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狗尾草总 DNA的提取与纯化研究
张正奇 ,石艳红 ,胡华 ,石耀红(湖南大学化学化工学院 ,湖南 长沙 410082)
摘要:狗尾草杂草中富含多糖和酚类物质 ,而用已报道的提取方法均难得到高纯度 DNA。为此 , 对提取植物 DNA 的 SDS 法
进行了改进。用 4.5 ml细胞提取液 , 1.0 ml饱和NaAc溶液 , 0.10 倍样液体积的无水乙醇 , 氯仿 异戊醇溶液与样液体积比为 0.
80 ,与样液等体积的酚 氯仿 异戊醇溶液(28∶21∶1)和异丙醇 ,在 65℃水浴加热 60min ,可从 1.0g狗尾草中提取 780μg纯 DNA。
关键词:DNA;提取;植物
中图分类号:0781　　文献标识码:A　　文章编号:1004-311X(2004)02-0026-03
收稿日期:2003-07-02;修回日期:2003-10-11
基金项目:湖南省财政厅发农业发展基金资助项目(2002-101-078)
作者简介:张正奇(1944-), 男 ,博士 ,教授 ,从事化学和生物技术研
究 ,发表论文 150余篇 、专著 2部 ,参与完成国家自然科学基金 1项 ,
获国家自然科学三等奖 ,主持完成省部级项目 7项 ,获省奖 3项。
　　植物 DNA 的提取是植物基因工程的基础。通常要求所提
取的 DNA 要有理想的纯度 , 足够完整 , 无断裂降解 , 提取过程
尽量少使用有毒化学品等。为了达到上述要求 ,已报道了不少
提取植物 DNA 的方法[ 1-9] , 归纳起来 , 主要有 CTAB 法 、SDS
法[ 10]和碱提取法。不同的植物要用不同的提取方法[3 ,6] 。最
近 ,作者在研究除草剂与植物 DNA的作用时发现 , 由于杂草中
富含多糖和酚类物质 ,而用已掌握的提取方法均难得到高纯
度 DNA。为此 , 对提取植物 DNA 的 SDS 法进行了改进。 用饱
和NaAc溶液与适量无水乙醇组成的混合溶液沉淀多糖和酚
类物质 ,从而可有效地分离出高纯杂草 DNA。
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　于野外旱地采集带根狗尾草(Setaria 属 , S.viridis(L.)
Beauv.)3-4 叶幼苗 ,洗净泥沙污物 , 再用去离子清洗 2 次 , 凉
干 ,于-70℃保存。
1.1.2　细胞提取液:称取 Tris(分析纯 , 上海源聚生物科技有
限公司)1.214g , EDTA 0.186g , NaCl 2.925g , SDS 1.250g ,溶解于
100 ml 0.0010 mol L HCl溶液中 ,加入巯基乙醇(化学纯)74 ml ,
摇匀 ,稀释至 1000 ml。
1.1.3　酚 氯仿 异戊醇溶液:用平衡酚(分析纯)、氯仿(分析
纯)和异戊醇(分析纯)按照酚∶氯仿∶异戊醇为 28∶21∶1 比例配
制。
1.1.4　氯仿 异戊醇溶液:用氯仿和异戊醇按照氯仿∶异戊醇
为 24∶1 比例配制。
1.1.5　主要仪器
WFZ-34A紫外可见光分光光度计 , 天津市光学仪器厂;
5804R高速冷冻离心机 , 德国 Eppedoff公司;MODEL 1235PC 恒
温水浴箱 ,美国 Sheldon 公司;THZ-92A台式恒温振荡器 ,上海
跃进医疗器械厂出品。
1.2　实验方法
1.2.1　DNA提取:称取-70℃冷冻的狗尾草 1.0g , 转入在冰
浴上预冷的研钵中 ,磨成粉状(或用玻璃匀浆器匀浆),移至已
消毒的 15 ml离心管中 ,加入 4.0 ml细胞提取液 , 0.40 ml无水
乙醇 ,混匀 , 于65℃恒温水浴中加热 60min , 并定时摇动。再向
上述离心管中加入 1.00 ml饱和 NaAc溶液 ,混匀 , 冰浴上放置
20min后 , 将混合液以 8000r min 转速离心 20min。取上层清液
