全 文 ：2010年 10月
第 31卷第 10期 食品研究与开发
根据荔枝酒中几种有机酸（苹果酸、α-酮戊二酸、
乳酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸）的含量，添加一定量的标
准有机酸，按样品处理方法处理进样，同时做空白试验。
根据回收率＝测定值-本底值
加标值
×100 %计算，结果表明 6
种有机酸的回收率在 93.64 %~101.80 %之间 ,说明
该方法准确度良好(见表 5)。
3 结论
本试验建立了一种反相高效液相色谱法同时测
定 9种有机酸。方法选择磷酸二氢铵为流动相，磷酸调
节 pH值为 2.7, 流速 1.0 mL/min,检测波长为 210 nm，
柱温 30℃。在此条件下，被测组分色谱峰保留时间短，
可以在 9 min内完成一个样品的测定。9种有机酸的分
离度良好，样品处理简单，有较高的实际应用价值，可
推广使用。本试验结果表明，采用 HPLC法同时测定荔
枝酒中苹果酸、α-酮戊二酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、琥珀
酸的含量，其方法的 RSD为 0.25 %~1.21 %，回收率为
93.64 %～101.80 %，说明测定方法的重现性和准确度
较好。荔枝酒中有机酸含量在 309 mg/L~3 299 mg/L之
间，不同荔枝酒中的有机酸组成和量比关系存在差异，
这就形成不同荔枝酒独特的风味。
参考文献：
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收稿日期：2009-11-24
表 5 回收率试验结果(n=3)
Table 5 The result of recovery
有机酸
苹果酸
α-酮戊二酸
乳酸
乙酸
柠檬酸
琥珀酸
本底值/(mg/L)
2 396
319
347
872
653
776
加标值/(mg/L)
2 500
200
400
800
600
700
实测值/(mg/L)
4 905
506
754
1683
1232
1468
回收率/%
100.30
93.64
101.80
101.19
96.56
98.79
RSD/%
1.49
4.20
4.05
2.12
2.15
4.45
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
薄层色谱法分离鉴定雪莲果叶中的绿原酸
陈红惠 1，徐保立 2，彭光华 3,*
（1.文山学院生化系，云南文山 663000；2.华中农业大学食品科技学院，湖北武汉 430070；3.西藏自治区质量技
术监督局，西藏拉萨 540000）
摘 要:建立薄层色谱法分离鉴定雪莲果叶中绿原酸的方法，以斑点分离情况、清晰度、有无拖尾现象等方面综合评
价展开效果。确定以乙酸乙酯-水-甲酸-甲苯（85∶10∶10∶4）为展开剂，显色剂为 2 %FeCl3-1 %K3Fe(CN)6，方法简单、快
速、成本低，分离效果理想，结果满意。
关键词:雪莲果叶；绿原酸；薄层色谱
Isolation and Identification of Chlorogenic Acid in Yacon Leaves by Thin-Layer Chromatography
CHEN Hong-hui1，XU Bao-li2，PENG Guang-hua3,*
（1． Bio－chemistry Department，Wen Shan University，Wenshan 663000，Yunnan, China；2． Collegy of Food Science and
Technology，Huazhong Agricultural University，Wuhan 430070, Hubei, China；3． Bureau of Quality and Technique
Supervision of Tibet Autonomous Region，Lhasa 540000, Tibet, China）
作者简介：陈红惠（1979-），女（汉），讲师，硕士研究生，主要从事食品的分析、开发。
*通信作者：彭光华，副教授，博士，主要从事天然产物化学的研究。
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雪莲果（Smallanthus sonchifolius，俗名 yacon）又称
雪莲薯、亚龙果、亚贡，为菊科多年生草本植物，原产于
南美洲安第斯山脉[1]。雪莲果叶中含有大量的酚酸，主
要是绿原酸、咖啡酸和阿魏酸[2]。绿原酸是一种有效的
酚型抗氧化剂，具有比抗坏血酸、咖啡酸和生育酚更强
的自由基清除效果，绿原酸和异绿原酸对多种致病菌
