也进行了
检测，但水解后的含量不能准确测定，因此若要检测
此３种水解氨基酸含量应采用其他水解方法。
本试验建立了一种利用反相高效液相色谱测定
狗尾草种子中游离氨基酸和水解氨基酸含量的方
法。该方法稳定、快速、精密度高、线性范围宽，适用
于狗尾草种子中游离氨基酸和水解氨基酸含量的测
定。本试验结果表明，狗尾草种子中含有所有人体
必需的氨基酸，游离氨基酸总量可达到５．４％，水解
后的氨基酸总量可达到４５．７％，可见狗尾草种子中
氨基酸的资源极其丰富，是一种可以充分利用的资
源，有着很好的实际利用价值和广阔的开发前景。
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０９１ 西北农林科技大学学报（自然科学版） 第４３卷