至另一消毒离心管中 ,加入与样液等体积的酚 氯仿 异戊醇溶
液 ,轻轻摇匀 ,再以 8000r min的转速离心 10min。上清液移至
另一消毒离心管中 ,加入等体积的氯仿 异戊醇溶液 ,混匀后以
6000r min转速离心 10min , 取上清液至另一消毒离心管中 , 加
入等体积异丙醇沉淀 DNA , 5000r min 转速离心 15min。 倾去清
液 ,用 70%的乙醇洗涤沉淀三次 , 每次在 5000r min 转速下离
心5min , 用冷风吹干沉淀。取少量沉淀 , 用适量 TE 溶液溶解 ,
以二次蒸馏水稀释至 5.0ml , 对试剂空白测量紫外吸收光谱 ,
并确定所提取的 DNA 的纯度与产率。最后经琼脂糖凝胶电泳
检验 DNA 的完整性。
1.2.2　DNA纯度与产率:在紫外区 , DNA的λmax为260nm ,蛋白
质的λmax为 280nm。若 A260 A280小于 1.7 , 则 DNA 中含有蛋白质;若 A260 A280大于 2.0 , 则 DNA 中含有 RNA;纯 DNA 的 A260
A280值在 1.8 附近。
图 1　异丙醇用量对产率的影响
图 2　氯仿 异戊醇溶液用量对产率的影响
图 3　酚溶液用量对产率的影响
图 4　细胞提取液对产率的影响
1.0μg ml的 DNA溶液在 260nm 处的吸光度值为 0.02.由
260nm 处的吸光度值可计算 DNA的含量。
第 14卷第 2 期:26
2004 年 4 月 　　　　　　　　　　　　　　　　
生　物　技　术
BIOTECHNOLOGY
　　　　　　　　　　　　　　　　　Vol.14 , No.2:26
Apr.2004
DOI :10.16519/j.cnki.1004-311x.2004.02.013
2　结果与讨论
由于杂草中富含多糖和酚类物质 , 用已报道的方法提取
杂草 DNA时均难得到高纯度 DNA。 作者对提取植物 DNA 的
SDS 法进行了改进。 在提取液中以 NaAc代替 KCl , 并加入乙
醇 ,可得到符合后续研究要求的高纯 DNA 。影响狗尾草 DNA
产率和纯度的主要因素有水浴时间 、无水乙醇用量 、细胞提取
液用量 、饱和 NaAc 溶液用量 、苯酚 氯仿 异戊醇溶液用量 、氯
仿 异戊醇溶液用量和异丙醇用量。实验优化了提取狗尾草
DNA的条件。
2.1　异丙醇用量的影响:依照实验方法 ,称取-70℃冷冻的狗
尾草1.0g , 控制细胞提取液用量为4.0 ml ,饱和NaAc溶液用量
为0.50 ml ,无水乙醇为0.50 ml , 65℃水浴加热30 min , 酚 氯仿
异戊醇溶液和氯仿 异戊醇溶液用量为样液体积的 0.50倍 , 改
变异丙醇的用量 , 实验结果示于图 1 和表 1。由表 1 可知 , 异
丙醇用量对DNA 纯度无显著影响 ,但对产率有影响 , 异丙醇与
样液体积的合适比例为 1.0-1.2 之间 ,作者取异丙醇与样液
体积相等。
图 5　饱和NaAc用量对产率的影响
图 6　水浴时间对产率的影响
表 1　异丙醇用量对纯度的影响
异丙醇与样液体积比 A260 A280
0.60 1.78
0.80 1.79
1.00 1.81
1.20 1.83
1.50 1.83
表 2　氯仿/异戊醇溶液用量对纯度的影响
氯仿/异戊醇溶液与样液体积比 A260 A280
0.6 1.76
0.8 1.77
1.0 1.80
1.2 1.78
1.5 1.76
图 7　琼脂糖凝胶电泳
M.λ-DNA Hind III;1.狗尾草DNA
　　2.2　氯仿 异戊醇溶液用量:固定异丙醇用量与样液体积
相等 ,改变氯仿 异戊醇溶液用量 ,其余条件同 2.1 节 , 实验结
果示于图 2和表 2。由图 2 可知 ,氯仿 异戊醇溶液与样液体积
比在 0.6-0.8 之间时 , DNA 的产率最高且十分接近 ,纯度也
无明显差异。取氯仿 异戊醇溶液与样液体积比为 0.80。
