全 文 ：假臭草 DNA提取及 RAPD反应体系的优化①
李传军 1,2)②杨礼富 1) 王孝钢 3)
袁 坤 1) 陈秋波 1) 易晓洁 1) 王真辉 1)③
(1 中国热带农业科学院橡胶研究所/农业部橡胶树生物学重点开放实验室
海南儋州 571737；
2 海南大学环境与植物保护学院 海南儋州 571737；
3 农业部农产品质量安全监督检验测试中心(青岛) 山东青岛 266109)
摘 要 以假臭草叶片为材料， 对影响其随机扩增多态 DNA(RAPD)反应的各因素进行优化， 建立了假臭草 RAPD
的优化反应体系和程序， 即在 10μL反应体系中， 5ng(/10μL)模板DNA， 1.0μmol/L随机引物F15， 150μmol/L
dNTPs， 2.0mmol/LMg2+， 1.0UTaqDNA聚合酶； 扩增程序为 95℃预变性 4min， 95℃变性 40s， 36℃退火 40s，
72℃延伸 1min， 10个循环， 后 94℃变性 30s， 35℃退火 30s， 72℃延伸 1min， 35个循环， 72℃延伸 5min，
4℃保温。
关键词 假臭草 ； DNA提取 ； RAPD； 体系优化
分类号 S451
DNA Extraction and Optimization of RAPD Reaction System
for Praxelis clematidea
LI Chuanjun1,2) YANG Lifu1) WANG Xiaogang3)
YUAN Kun1) CHEN Qiubo1) YI Xiaojie1) WANG Zhenhui1)
(1 Rubber Research Institute / Ministry of Agriculture Key Laboratory of Rubber Biology,
CATAS, Danzhou, Hainan 571737
2 Environment and Plant Protection Department of Hainan University, Danzhou, Hainan 571737
3 Ministry of Agriculture Centre of Inspection and Testing for Agricultural Products,
Qingdao, Shandong 266109)
Abstract The ge nomic DNA of Praxelis clematidea was employed to establish optimization of
RAPD. The RAPD system for Praxelis clematidea was optimized including program, template,
primer, dNTPs, Taq polymerase and Mg2+. Through ladder experiments, the reliable RAPD analysis
system was established. The total reaction volume was 10 μL and reaction mixture consisted of
template DNA, dNTPs, Mg2+, random primer and Taq DNA polymerase. RAPD program was 4 min
at 95℃ for predenaturation, then 10 cycles of 40 s at 94℃ for denaturation, of 40 s at 36℃ for
annealing, of 1 min at 72℃ for extension; then 35 cycles of 30 s at 94℃ for denaturation, of 30 s at
35℃ for annealing, of 1 min at 72℃ for extension, finally extension at 72℃ for 5 min.
Keywords Praxelis clematidea ; genomic DNA extraction ; RAPD ; optimization
① 基金项目： 国家自然科学基金项目(No.30960088)。
收稿日期： 2010-03-16。 责任编辑/乐长灯； 编辑部 E-mail: rdnk@163.com。
② 李传军(1985～)， 男， 河南信阳人， 理学硕士。 E-mail: 172823824@qq.com。
③ 通讯作者。 E-mail: wzh-36@163.com。
Vol．30, No．5
2010年5月 热 带 农 业 科 学
CHINESE JOURNAL OF TROPICAL AGRICULTURE
第30卷第5期
May． 2010
21- -
