全 文 ：食品研究与开发 2008年9月第29卷第9期
波高等专科学校学报,2001,13(增刊):89-91
[9] 祝连彩,王伯初,刘火安,等.高效液相色谱法测定银杏叶提取物
中黄酮含量[J].重庆大学学报,2006,29(1):117-119
[10]马莺,王静,牛天骄.功能性食品活性成分测定[M].北京:化学工
业出版社,2005:252
收稿日期:2007-11-15
基金项目:民族药资源化学重点实验室开放课题基金(MJY07016)
作者简介:杨海英(1975-),女(汉),讲师,硕士研究生,主要从事天然
产物化学及仪器分析研究。
杨海英 1,杜刚 1,程雪梅 2,杨新星 1,刘茂华 3,戴云 1
(1.云南民族大学 化学与生物技术学院,民族药资源化学重点实验室,云南 昆明 650031;
2.上海中药标准化研究中心,上海 201203;3.昆明瑞鹏生态农业科技有限公司,云南 昆明 650106)
HPLC法测定雪莲果叶乙醇提取物中
芦丁和槲皮素
DETERMINATIONOFRUTINANDQUERCETININEXTRACTIONOFLEAVESOFYACONWITH
ETHANOLBYUSINGHPLC
YANGHai-ying1,DUGang1,CHENGXue-mei2,YANGXin-xing1,LIUMao-hua3,DAIYun1
(1.TheSchoolofChemistry&biotechnology,YunnanNationalitiesUniversity,KeyLaboratoryofChemistryin
Ethnic-medicineResources,MinistryofEducation,Kunming650031,Yunnan,China;2.ShanghaiR&DCentrefor
StandardizationofChineseMedicines,Shanghai201203,China;3.KunmingRuipengEcological
AgricultureScienceandTechnologyDevelopmentCo.Ltd.,Kunming650106,Yunnan,China)
Abstract:Ahighperformanceliquidchromatographic(HPLC)methodfordeterminationofrutinandquercetinin
ehanolextractofleavesofyacon(Smalanthussonchifolius)wasdeveloped.ItemployedawatersXteraTMMSC18
column(150mm×3.9,5μm).Themobilephasewasmetholwith0.5%phosphoricacidsolution.Thecomposi-
tionswereseparatedcompletelyunderthecomditionof:flowrate0.5mL/min,columntemperature25℃,354nm
wavelengthofdetector.Theresultsshowthatthemethodwasprovedtobelinearintherangesof0.03g/L~0.48g/L
forrutinandquercetin.Therecoverieswere98.86%and97.25%.TheRSDwere0.09%and0.30%.Itiscon-
cludedthatthismethodisrapid,accurateandreproduciblefordeterminingtherutinandquercetininehanolex-
tractofleavesofyacon.
Keywords:HPLC;ehanolextractofleavesofyacon;rutin;quercetin
摘 要:运用高效液相色谱方法(HPLC)梯度洗脱同时测定了雪莲果叶乙醇提取物中的芦丁和槲皮素,色谱柱为
watersXteraTMMSC18柱(150×3.9mm,5μm),流动相为甲醇-0.5%磷酸水溶液,梯度洗脱,检测波长354nm,柱温25℃。
实验结果表明:芦丁和槲皮素在0.03g/L~0.48g/L范围内线性关系良好,加样回收率分别为 98.86%和 97.25%,相对标
准偏差(RSD)分别为0.09%和0.30%。该方法快速、简便、准确,重现性好,可用于雪莲果叶乙醇提取物中芦丁和槲
皮素含量测定。
关键词:高效液相色谱法;雪莲果叶乙醇提取物;芦丁;槲皮素
雪莲果(Smalanthussonchifolius)又称雪莲薯、亚龙
果、亚贡,为菊科向日葵属双子叶草本植物,原产于南美
洲的的安第斯山。具有护肝,抗氧化,抗动脉硬化,抑菌,
降血脂,降血糖等药理作用[1],是一种安全、有效、无毒副