2.3　酚 氯仿 异戊醇溶液用量:酚 氯仿 异戊醇溶液(简
写为酚溶液)用量对狗尾草 DNA产率和纯度的影响示于图 3
和表 3。由表 3 可知 ,酚 氯仿 异戊醇溶液用量对 DNA 的纯度
没有影响 , 而对产率有一定的影响。当酚 氯仿 异戊醇溶液与
样液体积相等时 , DNA的纯度最好 , 产率最高 , 取与样液等体
积的酚 氯仿 异戊醇溶液。
表 3　酚溶液用量对纯度的影响
酚溶液与样液体积比 A 260 A280
0.60 1.81
0.80 1.81
1.00 1.81
1.20 1.82
1.50 1.88
表 4　酚 氯仿 异戊醇溶液组成对纯度的影响
酚溶液组成 产率(μg g) A260 A280
19∶30∶1 396 1.83
21:28:1 394 1.82
23:26:1 390 1.82
25:24:1 450 1.82
28:21:1 510 1.82
29:20:1 490 1.78
30:19:1 350 1.78
2.4　酚 氯仿 异戊醇溶液组成的影响:酚 氯仿 异戊醇溶液组
成对狗尾草 DNA 产率和纯度的影响列于表 4。 由表 4 可知 ,
酚 氯仿 异戊醇溶液组成对 DNA 纯度无影响 , 但对产率影响
十分显著。当酚∶氯仿∶异戊醇为 28∶21∶1 时 , DNA 产率最高。
故取酚∶氯仿∶异戊醇为 28∶21∶1。
2.5　细胞提取液用量:细胞提取液用量对 DNA 纯度和产
率的影响示于图 4 和表 5。由图 4可知 , 细胞提取液用量在 4.
50 ml时 , 产率最高 , 纯度也较好。 取细胞提取液用量为 4.5
ml。
2.6　饱和 NaAc溶液用量的影响:饱和 NaAc 溶液用量对产率
和纯度的影响示于表 6 和图 5。显然 , 饱和 NaAc 溶液用量对
DNA 纯度无影响 ,但对产率影响较大 , 用量在 1.0ml-1.5ml之
间为宜 , 取 1.0 ml。
表 5　细胞提取液对纯度的影响
细胞细胞提取液(ml) A260 A280
2.0 1.79
3.0 1.84
3.5 1.84
4.0 1.85
4.5 1.85
5.0 1.88
表 6　饱和NaAc 用量对纯度的影响
饱和 NaAc溶液(ml) A260 A280
0.50 1.81
1.00 1.83
1.50 1.85
2.00 1.81
2.50 1.78
表 7　无水乙醇用量对纯度的影响
无水乙醇(ml) A260 A280 产率(μg g)
0 1.79 600
0.20 1.82 787
0.40 1.81 790
0.60 1.80 500
0.80 1.81 420
1.00 1.78 380
表 8　水浴时间对纯度的影响
水浴时间(min) A260 A280
30 1.81
45 1.80
60 1.81
75 1.88
90 1.87
120 1.75
272004年 4 月　　　　　　　　　　　　　　　　狗尾草总 DNA 的提取与纯化研究　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
2.7　无水乙醇用量的影响:无水乙醇用量对 DNA产率和纯度
的影响列于表 7。可见 ,无水乙醇用量对 DNA 纯度无影响 , 但
对产率影响显著 ,在 4.0 ml样液中加入 0.20-0.40ml无水乙
醇为宜 ,故取 0.40 ml。
2.8　水浴时间的影响:水浴时间对 DNA 纯度影响较小(表 8),
但对产率影响大(图 6)。由图 6 可见 , 水浴时间在 60-90min
之间产率最大且无显著差异 ,故取水浴时间为 60min。
综上实验结果 ,提取狗尾草总 DNA的适宜条件(1.0 g 狗
尾草)为:细胞提取液 4.5 ml , 水浴时间 60min , 饱和 NaAc 溶液
1.0 ml ,无水乙醇 0.40 ml , 28:21:1的酚 氯仿 异戊醇溶液及异
丙醇与样液体积相等 , 氯仿 异戊醇溶液与样液体积比为 0.
