全 文 ：食品与发酵工业 FOODANDFERMENTATIONINDUSTRIES
202　 2011Vol.37No.3(Total279)
高速逆流色谱分离制备白胡椒中单萜类化合物＊
蒋志国 ,陈文学 ,刘四新
(海南大学食品学院 , 海南 海口 , 570228)
摘　要　应用高速逆流色谱法分离制备了白胡椒中 3种单萜类化合物。以 V(叔丁基甲基醚)∶V(甲醇)∶V(水)
=2∶1∶1为两相溶剂系统 , 上相为固定相 ,下相为流动相 , 在主机转速 900r/min、流动相流速 2.5mL/min条件
下 ,从 2.76 g样品中一步分离制备得到 3, 7-二甲基-2-辛烯-1, 6, 7-三醇 35 mg, 对薄荷烷-1, 2, 8-三醇-2-O-β -D葡
萄糖苷 55mg, 5-羟基龙脑-2-O-β -D葡萄糖苷 40mg, 经高效液相蒸发光散射检测器(HPLC-ELSD)检测纯度均达
95.0 %以上 , 各化合物结构经质谱和核磁共振氢谱 、碳谱鉴定。研究结果表明 ,利用该方法可以对白胡椒中的
单萜类化合物进行快速的分离和纯化 ,且制备量大 ,分离效率高。
关键词　白胡椒 ,高速逆流色谱 , 单萜
第一作者:博士 ,讲师(陈文学为通讯作者)。
　＊海南省自然科学基金资助 (808102)和海南大学校基金
(hd09xm90)资助
收稿日期:2010-09-15,改回日期:2011-01-12
　　白胡椒(PipernigrumL.)为胡椒科植物胡椒的
干燥成熟果实 ,又名白川。白胡椒是一种经济价值很
高的热带香辛作物 ,是药食两用产品 ,也是世界著名
的调味料。胡椒中含有多种化学成分 ,如胡椒碱 、氮
苯烷 、松节油萜 、水茴香萜 、柠檬萜等 [ 1 ] 。研究表明 ,
萜类化合物具有抗病毒 、细菌 、真菌 ,抗肿瘤 ,预防心
血管疾病以及松弛平滑肌等多种生物活性 [ 2] 。萜类
化合物的分离制备一般采用有机溶剂提取 ,再经过反
复重结晶或硅胶柱层析纯化 ,可获得高纯度的产
物 [ 3-4] 。由于多次重结晶以及硅胶柱层析会对目标
产物造成较大的损失 ,使得收率大大降低 , 同时其过
程繁琐冗长 。
高速逆流色谱(high-speedcountercurentchro-
matography, HSCCC)技术是一种无固体载体的连续
液 -液分配色谱技术 , 其固定相通过重力场和离心力
场作用被保留在分离柱内 , 避免了固体载体与样品
发生化学反应而变性及不可逆吸附 ,样品回收率高 ,
可从粗制样品中在规模制备高纯度单体化合物 ,已广
泛用于生化工程 、医药 、天然产物 、食品等领域 [ 6 -9] 。
本文以白胡椒为原料 ,运用制备型高速逆流色谱
对白胡椒中的单萜类化合物进行了制备 、纯化及结构
鉴定。
1　实验材料与设备
1.1　实验材料
白胡椒 (市售), 反相精细分离填料 MCI-GEL
CHP20P(北京绿百草科技发展有限公司);20 cm×
20 cmSilcagel60 F254薄层层析色谱板(Merck德
国);石油醚 ,甲醇 ,乙酸乙酯 ,叔丁基甲基醚(分析纯
试剂),华东医药股份有限公司;色谱纯甲醇(Merck
德国)。
1.2　主要仪器设备
HSCCC-D1200制备型高速逆流色谱仪(浙江工
商大学逆流色谱研究室),包括 K-1800 Welchrom恒
流泵(Knauer德国)、B-684自动收集器(Bǜchi,瑞士)
和 Model8823A-UV紫外检测器(北京新技术应用研
究所),聚四氟乙烯管缠绕在 5个水平轴上形成螺旋
管(5mmI.D.柱容积 1 200 mL),转速 0 ～ 1 000 r/
min;玻璃色谱柱 , Υ5cm×50 cm(杭州常盛科教器具
厂);N-1000旋转蒸发仪 (上海爱朗仪器有限公
司);FD-1冷冻干燥机 (北京博医康技术公司);LC-
20A高 效液相色谱 仪 (Shimadzu, Japan), 包括
SEDEX75蒸发光散射检测器(Sedex公司 法国);质
谱采用 BrukerEsquire3000 plus质谱仪 (Bruker美
国)进行测定 , 离子源为 ESI;AVANCEDMX500核
磁共振仪(Bruker德国)。
2　实验方法
2.1　样品的预处理
称取胡椒粉 5 kg用体积分数 95%乙醇于 50℃
浸提 3次 ,每次乙醇用量 50 L,浸提 24 h,并不断搅
