全 文 ：正交试验法优选乌骨藤的提取工艺研究
张 腾，张爱华，戴根来
( 合肥久诺医药科技有限公司，安徽 合肥 230088)
摘要:目的 优选乌骨藤的提取工艺。方法 采用正交试验，对加水量、提取时间、提取次数进行考察，以乌骨藤中绿原酸含量
作为评价指标，优化乌骨藤的最佳提取工艺。结果 通过正交试验考察，乌骨藤提取的最佳工艺为:加 8 倍量水提取 3 次，每次
提取 1h。结论 优选的乌骨藤提取工艺重现性良好，稳定可行。
关键词:乌骨藤;绿原酸;正交设计;高效液相色谱法
Orthogonal test method to optimize the extraction
process of Caulis marsdeniae tenacissimae
ZHANG Teng，ZHANG Ai-hua，DAI Geng-lai
(Hefei Jiunuo Medical Technology Co．，Ltd． Hefei，Anhui 230088，China)
Abstract:Objective To optimize the extraction process of Caulis marsdeniae tenacissimae． Methods The quantity of water，the times
and the extraction time，the optimum extraction were investigated on basis of chlorogenic acid content as evaluation index by orthogonal
design． Results With orthogonal design，the best decocting condition was presented as follows:adding 8-fold of water，extracting for 1
hour and for 3 times in all． Conclusion This method is stable and reliable．
Key words:caulis marsdeniae tenacissimae;chlorogenic acid;orthogonal design;HPLC
乌骨藤又名通关藤 Marsdenia tenacissima(Roxb)Wight et
Arn，是萝藦科(Asclepiadaceae)牛奶菜属(Marsdenia R． Br．)
植物，始载于《滇南本草》。性味苦，微寒，具有止咳，祛痰，平
喘等功效，主产于云南。含有多种甾体酯苷、生物碱、有机酸、
多糖、树脂及色素等多种化学成分，传统用于咳嗽哮喘、痰咳
嗽喘，主治气管炎，支气管哮喘［1］。曾收载于《云南省药品标
准》和《中国药典》。其具有免疫调节、保肝利尿、解毒抗癌等
作用。乌骨藤含有的独特化学成分———总酚酸，对胃癌、肝癌
等多种肿瘤具有确切的抗肿瘤作用，是一种很有前途的抗肿
瘤中药。乌骨藤总酚酸成分以绿原酸为代表，绿原酸具有较
强的抑制突变能力，它可通过抑制活化酶来抑制致癌物黄曲
霉素和苯并芘引发的突变，同时，绿原酸还可通过降低致癌物
利用率及其在肝脏中的运输以达到防癌、抗癌效果。绿原酸
对大肠癌、肝癌和喉癌具有显著的抑制作用，它被誉为“癌症
的有效防护剂”。现代药理实验证明绿原酸有抗癌和抑癌之
功效，日本学者研究了绿原酸的变异原性抑制作用(Antimuta-
genicity) ，发现该作用与绿原酸等抗变异原性成分有关，揭示
了绿原酸对肿瘤预防的重要意义［2］。本文对乌骨藤的提取
工艺进行相关研究，以提取物中绿原酸的含量作为考察指标，
优化最佳提取条件，主要研究结果如下。
1 实验材料
1． 1 药材及对照品 乌骨藤药材:购于亳州市中药材大市
场，经安徽中医学院汪电雷副教授鉴定为萝摩科植物乌骨藤
Marsdenia tenacissima(Roxb．)Wight et Arn;绿原酸对照品:
中国药品生物制品检定所(批号:110753 － 200212) ，供含量测
定用。
1． 2 仪器 SSI高效液相色谱仪:美国科学仪器有限公司;电
子天平(十万分之一) :Mettler Toledo AB135-S，德国梅特勒公
司;紫外可见分光光度计:TU-1810 型，北京普析通用仪器有
限公司。
1． 3 试剂 水为重蒸馏水;乙腈、甲醇为色谱纯;磷酸为分析
纯
2 乌骨藤提取工艺研究
2． 1 因素水平设计 我们采用正交试验对乌骨藤提取工艺
进行优选，采用 L9(3
4)正交试验对加水量、提取时间和提取
次数三个影响因素进行考察，以乌骨藤中绿原酸提取率作为
考察指标［3-4］，优选最佳提取条件。因素水平设计见表 1。
表 1 正交试验因素水平表
因素水平
加水量(倍) 提取时间(h) 提取次数
A B C
1 4 1 1
2 6 2 2
3 8 3 3
2． 2 样品的制备 称取乌骨藤九份，每份 50 g，按 L9(3
4)正
交试验条件分别提取，提取液滤过，合并滤液，水浴浓缩至稠
膏状，置真空干燥箱中干燥成干浸膏。
2． 3 考察指标的测定方法
2． 3． 1 考察指标的确定 参考相关文献［5-7］，绿原酸为乌骨
藤中的主要有效成分，故我们选择以测定提取物中绿原酸的