2010年5月 第30卷第5期热带农业科学
植物外来种入侵已经严重威胁到全球的生态环
境、 生物多样性和经济发展， 我国的外来植物入侵
问题也日益严重[1,2]。 对外来植物入侵的研究， 已
经成为生物多样性保护和生态系统恢复研究领域的
一个热点问题[3]。
假臭草(Praxelis clematidea)原产地为南
美。 上个世纪 90年代， 假臭草最初在深圳
出现[4]， 现已广泛分布于广东、 福建、 澳门、
台湾等地； 2004年， 海南首次记录假臭草[5]，
但之前可能已经在海南生长并开始蔓延。 假
臭草对土壤养分的吸收力较强， 易于消耗土
壤肥力， 对土壤的可耕性破坏极为严重， 它
还能分泌一种有毒且具恶臭的物质， 影响家
畜觅食， 不仅对其入侵地区生物在经济上造
成损失， 更为严重的是对当地生态系统生物
多样性存在巨大的潜在威胁， 因而已成为华
南地区危害最为严重的恶性杂草之一。
入侵植物由于入侵地资源与环境因子的差异造
成表型差异(表型可塑性)[6]， 其变化过程迅速而又复
杂。 关于入侵种适应性进化的遗传学基础研究， 对
于认识外来入侵种的适应性机制有重要意义[7,8]，
但目前对于假臭草的相关分析研究基本没有。 本研
究以采自海南不同地区的假臭草为材料， 采用随机
扩增多态性DNA(RAPD)技术， 来明确海南不同地区
假臭草的遗传多样性， 了解其杂草特性与遗传变异
之间的对应关系， 以及环境因素对假臭草的遗传多
样性的影响， 为进一步分析其进化潜力和重点预防
及消除危害提供重要资料。 由于 RAPD分子标记技
术采用的引物较短(通常为 10bp)， 退火温度低， 导
致其对反应条件很敏感， 稳定性和重复性差， 因此
必须建立一个稳定的、 最佳的反应体系来克服这一
缺点， 为此， 我们就 RAPD反应中的模板 DNA， 引
物浓度， 镁离子浓度， Taq聚合酶用量等因素和扩
增程序进行了优化[9,10]。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
假臭草样品采集于海南省17个不同市县(三亚、
五指山、 琼海、 儋州、 文昌、 万宁、 东方、 定安、 屯昌、 澄迈、 临
高、 白沙、 昌江、 乐东、 陵水、 保亭和琼中)生长多年的假臭
草单一群落(见表1)， 采集假臭草新鲜叶片放入封口
袋中， 加入1∶20(W/W)的变性硅胶快速干燥[11,12]，
按地区的不同分为 1到 17号样品， 转至 -80℃冰
箱保存。
1. 2 DNA的提取
基因组 DNA的提取， 采用 CTAB法[13～15]， 将叶
片用液氮研磨成细粉， 加入预热至65℃的CTAB提
取液(100 mmol/L tris-HCl pH8.0， 1.4 mmol/LNa-
Cl， 20mmol/LEDTA， 2%C B， 0.1%～0.2%β-巯基
乙醇， 2% PVP)， 65℃水浴 50min， 每间隔 10min
轻轻颠倒1次， 冷却至常温， 加入等体积的氯仿:
异戊醇(24∶1)12000rpm离心 15min， 取上清液，
重复上述操作 1次， 加入等体积冷异丙醇， 放置
20分钟 ， 12000rpm离心 15 min， 取出沉淀物 ，
75%冰乙醇洗涤 2次， 干燥， 溶解于适量 TE溶液
中， 加入1μLRNaseA， -20℃下保存。
1. 3 实验药品及仪器
随机引物F15(CCAgTACTCC)购自上海生工生物
工程技术服务有限公司。 Taq DNA聚合酶购自北京
华美生物公司， 100 bp DNA ladder Marker购自北
京天为时代科技有限公司， dNTPs购自宝生物工程
有限公司 。 PCR在 Biometra T1 Thermocyder PCR
仪上进行。
1. 4 反应程序及反应条件
RAPD反应体系及扩增条件： 反应总体积为10μL，
模板 DNA为 10ng， 引物为 0.8μmol/L， dNTPs为
150μmol/L， Mg2+为2.0mmol/L， Taq聚合酶为0.5U，
10×buffer为1μL， 以双蒸馏水补充至 10μL， 离
心数秒。 以提取的4号假臭草样品DNA为模板， 用
表 1 样品采集地点
编号 地点 编号 地点 经纬度
1 三亚 E109.46/N18.28 10澄迈 E 10.00/N19.75
2 五指山 E109.51/N18.77 11临高 E 09.69/N19.91
3 琼海 E110.46/N19.25 12白沙 E 09.44/N19.23
4 儋州 E109.57/N19.52 13昌江 E 09.03/N19.25
5 文昌 E110.72/N19.61 14乐东 E 09.17/N18.73
6 万宁 E110.39/N18.80 15陵水 E 10.02/N18.48
7 东方 E108.64/N19.09 16保亭 E 09.70/N18.64
8 定安 E110.31/N19.68 17琼中 E 09.83/N19.05