拌。将 3次得到的浸提液混合 ,于 45 ℃下减压浓缩
至无醇味后 ,将浓缩物分散于 5 L蒸馏水中 ,依次用
等体积的石油醚 、乙酸乙酯 、正丁醇分别萃取 3次 ,萃
DOI :10.13995/j.cnki.11-1802/t s.2011.03.007
分离与提取
2011年第 37卷第 3期(总第 279期) 203　
取液减压浓缩后得正丁醇相粗提物 40 g。
2.2　正丁醇相粗提物分离
将 500 gMCI-GELCHP20P填料装入半径为 2.5
cm,长为 50 cm的玻璃柱中 ,依次用蒸馏水 、甲醇 、蒸
馏水各冲洗不少于 3倍柱体积 ,平衡 24h后上样 。
正丁醇相提取物 40 g先用少量甲醇溶解 ,然后
加入适量已处理好的 MCI-GELCHP20P填料 ,混合拌
样 ,减压浓缩至干并上样。依次用蒸馏水 、30%甲醇 、
60%甲醇 、和 90%甲醇洗脱 ,每次 3个柱体积 ,洗脱
至流出液没有颜色 ,旋转蒸发 ,冷冻干燥后得 60%甲
醇洗脱部分 (Fr60)2.76 g,待用 。
2.3　HSCCC分离
本实验所用溶剂系统为叔丁基甲基醚 -甲醇-水
(体积比 =2∶1∶1), 4种溶剂按比例置于分液漏斗中 ,
充分振荡后静置分层。上相作为固定相 ,下相作为流
动相 ,超声脱气后备用 。称取 2.5 g样品 ,用上下相
各 40 mL溶解 ,超声脱气后备用 。将固定相注满
HSCCC-D1200螺旋管后开启直流电机 ,转速调至 900
r/min,并以 2.5 mL/min的流量从首端泵入流动相 ,
在色谱柱尾端用量筒接收流出的固定相;待色谱柱尾
端不再有固定相流出时 ,表明系统已动态平衡 ,量出
流出的固定相体积 ,计算在此条件下的固定相保留率
S, 即 S=(V柱 -V出)/ V柱 ,式中 V柱 为柱体积(mL),
V出 为流动相推出的固定相体积(mL);进样 80 mL,
以 20 mL试管收集流出液 , 共收集 136管 , 并采用
TLC点样检测分离情况 。展开剂为三氯甲烷-甲醇-
水(体积比 65∶35∶10)静置后的下层溶液 ,显色剂为
10%硫酸 -乙醇(体积比 10∶90)溶液 。
2.4　高效液相蒸发光散射(HPLC-ELSD)分析条件
色谱柱:WatersSymmetryCl8色谱柱(4.6 mm×
150 mm, 5 μm);流动相 V(CH3CN)∶V(H2O)=(60
∶40);流速:1.0mL/min;柱温:25 ℃;进样量:10 μL;
ELSD检测器参数:漂移管温度 70 ℃, ELSD的增益
值为 7,载气为空气 ,压力 0.35MPa。
3　结果与分析
3.1　溶剂体系选择
一个稳定的两相溶剂体系是否适合于目标物质
的分离 ,通常要看物质在该溶剂体系中的分配系数是
否在一个合适的范围内 。分配系数 K=cS/cM,其中
cS指溶质在固定相中的浓度 , cM指溶质在流动相中
的浓度 。一般而言 ,对 HSCCC最合适的 K值范围是
0.5 ～ 2。当 K值≤0.5时 ,出峰时间太快 ,峰之间的
分离度较差;当 K值≥2时 ,出峰时间太长 ,且峰形变
宽。而在 0.5≤K≤2时 ,可以在合适的时间内 ,得到
分离度较好的峰形 。
溶剂系统的选择是逆流色谱分离中的首要环节 ,
为了检查溶剂系统的适用性 , 需要对分配系数进行
测定 。测定方法包括高效液相色谱分析型逆流色谱
和 TLC法等。 TLC法的准确度较低 , 但方便 、快速。
选择溶剂系统的目的是分离样品 , 测定分配系数只
是为了检查溶剂系统的适用性 , 对其准确度要求不
高 , 因此 TLC法对各种样品 ,尤其是复杂天然产物分
离的逆流色谱溶剂系统选择非常适用。在工作中发
现 , 根据斑点色度可以观察样品中各组分的相对含
量及其在两相溶剂中的分配情况 , 即估计分配系数
的大小及差异 , 由此可以确定溶剂系统的适用性及
各组分的流出顺序 。
依据经验 ,按照溶剂系统选择的原则和过程 ,在
实验过程中进行了大量的筛选 ,得到以下 2种溶剂系
统。
(A)V(三氯甲烷)∶V(甲醇)∶V(水)=5∶4∶3
(B)V(叔丁基甲基醚)∶V(甲醇)∶V(水)=2∶1
∶1
各溶剂系统的的 TLC分析结果如图 1所示 。
图 1　胡椒 60%甲醇洗脱部分在 2种溶剂系统
中上下相的薄层色谱图