和病毒有较强的抑制和杀灭作用，此外还有抗肿瘤、降
血脂、降血压等药理作用[3-4]。绿原酸在植物界广泛存
在，但含量较高的植物不多。据研究表明[5]，酚酸在雪
莲果叶中含量超过 3.6 %，但对于其中绿原酸含量和
分离测定国内少见报道，雪莲果叶中含有的大量活性
成分，已经在国内外引起相当关注，对于叶中酚酸成分
鉴定和分离是实现其开发利用的基础。目前绿原酸的
分离鉴定方法主要有紫外分光光度法，薄层层析法，高
效液相色谱法和高效毛细管法等[6]。为寻求一种快速
分析鉴定绿原酸的方法，根据 TLC操作简单易行，成
本低，快速，分离效果明显的特点，采用薄层色谱法对
雪莲果叶中绿原酸进行分析，确定了适用于绿原酸分
离的条件，为雪莲果叶酚酸的开发利用提供技术基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
雪莲果叶由云南陆良雪莲果种植基地提供。
绿原酸标准品：中国药品生物制品检定所；硅胶
G，正丁醇，乙酸，正己烷，乙酸乙酯，甲酸，甲醇，甲苯，
FeCl3，K3Fe(CN)6均为国产分析纯。
1.2 主要仪器
层析缸（23 cm×7 cm×22 cm）：华中农业大学食品
科技学院食品化学教研室制；薄层层析板（20cm×10 cm）：
华中农业大学食品科技学院食品化学教研室制；EYELA
N-1000型旋转蒸发仪：日本东京理化；101-3型电热
恒温干燥箱：广东全科化玻仪器有限公司；涂布器：西
德制造；微量注射器。
1.3 方法
1.3.1 样品液及对照品溶液的制备
称取一定量的雪莲果干叶粉碎过筛,置于磨口三
颈烧瓶中，加入石油醚 200 mL,室温下提取 20 min,抽
滤弃去石油醚，除去其中的脂类成分,重复 1次。置通
风橱中室温风干，然后用 30 %乙醇溶液，在 95 ℃预处
理 15min，料液比为 1∶40（g/mL），70℃下提取 2次，每次
1 h，真空浓缩后用乙酸乙酯萃取，合并酯相，真空浓缩
至干，用甲醇溶解定容，得到供薄层层析用的样品液。
称取绿原酸对照品 1.0 mg，用甲醇溶解并定容至
10 mL，得到含绿原酸 0.1 mg/mL的绿原酸对照品贮备
溶液，避光保存于 4℃冰箱中。
1.3.2 薄层色谱方法
称取一定量的硅胶 G，加入 3倍于硅胶 G质量的
水于研钵中调匀，涂布在洁净玻璃板上，自然干燥后
在 110℃下活化 1 h，贮于干燥器中备用。将配置好的
展开剂倒入层析缸中，盖好，充分振荡使溶剂蒸汽饱和
充满于层析缸内，用微量注射器将样品液和对照液分
别点样在薄层板上，置于层析缸中上行展开，待展开剂
前沿达到薄层板上边沿约 12 cm时取出薄层板，自然
挥干表面溶剂，用显色剂进行喷雾显色，观察出现的蓝
色斑点并进行测量和计算斑点的 Rf值，用于定性分析。
2 结果与分析
2.1 展开剂的选择[7-9]
2.1.1 不同展开体系对展开效果的影响
绿原酸易溶于水、含水乙醇、甲醇，微溶于乙酸乙
酯，极性较大，选择合适的展开剂是薄层色谱分离成功
的关键，要求展开体系要有适当的强度和组成。一般
较少使用单一溶剂分离较复杂的混合物，可以使用多
元溶剂体系。选择展开剂时应考虑合适的极性大小，
对分离物质应有一定的溶解度及解吸力，极性较大的
溶剂可加快化合物在薄层上的移动，极性较小的溶剂
则降低溶剂的洗脱能力，使其 Rf值降低，中等极性的
溶剂使极性相关较大的溶剂混合均匀。根据上述原则
和相关文献，选择了 5种不同展开体系进行对比，分离
结果见表 1和图 1、图 2、图 3。
由图 1可看出，展开体系Ⅱ中被分离物质全部移
动到溶剂前缘，表明展开体系极性过大；图 2中样品在
Abstract: In the method of separation of chlorogenic acid in Yacon leaves by thin-layer chromatography, the
result was evaluated by isolation of spot, clatiry, whether trailing etc. After the experiments of various ascending
elusions, chlorogenic acid was developed by ethyl acetate-water-formic acid-toluene(85∶10∶10∶4), visualized by
2 % FeCl3-1 % K3Fe （CN）6. By using the mobile phase, chlorogenic acid was separated satisfactorily, the spots
were separated clearly and without trailing.