作用的水果[2]。据K.Valentova[3]研究,雪莲果叶具有显著
的抗氧化作用。在秘鲁、巴西等国,雪莲果叶被晾晒成茶
叶,对治疗糖尿病和肠胃疾病有着积极影响。以芦丁、槲
皮素为代表的黄酮类物质的抗氧化作用较强,能抑制脂
质氧化,预防动脉硬化。因其特殊的保健功能及药用价
值,20世纪 80年代日本及一些欧洲国家陆续开始栽
种。目前在我国只有云南、海南等6个省区引种成功[4]。
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
检测分析
119
食品研究与开发2008年9月第29卷第9期
B.Simonovsk[5]等研究了雪莲果块茎及叶中的酚酸
类化合物,发现雪莲果块茎及叶中都含有绿原酸、咖啡
酸和阿魏酸,在叶中还含有原儿茶酸,用 TLC法检出
雪莲果块茎的酸水解产物中含有槲皮素,但在雪莲果
叶中未检出芦丁和槲皮素。本文用反相HPLC法首次
在云南栽种的雪莲果叶的乙醇提取物中检出黄酮类物
质芦丁和槲皮素,并对其进行含量测定。为更合理的利
用雪莲果提供了科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料
雪莲果叶乙醇提取物由昆明瑞鹏生态农业科技有
限公司提供,雪莲果栽种于云南省嵩明县滇源镇。
1.2 仪器
日本岛津公司SPD-10AT高效液相色谱仪,配有
CBM-20A系统控制器、SPD-10Avp检测器、LC-10Atvp
高压泵、SIL-10AP自动进样器;超纯水器:arium611UF,
Sartorius;超声波清洗器:AS3120A,天津瑞森特;电子
天平:AdventurerTM,AR2140,上海奥豪斯公司。
1.3 试剂
槲皮素标准品购自中国药品生物制品检定所(批
号:100081-200406);芦丁标准品购自成都欧康植化科
技有限公司(纯度≥98%)。甲醇(色谱纯);磷酸(分析
纯);样品制备用甲醇为分析纯;超纯水。
1.4 试验方法
1.4.1 色谱条件
色谱柱 WatersXteraTMMSC18柱(150×3.9mm,
5μm)液相色谱柱,流动相A甲醇;B体积分数为0.5%
的磷酸水溶液,梯度洗脱程序见下文,流速0.5mL/min,
检测波长354nm,柱温25℃,进样量10μL。
1.4.2 标准品溶液的制备
分别称取芦丁和槲皮素适量,精密称定,甲醇溶
解,制成每 1L含芦丁 0.48g,槲皮素 0.48g的混合标
准溶液,置于4℃的冰箱中保存。 取混合标准溶液适
量,加甲醇制成0.03、0.06、0.12、0.24、0.36g/L系列混合
标准溶液。
1.4.3 样品溶液的制备
称取雪莲果叶乙醇提取物 0.5g,精密称定,置
25mL量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,过滤,取续
滤液,经0.45μm滤膜过滤,备用。
2 结果与讨论
2.1 流动相的选择
本实验中对甲醇-水、乙腈-水、甲醇-磷酸水溶液
3种流动相体系进行了筛选,发现甲醇-磷酸水溶液的
分离效果较好。
为了考察磷酸浓度对保留时间的影响,分别采用
体积比为0.5%、2%、4%的磷酸水溶液,在确定的梯
度条件下进行样品分析,结果表明磷酸的浓度对样品
的分离效果并没有显著的影响。考虑到流动相酸性强
对色谱柱不利,最终选择甲醇-0.5%磷酸水溶液为流
动相。
由于芦丁和槲皮素的极性相差较大,采用等度洗
脱所需时间较长,或难以实现各组分完全分离。为了
掌握保留时间与流动相之间的关系,分别以甲醇(A)
-0.5%磷酸水溶液(B)的比例为 9:1、7:3、5:5、3:7的
流动相考察了保留时间的变化情况,如图1。
由图 1可以看出,芦丁和槲皮素的保留时间随
着流动相极性的增强而增加,但增加速率不一样。槲
皮素在流动相 A和 B配比为 3:7时保留时间太长,
40min内未检测出。为使样品达到较好的分离效果,同
时尽可能缩短分析时间,需要采用梯度洗脱。结合样品
分离情况,反复试验,最终确定流动相的梯度洗脱程
序:0min~15min,35%A~42%A;16min~40min,42%A。
2.2 标准曲线的绘制和检测限
将“1.4.2”节下制好的系列浓度的混合标准品溶
液分别进样10μL,以其组分峰面积y对其质量浓度
x(g/L)进行线性回归,得到回归方程;将标准品溶液
无限稀释,测其检出限(S/N=3)见表1。图2为混合标
准溶液的色谱图。
图1 流动相中甲醇和磷酸水溶液的比例对保留时间的影响
Fig.1 Efectoftheratioofmethanolandphosphoricacid
solutioninmobilephaseonretentiontime
表1 标准曲线及线性范围
Table1 Standardcurveandlinearityrange
线性方程
Regressionequation