从图 1中可以看出 ,在溶剂系统 A中 ,样品中各
组分主要集中在下相 ,上相很少或无 ,分配系数很不
合理 ,不适合作为逆流色谱分离中的溶剂系统。在溶
剂系统 B中 ,样品中各组分在上下相中都有较好的
分配 ,而且从斑点色度来看 ,系统 B中各组分之间的
分配系数差异较为明显 ,且分层时间较短为 30s。因
此 ,最后选定选择溶剂系统 B作为高速逆流色谱分
离的溶剂体系 。
3.2　HSCCC-D1200分离参数的优化
3.2.1　流速对 HSCCC保留率的影响
流动相的流速不但显著影响分离时间 ,而且也会
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对分离度产生一的影响 。以叔丁基甲基醚 -甲醇-水
为两相溶剂系统 ,上相为固定相 ,下相为流动相 ,在其
它参数相同的条件下 ,流速越大 ,分离时间越短 ,但是
固定相保留率越小 ,分离度就越小。因此 ,要在保证
固定相保留率和分离度的前提下尽可能缩短分离时
间 。因此 ,综合实际分离情况 ,本试验最佳流速选为
2.5mL/min。
图 2　不同流速对 HSCCC-D1200固定
相保留率的影响
3.2.2　转速对 HSCCC保留率的影响
以叔丁基甲基醚 -甲醇-水为两相溶剂系统 ,上相
为固定相 ,下相为流动相 ,流动相的流速为 2.5mL/
min时高速逆流色谱仪转速的变化对固定相保留率
的影响情况如图 3所示 。研究表明 ,螺旋柱的旋转速
度对两相溶剂系统在流体动力学平衡时的体积比影
响很大 ,转速越大 ,固定相的保留值越大。一般来说 ,
保留率越高对分离越有利 ,但考虑到仪器承受能力有
限 ,另外转速过高 ,还容易造成乳化 ,因此 ,本试验最
佳转速选为 900r/min。
图 3　不同转速对 HSCCC-D1200固定
相保留率的影响
3.3　HSCCC-D1200分离胡椒 60%甲醇洗脱部分结
果
以上相为固定相 ,下相为流动相。溶剂系统为
3.1中(B),进样量 2.5 g,进样时流动相流速为 1.0
mL/min,进样后流动相流速为 2.5 mL/min,转速 900
r/min,收集 7 min/tube(20 mL试管),固定相保留率
55%。TLC结果如图 4所示 。
图 4　HSCCC-D1200分离胡椒 60%甲醇洗脱
部分的薄层色谱图
　　根据 TLC结果可知 ,合并 12 ～ 26管 , 46 ～ 80管 ,
102 ～ 126管 ,旋转蒸发和冷冻干燥 ,称量后分别得化
合物 1(35 mg)、化合物 2(55 mg)和化合物 3(40
mg)。
3.4　纯度鉴定
用 HPLC-ELSD对分离制备得到的单体化合物
1、2和 3进行纯度鉴定(见图 5)。结果表明 , 3种化
合物纯度分别达到了 95.8%、96.1%和 96.3% (面
积归一法),具备了进行进一步的结构解析的要求 。
3.5　结构解析
化合物 1 ESI-MS(m/z)∶211 [ M +Na] +.1H
NMR(δinCD3OD):1.17 (3H, s, H-8), 1.20
(3H, s, H-9), 1.40(1H, m, H-5a), 1.75(1H, m,
H-5b), 1.69(3H, s, H-10), 2.07(1H, m, H-4a),
2.29 (1H, m, H-4b), 3.25(1H, d, J=10.5Hz, H-
6), 4.10 (1H, d, J=6.5 Hz, H-1), 5.42(1H, m,
H-2);13CNMR(δinCD3OD):14.9 (C-10), 23.4
(C-8), 24.4(C-9), 29.1(C-5), 36.4(C-4), 58.1
(C-1), 72.3 (C-7), 77.5 (C-6), 123.6 (C-2),
138.3(C-3)。对照文献 [ 9] ,判断该化合物为(R)-3,
7-dimethyloct-2E-en-1, 6 , 7-triol, 即 3, 7-二甲基-2-辛
烯-1, 6, 7-三醇。
化合物 2 ESI-MS(m/z):373 [ M +Na] +.1H
NMR(δinCD3OD):3.89 (1H, m, H-2), 2.52
(1H, m, H-3a), 1.68 (1H, dt, J=17.4, 2.7 Hz,