提取率作为考察指标。
2． 3． 2 绿原酸的测定方法 (1)色谱条件与系统适用性:色
谱柱:Phenomenex Kromasil 100A(250 mm ×4． 6 mm，5 μm)分
析柱;乙腈 － 0． 4%磷酸溶液(10∶ 90)为流动相;检测波长为
327 nm;柱温:40℃;理论板数按绿原酸峰计应不低于 1 200。
(2)供照品溶液的制备:精密称取适量的干膏细粉，加
50%甲醇 100 ml，超声处理 30 min，滤过，残渣及滤纸加适量
50%甲醇洗涤，合并滤液和洗液，浓缩至干，加甲醇适量使溶
解，转移至 10 ml，加甲醇至刻度，摇匀，即得。
·2951· 安 徽 医 药 Anhui Medical and Pharmaceutical Journal 2012 Nov; 16( 11)
(3)对照品溶液的制备:精密称取绿原酸对照品适量，加
甲醇制成每 1 ml含 10 μg的溶液，作为对照品溶液。
(4)线性范围的考察:精密称取绿原酸对照品约 5 mg，
置 10 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，精密移取 2
ml置 50 ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为贮备液。
精密量取贮备液 2、4、6、8、10 ml分别置 10 ml量瓶中，加甲醇
稀释至刻度，摇匀，备用。精密吸取对照品溶液 20 μl，分别注
入液相色谱仪，按色谱条件测定峰面积，以样品浓度(mg·
L －1)为横坐标(X) ，峰面积为纵坐标(Y)为纵坐标，绘制标准
曲线，计算回归方程。回归方程为 A = 65 008C － 7 999． 5，r =
0． 999 8(n = 5)。结果表明:绿原酸在 3． 95 ～ 19． 73 mg·L －1
范围内有良好的线性关系。
(5)药材含量的测定:根据参考文献测定方法，测得乌骨
藤药材中绿原酸含量为 0． 015%。
(6)样品测定及结果:取正交试验项下的干膏，分别研
细，照供试品制备方法制备样品。精密吸取供试品溶液及对
照品溶液 20 μl，分别注高效液相色谱仪，按外标法计算供试
品中绿原酸的含量，得出绿原酸的提取率，结果见表 2。
表 2 正交试验方案与结果
试验序号 A B C D 绿原酸提取率 /%
1 1 1 1 1 73． 46
2 1 2 2 2 78． 53
3 1 3 3 3 87． 07
4 2 1 2 3 81． 73
5 2 2 3 1 88． 27
6 2 3 1 2 77． 03
7 3 1 3 2 89． 2
8 3 2 1 3 78． 4
9 3 3 2 1 87． 47
Ⅰj
Ⅱj
Ⅲj
R
239． 06
247． 03
255． 07
16． 01
244． 39
245． 20
251． 57
7． 18
228． 89
247． 73
264． 54
35． 65
249． 20
244． 76
247． 20
4． 44
(7)方差分析:见表 3。
从极差 R的大小可知，各因素对乌骨藤提取效果的影响
程度依次为 C ＞ A ＞ B，以煎煮次数影响最大，加水量无显著
性差异，提取时间几乎没有影响，考虑到节省生产成本，选择
以 8 倍量水提取 3 次、每次 1 h更为合适，故选择最佳条件为
A2B1C3，即以 8 倍量水提取 3 次，每次 1 h。
表 3 方差分析结果
方差来源 离差平方和 自由度 均方 F值 显著性
A 42． 72 2 21． 36 12． 95 无
B 10． 31 2 5． 16 3． 12 无
C 212． 05 2 106． 03 64． 26 有
误差(D) 3． 30 2 1． 65
注:F0． 01(2，2)= 99． 00，F0． 05(2，2)= 19． 00，F0． 1(2． 2)= 9． 00，P
＜ 0． 05
2． 4 验证试验 取同批乌骨藤药材 500 g 3 份，分别按照正
交试验结果所确定的最佳条件进行实验，提取物浓缩成浸膏
后按照含量测定法进行绿原酸的含量检测，结果见表 4。
表 4 正交验证实验
批 次 生药量 / g 绿原酸提取率 /% 均值 /%
1
2
3
500
500
500
88． 29
88． 51
87． 48
88． 09
由此可见此工艺切实可行，故确定乌骨藤的最佳提取工
艺为:采用 6 倍量水提取 3 次，每次 1 h。
3 讨论
本实验通过正交实验考察了加水量、提取时间和提取次
数对乌骨藤水提的影响，通过对绿原酸的测定，采用直观分析
法与方差分析法，并结合工业生产的实际情况确定了最佳提
取工艺，结果表明该工艺简便、易行、稳定，为含有绿原酸制剂
的研究与开发和临床合理应用提取了实验依据。
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(收稿日期:2012 － 03 － 27)
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·3951·安 徽 医 药 Anhui Medical and Pharmaceutical Journal 2012 Nov; 16( 11)