y=3×107x+12635
y=6×107x-17346
r2
1
1
对照品
Component
芦丁Rutin
槲皮素Quercetin
线性范围/(g/L)
Linearrange/(g/L)
0.03~0.48
0.03~0.48
检测限/(mg/L)
Detectionlimit/(mg/L)
0.15
0.07
检测分析
120
食品研究与开发 2008年9月第29卷第9期
图2 混合标准溶液的色谱图
Fig.2 HPLCchromatogramofstandardreference
2.3 精密度试验
将“1.4.2”节下制好的混合标准溶液(0.48g/L)按
色谱条件平行测定5次,计算出芦丁和槲皮素峰面积
的相对标准偏差分别为0.09%和0.30%,表明仪器精
密度良好。
2.4 稳定性试验
取样品试液(1.4.3方法配制)放置 0、1、2、6、16、
24h,分别按 1.4.1色谱条件测定,测得芦丁和槲皮素
的峰面积RSD分别为1.38%和0.91%。表明样品放置
24h稳定。
2.5 回收率试验
在 0.5g雪莲果叶乙醇提取物中加入每 1L含芦
丁3g、槲皮素 2g的混合标准溶液 2mL,按“1.4.3”节
方法进行样品处理,测定,结果见表2。
测定量/mg
Mensurationvalue/mg
11.7508
11.6670
11.7960
11.9226
11.7659
7.6971
7.7508
7.8082
7.8326
7.7404
组分
Component
芦丁
Rutin
槲皮素
Quercetin
回收率/%
Recoveries/%
98.8342
97.1450
99.1000
101.0150
98.2083
95.9996
97.0513
98.2925
98.7087
96.2099
平均回收率/%
Meanrecovery/%
98.86±1.35
97.25±1.16
RSD/%
1.4366
1.2488
2.6 样品的测定
按“1.4.3”节方法制备的样品溶液,采用上述梯度
洗脱条件进行分离,得到雪莲果叶乙醇提取物样品的
色谱图,如图3。
经标准加入法确认,Ⅰ峰和Ⅱ峰所对应的化合物
分别为芦丁和槲皮素。经测定,雪莲果叶乙醇提取物样
品中芦丁和槲皮素的含量(质量分数)分别为 1.170%
和0.775%(n=3)。
3 结论
本文建立了雪莲果叶乙醇提取物中芦丁和槲皮素
的高效液相色谱测定方法。该方法中芦丁和槲皮素在
0.03g/L~0.48g/L范围线性良好,平均回收率分别为
98.86%和97.25%,精密度试验相对标准偏差分别为
0.09%和0.30%,n=5,重现性好,适用于雪莲果叶乙醇
提取物中芦丁和槲皮素含量的同时测定。
参考文献:
[1] 李卓亚.雪莲果化学成分及其药理作用的研究进展[J].食品与药
品,2007,9(6):41-43
[2]SusanaBGenta,WilfredoMCabrera,AlfredoGrau.Subchronic4-
monthoraltoxicitystudyofdriedSmalanthussonchifolius(yacon)
rootsasadietsupplementinrats[J].FoodandChemicalToxicology.
2005,43(11):1657-1665
[3]K.Valentova,L.Cvak,A.Muck.Antioxidantactivityofextractsfromthe
leavesofsmalanthussonchifolius[J].EurJNutr.2003,42:61-66
[4] 钱林,丁长河,李里特,等.雪莲果的化学组分及其功能特性[J].食
品研究与开发,2006,27(6):179-180
[5] BredaSimonovska,IrenaVovk,SamoAndrenek.Investigationof
phenolicacidsinyacon(Smalanthussonchifolius)leavesandtubers
[J].J.Chromatogr.A.2003,1016:89-98
收稿日期:2008-01-10
图3 样品溶液的色谱图
Fig.3 HPLCchromatogramofsample
加入量/mg
Added/mg
6.0000
6.0000
6.0000
6.0000
6.0000
4.0000
4.0000
4.0000
4.0000
4.0000
样品中的量/mg
Background/mg
5.8208
5.8383
5.8500
5.8617
5.8734
3.8571
3.8687
3.8765
3.8843
3.8920
检测分析
表2 芦丁和槲皮素的回收率测定(n=5)
Table2 Recoveriesofrutinandquercetin(n=5)
121