9 屯昌 E110.10/N19.36
经纬度
22- -
李传军 等 假臭草DNA提取及 RAPD反应体系的优化
表 3 引物浓度和 dNTPs 浓度组合
编号
引物/
（μmol·L-1） 编号
引物/
（μmol·L-1）
dNTPs/
（μmol·L-1）
1 0.6 9 1.0 100
2 0.6 10 1.0 150
3 0.6 11 1.0 200
4 0.6 12 1.0 250
5 0.8 13 1.2 100
6 0.8 14 1.2 150
7 0.8 15 1.2 200
8 0.8 16 1.2 250
dNTPs/
（μmol·L-1）
100
150
200
250
100
150
200
250
已筛选的 F15随机引物进行扩增。 对影响扩增结果
的模板浓度、 镁离子浓度、Taq酶、 引物浓度和dNTPs
浓度等主要因子进行研究， 筛选最优条件， 以获得最
优化、 最稳定的反应体系。 根据安泽伟等的报告， 本
研究的PCR反应程序为： 95℃预变性4min， 95℃变
性40s， 36℃退火40s， 72℃延伸1min， 10个循环，
后 94℃变性 30s， 35℃退火 30s， 72℃延伸1min，
35个循环， 72℃延伸5min， 4℃保温[16]。
PCR扩增产物在 1.5%琼脂糖凝胶上100V稳压
进行电泳， 电泳缓冲液用 1×TAE， 最后在 UVI凝
胶成像系统上拍照， 进行分析。
2 结果
2. 1 假臭草叶片基因组 DNA 的质量
按方法所述对假臭草 17个样品叶片 DNA进行
抽提， 经 1.0%琼脂糖凝胶电泳， 凝胶成像仪中分
析结果见图1。 结果显示， 假臭草DNA分子量约为
20kb， 确定为基因组 DNA， 提取的 DNA只有 1条
带， 说明其具有良好的完整性， 经紫外分光光度计
检测， 其 OD260/280的值在 1.8左右， 可用作 RAPD
的模板。
2. 2 Mg2+与模板 DNA浓度对扩增效果的影响
选4号假臭草样品DNA为模板， 模板DNA分别
取 5、 10、 15 ng， Mg2+的终浓度设置 4个梯度 ：
1.5、 2.0、 2.5、 3.0mmol/L， (组合见表2)。
从图2扩增结果可以明显看到 Mg2+浓度对 PCR
扩增的效果影响比较大， 在 1.5～2.0mmol/L时，
电泳效果比较清晰， 条带容易辨认； 而模板DNA在
大于10ng时， 对PCR反应的效果影响都不大， 但
浓度过少时， 条带会缺失。 因此图2中第4泳道为
最佳组合， 选择 DNA最佳浓度为 5ng， Mg2+最佳浓
度为2.0mmol/L。
2. 3 引物浓度和 dNTPs浓度对扩增效果的影响
引物浓度从 0.6～1.2μmol/L设置 4个浓度，
分别为 0.6、 0.8、 1.0和 1.2μmol/L； dNTPs从
100～250μmol/L设置 4个浓度 ， 分别为 0.1、
0.15、 0.2和 0.25mmol/L， 从 16个组合中选择出
最佳组合(表3)。
通过对引物和 dNTPs二因素 16水平试验， 结
果如图 3所示， 引物浓度在 1.0μmol/L时效果最
好， 条带亮而清晰， dNTPs浓度在150～200μmol/L
之间效果较好， 尤其是 150μmol/L时带最清晰，
图 3中以第 10泳道为最好 ， 引物浓度为 1.0
μmol/L， dNTPs浓度为150μmol/L。
2. 4 Taq聚合酶对扩增效果的影响
以 4号、 7号、 10号假臭草样品 DNA为模板，
Taq酶浓度设置 5个浓度： 0.5、 1.0、 1.5、 2.0和
图 1 假臭草样品 DNA质量图谱
( 1- 17泳道排序见表1， M为 mar ker )
图 2 Mg2+和 DNA浓度
(样品为 4号假臭草， 1- 12泳道排序见表 2， M为 mar ker )
表 2 Mg2+和 DNA浓度组合
编号
Mg2+/
(mmol·L-1) 编号
Mg2+/
(mmol·L-1)
模板
DNA/ng
1 1.5 7 2.5 5
2 1.5 8 2.5 10
3 1.5 9 2.5 15
4 2.0 10 3.0 5
5 2.0 11 3.0 10
6 2.0 12 3.0 15
模板
DNA/ng
5
10
15
5
10
15
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2010年5月 第30卷第5期热带农业科学
2.5U， 组成15个组合， 用随机引物F15进行扩增。
RAPD在 5个Taq酶浓度下反应的电泳结果见图 4，
泳道 1～5、 6～10和 11～15分别为 3种假臭草样
品DNA模板在5个Taq酶浓度下扩增的结果。 由图
4可看出， 当聚合酶浓度在0.5～1.5U时， 条带比
较清楚(图 4第 1～3， 6～8， 11～13泳道)， 浓度在 1.5U
以后的带变得模糊(图 4第4～5， 9～10， 14～15)， 其中