H-3b), 1.52 (1H, m, H-4), 1.98(1H, m, H-5a),
1.61 (1H, m, H-5b), 1.11 (3H, s, H-7), 1.20
(3H, s, H-9), 1.28 (3H, s, H-10), 4.34 (1H, d,
J=8.2Hz, H-1), 3.15(1H, d, J=8.4 Hz, H-2),
3.38 (1H, m, H-3), 3.36 (1H, m, H-4), 3.26
(1H, m, H-5), 3.87(1H, d, J=11.4 Hz, H-6a),
3.73 (1H, dd, J=10.4, 4.9 Hz, H-6b);13CNMR
分离与提取
2011年第 37卷第 3期(总第 279期) 205　
图 5　HSCCC分离得到的单萜化合物的
HPLC-ELSD色谱图
（δｉｎＣＤ3OD):73.5 (C-1), 76.4 (C-2), 34.6(C-
3), 35.3 (C-4), 23.0 (C-5), 26.8 (C-6), 25.0
(C-7), 75.3 (C-8), 29.4 (C-9), 29.1 (C-10),
106.2(C-1), 74.9 (C-2), 78.1(C-3), 71.7(C-4
), 77.6(C-5), 62.9 (C-6)。对照文献 [ 10] ,判断该
化合物为 p-menthane-1, 2, 8-triol-2-o-β-D-glucopyr-
anoside,即对薄荷烷 -1, 2, 8-三醇 -2-O-(-D葡萄糖苷。
化合物 3 ESI-MS(m/z):355 [ M +Na] +.1H
NMR(δinCD3OD):3.83 (1H, m, H-2), 1.10
(1H, m, H-3a), 2.26(1H, m, H-3b), 1.66 (1H,
d, J=4.5 Hz, H-4), 3.82 (1H, m, H-5), 1.33
(1H, m, H-6a), 2.50(1H, m, H-6b), 0.86 (3H,
s, H-8), 1.07(3H, s, H-9), 0.97(3H, s, H-10),
4.25(1H, d, J=7.5Hz, H-1), 3.18 (1H, m, H-2
), 3.31(1H, m, H-3), 3.28 (1H, m, H-4), 3.23
(1H, m, H-5), 3.66 (1H, m, H-6a), 3.84 (1H,
m, H-6b);13 CNMR(δinCD3OD):50.1 (C-1),
84.6(C-2), 34.6(C-3), 52.3 (C-4), 76.7 (C-5),
70.2 (C-6), 46.8(C-7), 18.9(C-8), 19.9(C-9),
12.3 (C-10), 104.5(C-1), 74.0(C-2), 76.7(C-3
), 70.2 (C-4), 76.4 (C-5), 61.4 (C-6)。对照文
献 [ 11] ,判断该化合物为 5-hydroxybornyl-2-O-β-D-glu-
copyranoside,即 5-羟基龙脑 -2-O-β-D葡萄糖苷。
4　结论
本次研究工作采用了制备型高速逆流色谱仪对
热带香辛料白胡椒中的活性单萜类化合物进行了分
离纯化。实验过程中系统地优化了溶剂体系和实验
参数 ,在适宜的分离条件下 ,即 V(叔丁基甲基醚)∶V
(甲醇)∶V(水)=2∶1∶1, 为两相溶剂系统 ,上相为固
定相 ,下相为流动相 ,主机转速 900 r/min,流动相流
速 2.5mL/min,通过一步分离得到了 3 , 7-二甲基 -2-
辛烯 -1, 6, 7-三醇(35 mg, 95.8%)、对薄荷烷 -1, 2, 8-
三醇 -2-O-β-D葡萄糖苷(55 mg, 96.1 %), 5-羟基龙
脑-2-O-β -D葡萄糖苷(40 mg, 96.3 %)。相比于传
统的分离方法如硅胶柱色谱 ,高速逆流色谱具备一系
列的独特优势如很高的样品回收率 、较大的样品进样
量 、较低的溶剂消耗等 ,非常适用于分离制备天然植
物中的生物活性成分。
参 考 文 献
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StudyontheSeparationofMonoterpenesfromPipernigrum