80。在选定条件下 , 狗尾草 DNA 的产率为 780μg g , 纯度高 ,
A260 A280值与 1.8 十分接近。所提取的狗尾草 DNA紫外吸收
光谱与文献[ 3]一致。琼脂糖凝胶电泳实验结果(图 7)证实 , 所
获得的狗尾草 DNA 无断裂降解。
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碳酸钙沉淀法回收琼脂糖凝胶中 DNA的探讨
曹阳1 ,2 ,董晓宇2 ,姜国斌2 ,乌兰2 ,安利佳1＊(1.大连理工大学生命科学与技术系 ,辽宁 大连 116024;2.大连大学生物工程学院 ,辽宁 大连 116622)
摘要:采用碳酸钙沉淀法回收琼脂糖凝胶中的 DNA , 达到分离纯化目的 ,回收后的 DNA可用于重组 、PCR等研究。首先将含
有目的 DNA 的琼脂糖凝胶用 NaI溶液融解 , 然后加入 CaCl2 和 NaHCO3 ,生成 CaCO3 沉淀 , DNA 与 CaCO3 形成复合物 , 通过离心分
离出沉淀复合物 ,利用稀酸溶解沉淀 , 再用无水乙醇沉降 , 即可回收目标 DNA。利用该方法回收了质粒 、毛白杨和转基因羊基因
组 DNA , 回收率为 20%～ 50%, OD260/ OD280为 1.7 ～ 1.9 , 最大回收了 21kb 片段 ,最小回收 250bp 片段 , 回收后的 DNA样品进行了
PCR扩增和限制性内切酶反应 , PCR可以扩增出目的片段 , 同时限制性内切酶可以将回收后的 DNA切开 , 表明 DNA 质量良好。
利用碳酸钙沉淀法可以回收琼脂糖凝胶中的 DNA ,此法简单 、易行 ,较为有效。
关键词:琼脂糖凝胶电泳;DNA 回收;碳酸钙
中图分类号:Q503　　文献标识码:A　　文章编号:1004-311X(2004)02-0028-02
收稿日期:2003-09-05;修回日期:2003-10-21
基金项目:国家自然科学基金资助项目(30271095);大连大学学科建
设发展基金资助项目(XFKZ0207)
作者简介:曹阳(1968-),男 ,硕士 ,副教授 ,博士生 ,研究方向:基因工
程 , Tel:0411-7402327 , E-mail:ycao0411@yahoo.com.cn;＊通讯作者:
安利佳(1955-), 男 ,博士 ,教授 , 博士生导师 , 研究方向:生物工程 ,
Tel:0411-4706365, E-mail:Bioeng@dlut.edu.cn。
　　在基因工程研究中 , 为了完成探针制备 、基因克隆 、载体
构建 、DNA 测序等工作 , 目的 DNA 回收是经常遇到的问题。
早期多使用密度梯度离心法 , 但造价高 、所需时间长 , 虽然透
析法 、DEAE纤维素膜法得率高 ,回收的 DNA 质量好[ 1] ,也存在
成本较高 、操作复杂的问题;以后出现了玻璃奶法 、低熔点琼
脂糖法;还有 HPLC 法 、琼脂糖酶法[ 2] , 试剂成本高;冻融法 、超
声波破胶法易导致 DNA 机械断裂;高浓度碘盐/树脂回收法简
便 、快速 ,回收率较高[ 3] , 但成本仍嫌过高 , 并且过大(小)片段
难以回收;也有人提出凝胶挖孔[ 4 , 5] 、电泳洗脱[ 6] 、离心 、热
融[ 7]等方法 , 各有利弊。羟基磷灰石 、亚精胺能与 DNA 结合 ,
也可用于 DNA 的回收[ 8] , 回收率在 30%左右。
目前 DNA 回收存在的问题主要有:微量样品回收效率低
甚至无法回收;回收试剂昂贵 、操作复杂 ,耗费时间;不能有效
回收大片段DNA;无法同时回收几个不同的片段;回收 DNA样
品中含有酶促反应抑制剂 ,影响酶切 、连接 、PCR扩增等操作。