泳道2、 7、 12条带即背景都很清晰， 所用Taq酶浓
度均为1.0U， 所以选择最佳的Taq酶浓度为1.0U。
2. 5 RAPD反应体系检测
综合上述实验结果， 可以得出假臭草RAPD反应
的最佳体系为： 10μL体系中， 模板DNA为5ng/10μL，
引物为 1.0μmol/L， dNTPs为 150μmol/L， Mg2+为
2.0mmol/L， Taq 聚合酶为1.0U， 用灭菌后的超纯
水补足至10μL。
利用已优化好的反应条件对海南省 17个不同
市县采集的假臭草样品， 选用 F15引物在 Biome-
tra T1 Thermocyder PCR仪上通过同一程序对 17
种 DNA模板进行扩增， 扩增结果(见图 5)除 2、 7
泳道外， 其余泳道所产生的 RAPD带谱清晰， 反应
体系稳定， 可靠性高， 并且有较好的重复性， 确立
的体系可用于假臭草遗传多样性的分析与研究。
3 讨论
RAPD扩增易受多种因素的影响， 如模板 DNA、
Taq酶、 dNTPs、 Mg2+以及引物等， 扩增条件的变化
会对RAPD图谱产生较大的影响， 从而影响RAPD分
析的准确性和稳定性， 因此， 为了获得重复性和可
靠性高的RAPD图谱， 对假臭草RAPD-PCR进行引物
的筛选、 PCR扩增条件的优化及不同引物的退火温
度的确定十分必要。
国内外很多有关 RAPD-PCR反应条件的优化研
究， 采用的是单因子试验的方法， 过程繁琐且不能
兼顾各因子之间的相互作用[17,18]， 本实验通过对影
响假臭草 RAPD-PCR各反应的因子进行优化试验，
得到了假臭草遗传多样性RAPD最佳反应体系。
RAPD扩增中最主要的制约因素是 Taq DNA聚
合酶活性， Taq酶是 Mg2+离子依赖性酶[19]， Mg2+浓
度的高低直接影响 Taq酶活性； Mg2+浓度过高， 会
抑制Taq酶活性， 使酶催化非特异性扩增， 浓度过
低会降低Taq聚合酶的活性， 使反应产物减少， 达
不到最佳扩增效果； 另外， Mg2+还能跟反应液中的
模板 DNA及引物结合， 影响引物与模板的结合效
率， 模板与产物的解链温度以及产物的特异性和引
物二聚体的形成[20]。 不同引物和模板的最适Mg2+浓
度都不同， 对于假臭草 RAPD反应体系 Mg2+浓度在
1.5～2.0mmol/L这一范围扩增效果比较好。 DNA模
板量对PCR扩增并没有很明显的影响， 在5～15ng
都可以扩增出条带。 完整、 高质量的DNA是获得重
复性好、 准确可靠的RAPD-PCR结果的保证。
RAPD反应体系中引物浓度对扩增结果影响较
大， 引物浓度过高会使非特异性谱带增加， 过低则
扩增谱带明显减少[21,22]， 最终选定随机引物浓度为
1.0μmol/L。 由于RAPD所用的引物为10碱基的单链
随机引物， 经过多次冻融会有部分降解， 所以实际使
用过程中还应做适当增减， 以达到最佳扩增效果。
图 3 引物浓度和 dNTPs 浓度
(样品为 4号假臭草， 1- 16泳道排序见表 3， M为mar ker )
图 4 Taq聚合酶浓度
(1～5泳道为 4号假臭草， Taq酶浓度依次为 0.5U、1.0U、1.5U、
2.0U、2.5U， 6～10为 7号假臭草， Taq酶浓度依次为 0.5U、1.0U、
1.5U、2.0U、2.5U， 11～15为10号假臭草， Taq酶浓度依次为 0.5U、
1.0U、1.5U、2.0U、2.5U， M为marker)
图 5 用优化体系对不同样品进行的 PCR扩增
( 1～17按采样地点排列见表 1)
24- -
李传军 等 假臭草DNA提取及 RAPD反应体系的优化
dNTPs是RAPD扩增反应的基本原料[23]， dNTPs
的浓度过高， 会导致PCR错配， 从而使扩增出现非
特异性扩增， 浓度过低， 又会影响合成效率， 甚至
会因过早的消耗而使产物单链化， 影响扩增效果。
在一般的PCR反应中， 浓度在100～250μmol/L的范
围比较合适。 本实验推荐dNTPs浓度为150μmol/L
为佳。
Taq酶的种类以及使用数量直接影响扩增反应
的成功与否， 使用高浓度的 Taq酶不仅提高了成
本， 而且容易产生非特异条带， 而当Taq酶的浓度
过低时， 则会导致产物合成效率下降。 本实验中最
佳的Taq酶浓度为1.0 U。
不同的退火温度对不同物种 RAPD-PCR反应效
果有影响， 但实验没有对其进行优化， 虽是实验的
不足之处， 但根据经验得到 RAPD-PCR的反应退火
温度在 32～38℃范围内， 反应结果都比较好， 能
够满足RAPD分析的条件。
通过本实验初步建立 RAPD反应优化体系， 并
在此基础上不断完善、 改进， 完全可以用于海南省
甚至华南地区假臭草亲缘关系及其遗传多样性研究。
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