Key words: Yacon leaves；chlorogenic acid；thin-layer chromatography
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表 1 各展开体系对雪莲果叶中绿原酸的分离结果
Table 1 The separate result of different extending system on
chlorogenic acid in Yacon leaves
展开体系
Ⅰ甲苯∶甲醇∶乙酸 =1.5∶0.5∶1（体积比）
Ⅱ甲酸∶乙酸=4∶0.2（体积比）
Ⅲ乙酸乙酯∶水∶甲酸 =85∶1:8（体积比）
Ⅳ正丁醇∶乙酸∶水=4∶1.5∶5（体积比）
Ⅴ正己烷∶乙酸乙酯∶水=20∶19∶1（体积比）
分离效果
分离效果很差，成一直线，对照品斑点拖尾严重
样品和对照品全都移动到溶剂前沿，无分离
样品出现分离，各点间拖尾略长
展开速度很慢，分离出的点距离很近，效果差
样品和对照品均未展开，停留在原点处，无分离
图 1 甲酸-乙酸=4∶0.2展开效果
Fig.1 The result presented by using formic acid-acetic acid
图 2 正己烷-乙酸乙酯-水=20∶19∶1展开效果
Fig.2 The result presented by using n-hexane-ethyl acetate-
water
图 3 乙酸乙酯-水-甲酸=85∶1∶8展开效果
Fig.3 The result presented by using ethyl acetate-water-formic
acid
展开体系Ⅴ下没有展开，停留在原点，表明展开体系
极性过小，无法对物质进行分离，这两种体系分离效
果最差。体系Ⅲ和Ⅳ均能将样品分离，但体系Ⅲ分离
效果相对较好，对照品 Rf值在 0.2~0.8范围内，斑点清
晰，虽然分离出来的点出现拖尾，可以通过调整展开
剂中水和酸的含量进行调节，综合以上情况，选择用
乙酸乙酯、水、甲酸三元溶剂作为分离绿原酸的展开剂。
2.1.2 展开剂含水量对展开效果的影响
设定乙酸乙酯和甲酸的量不变，通过改变展开剂
中含水量的比例来观察其对展开效果的影响。展开剂
中含水量对展开效果的影响见表 2所示。
试验发现随着水的含量的增加，分离的点逐渐清
晰，拖尾有所减少，Rf值增加，但含水量较高时，分离
效果变差，单一通过改变水的含量并不能得到良好的
分离效果，拖尾严重，乙酸乙酯与水的体积比为 85∶10
时能出现相对较好的分离，可进一步通过改变酸的含
量来减少拖尾情况。
2.1.3 酸对展开效果的影响
由于绿原酸分子中含有酚羟基，增加展开剂的酸
性更加有利于抑制拖尾，改善分离效果。选择甲酸调
表 2 含水量对展开效果的影响
Table 2 The effect of water content on result presented
乙酸乙酯-水-甲酸比例（体积比）
85∶2∶8
85∶4∶8
85∶6∶8
85∶8∶8
85∶10∶8
85∶12∶8
Rf值
0.624
0.642
0.708
0.732
0.755
-
分离效果
拖尾短些，但仍不清晰
分离处清晰几个点，但对照品拖尾长
分离出的点拖尾减少
有所改善，分离出几点
出现较好的点分离，有拖尾
分离较模糊，拖尾长
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图 5 展开结果 2
（V 乙酸乙酯∶V 水∶V 甲酸=85∶10∶12）
Fig.5 The result presented 2
图 4 展开结果 1
（V 乙酸乙酯∶V 水∶V 甲酸=85∶10∶1）
Fig.4 The result presented 1
节酸度，通过增加不同甲酸的含量来研究酸对展开效
果的影响，得到适合雪莲果叶中绿原酸的展开剂，试验
结果见图 4、图 5。
由图 4可看出，甲酸的量加入较少，这时展开剂
的极性过大，致使样品很难展开，效果更差；然后不断
增加甲酸的量，样品出现良好的分离效果，斑点的拖尾
达到最好的抑制情况，当 V 乙酸乙酯∶V水∶V甲酸=85∶10∶
12时，由图 5可以看出，酸的含量比例过高，却相反的