作者利用 NaI融解含有目的 DNA 的琼脂糖凝胶 , 再加入
CaCl2和 NaHCO3 形成 CaCO3 沉淀 , DNA 与其形成复合物 , 而琼
脂糖呈溶解状态。通过离心回收 DNA-碳酸钙沉淀 , 利用酸
将沉淀溶解后再用无水乙醇沉降 ,从而达到回收 DNA 目的。
1　材料与方法
1.1　材料及试剂
重组质粒 pLNXHLF 及转基因羊 ,大连理工大学生命科学
与技术系提供;毛白杨(Populous tomentosa Carr.)由河北农业大
学提供。
琼脂糖 , Sigma 公司生产;DNA 限制性内切酶 、PCR 试剂
盒 、DL2000 DNA Marker、loading baffer、蛋白酶 K购于宝生物工
程(大连)有限公司;PCR 引物由宝生物工程(大连)有限公司
合成 ,λDNA(EcoR I Hind Ⅲ)DNA Marker 购于华美生物工程有
限公司。 CTAB、Tris、EDTA·Na2 、SDS、PVP、酚为进口分装(分析
纯), 其它化学试剂为国产分析纯。北京沃德生物医学仪器公
司生产紫外透射仪(WD-9403C 型), PE 公司生产(PE2400)
PCR扩增仪 ,Hettich(EBA12R型)离心机 ,Milli-Q超纯水装置 ,
HH-W600 恒温水浴箱 , JASCO(V-560)紫外分光光度计。
图 1　DNA及其回收后酶切 、PCR电泳结果
Fig.1　Electrophoresis results of enzyme digest and PCR using the
original and recovered DNA　1.λDNA(EcoR Hind Ⅲ)Marker;2.populus
tomentosa DNA;3.reclaim populus tomentosa DNA;4.goat DNA;
5.reclaim goat DNA;6.reclaim goat DNA enzyme digest(Taq I);
7.reclaim goat DNA PCR;8.plasmid pLNCXHLF 9.reclaim plasmid
pLNCXHLF;10.reclaim plasmid pLNCXHLF;enzyme digest(Taq I);
11.reclaim plasmid pLNCXHLFPCR;12.DL2000 Marker
1.2　方法
1.2.1　DNA 提取及电泳:蛋白酶 K/SDS 法提取羊基因组
DNA ,碱裂解法提取质粒[ 1] ;CTAB 法提取毛白杨基因组
DNA[ 3] 。 DNA样品 TE溶解后按常规方法进行琼脂糖电泳[ 1] ,
结果见图 1。
1.2.2　回收:电泳结束后在紫外透射仪下切下目标带 , 置于
1.5mL离心管中 , 加入 2倍体积的 NaI溶液[9] , 55℃水浴融解。
NaI融解后的样品中加入 1/2 体积的 1.25M CaCl2 ,混匀再
加入 1/ 2体积的 1.25M NaHCO3 ,混匀 , 室温下静置20 ～ 30 min ,
10000 r min 离心10min , 弃净上清 ,在沉淀中加入适量 11.5%冰
乙酸 , 使沉淀完全溶解 ,加入 2 倍体积-20℃预冷无水乙醇 , 混
匀 10000r min。离心 10min , 弃上清 , 加入 0.5mL -20℃预冷
70%乙醇 , 混匀 10000r min 离心 5min , 弃上清 , 吹干 ,加入适量
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BIOTECHNOLOGY
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