L.byHigh-speedCounter-currentChromatography
JiangZhi-guo, ChenWen-xue, LiuSi-xin
(ColegeofFoodScience, HainanUniversity, Haikou570228, China)
ABSTRACT　Threemonoterpeneswereprepared, isolatedandpurifiedfromPipernigrumL..byhigh-speedcount-
er-curentchromatography(HSCCC).Atwo-phasesolventsystemcomposedofTBME-methanol-water(2∶1∶1, v/v/
v)wasused.Theupperphasewasstationaryphaseandlowerphasewasmobilephase.Byone-stepelution, under
theconditionsofaflowrateof2.5 mL/minand900 r/min, 35mgof3 , 7-dimethyloct-2E-en-1, 6, 7-triol, 55mgof
p-menthane-1, 2, 8-triol-2-O-β -D-glucopyranosideand40 mgof5-hydroxybornyl-2-O-β -D-glucopyranosidewasob-
tainedfrom2.76mgofthebutanolextractofPipernigrumL., thepuritieswasover95.0%detectedbyhighperform-
anceliquidchromatographywithevaporativelightscateringdetection.Theobtainedfractionswereanalyzedbyhigh
performanceliquidchromatography(HPLC), andidentifiedbymassspectrometry(MS), 1H-nuclearmagneticreso-
nance(NMR)and13C-NMR.TheresultsindicatedthatHSCCCisapowerfultechniqueforthepurificationofmonot-
erpenesfromPipernigrumL.withhighproductivecapacityandhigheficiency.
Keywords　PipernigrumL., high-speedcounter-currentchromatography, monoterpene
　信息窗
　
葡萄酒最新技术之一:葡萄酒氧管理技术
在昆明举行的葡萄酒酿酒技术研讨会上 ,来自世界顶级高分子瓶塞制造商诺玛科公司介绍了国际上被广泛关注的
葡萄酒最新技术之一葡萄酒氧管理技术。来自荷兰的奥拉夫博士(OlavAagaard)在研讨会上表示:“氧管理对提高葡萄酒的生
产高品质是至关重要的 ,如果云南葡萄酒想要在高端消费市场上与进口葡萄酒竞争 , 占据更大的市场份额 , 应用氧管理技术就
是一条重要途径。”
云南红酒业有限公司 、云南太阳魂酒业有限公司 、云南香格里拉酒业股份有限公司 , 以及东风庄园葡萄酒酒业公司和墨江
酒江酒业有限公司等葡萄酒企业参加了此次研讨会。奥拉夫博士讲解了氧管理技术对提高葡萄酒品质所起的重要作用:“氧
气与葡萄酒的关系是一种平衡关系 , 相当于中国道教太极图中的阴阳协调。生命需要平衡 , 人类可生存的正常环境 ,是空气中
始终保持 21%的氧气含量 ,如果这一含量过高或者过低 ,则会影响人类的正常生存。其实 , 氧含量对于葡萄酒来说也是同样重
要的对葡萄酒中的含氧量进行量化控制 , 才能酿造出高品质的葡萄酒。”
据介绍 ,在国际葡萄酒生产产业 ,全面应用氧管理并根据氧测量数据改进灌装工艺已成为提高葡萄酒质量和储存期的主要
趋势。即使是世界上顶级葡萄酒制造商通常也存在氧渗透管理技术不完善的情况。 2006年至 2008年 , 在重要的国际葡萄酒
品酒比赛中 ,约有 6%的葡萄酒被确定为存在质量缺陷 , 而在这些问题酒中 ,约 60%是由于氧管理的失误而造成的 。 (来源:中
国食品科技网)