影响分离效果，可能是由于改变了展开剂的极性大小，
使分离物质展开速度过快，造成一定拖尾而未能分离，
通过多次反复校验三者的比例，发现乙酸乙酯∶水∶甲
酸=85∶10∶10（体积比）能分离出较为明显的几个点，然
后将绿原酸对照品点样于薄层板上，对照品展开的点
略有拖尾，故调整展开剂，往其中加入适量甲苯，当
V 乙酸乙酯∶V 水∶V 甲酸∶V 甲苯=85∶10∶10∶4时，发现绿原酸对照
品和样品分离的斑点拖尾有很大抑制，能达到较好的
分离。
2.2 显色剂条件的确定
2.2.1 显色剂的选择
根据参考文献和绿原酸分子结构特性，选用 FeCl3
液与 K3Fe(CN)6液混合作为显色剂，为达到最好显色效
果，确定二者混合比例，进行了以下摸索试验，确定了
2 %的 FeCl3与 1 %的 K3Fe(CN)6的混合比例为 4∶1时，
显色效果最好。
2.2.2 显色时间
由于使用的是混合显色剂，2 %的 FeCl3与 1 %的
K3Fe(CN)6溶液应分别预先配置，避光保存。对比分别
用新混合的显色剂、混合后放置 1、2 d的显色剂进行
显色效果比较，新混合的显色剂显色效果好，混合时间
过长，会严重影响显色效果。
用显色剂喷雾后，一般放置 3 min~4 min后就可
以观察到斑点位置及分离效果，显色时间过长，相反薄
层板颜色变深，影响对分离结果的判断。
2.2.3 显色温度
在常温条件下进行显色就能得到很好的显色效
果，不需要进行加热处理，显色温度过高，相反会使薄
层板变色。因此，一般选择室温为宜，在此情况下，显色
时间不易超过 5 min。
2.3 雪莲果叶中绿原酸的分离鉴定
将雪莲果叶酚酸提取物样品与绿原酸对照品分
别点样在同一薄层板上，放置于乙酸乙酯∶水∶甲酸∶甲
表 3 显色剂的配比试验
Table 3 The experiment of different chromogenic reagent mixed
ratio
2 %FeCl3与 1 %K3Fe(CN)6混合比例
4∶0.5
4∶1
4∶2
4∶4
显色效果
颜色太浅，斑点不明显
颜色适合，斑点明显
颜色太深，薄层板上的斑点难以分辨
颜色更深，斑点无法分辨
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图 7 纯化雪莲果叶酚酸薄层层析图
Fig.7 The thin-layer chromatography of purified phenolic acid
on Yacon leaves
图 6 雪莲果叶酚酸薄层层析图
Fig.6 The thin-layer chromatography of phenolic acid on Yacon
leaves
a为样品;b为对照品
a为纯化样品;b为对照品
苯=85∶10∶10∶4的已充分饱和的展开剂中，用上行展开
法进行展开，展开至 12 cm时取出，挥干薄层板上的溶
剂后进行喷雾显色，薄层层析谱图见图 6。将经过树脂
X-5吸附纯化和溶剂乙酸乙酯处理过的纯化样品与绿
原酸对照品进行点样并按上述方法展开，薄层层析结
果见图 7。
由图 6可看出，样品通过 TLC法分离得到 4个
点，分离效果良好，没有拖尾，斑点清晰可见，其中有一
个斑点展开的距离与对照品的相近，其中对照品斑点
的 Rf=0.674，样品中与对照品展开距离接近的斑点的
Rf=0.672，两个值很接近，说明雪莲果叶中确实存在绿
原酸成分。由图 7可看出，纯化过的样品通过薄层层析
后分离得到两个点，其中有一个斑点展开的距离与对
照品的十分相近，说明经过纯化后，样品的纯度得到了
很大的提高。
3 结论
对几种展开系统进行比较，选择乙酸乙酯∶水∶甲
酸∶甲苯=85∶10∶10∶4作为展开剂进行分离，展开效果
好，展层速度快。用 2 %FeC13-1 %K3Fe(CN)6进行显色，
斑点呈现蓝色，样品分离出现 4个独立清晰的斑点。根
据样品 Rf 值与对照品比较，Rf 对照品=0.674，Rf 样品=
0.672，确定了雪莲果叶酚酸组分中含有绿原酸，可结
合 HPLC及其他方法对该物质进行进一步定性。
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