全 文 ：研究报告
2008年第 34卷第 12期(总第 252期) 47　
高分子质量裂褶菌多糖的纯化及表征＊
周　林1 ,郭祀远2 ,郑必胜2
1(广东药学院生命科学与生物制药学院 ,广东 广州 , 510006)2(华南理工大学轻工与食品学院 , 广东 广州 , 510640)
摘　要　从裂褶菌发酵液中提取粗多糖 , 经 Sephacry l S-400 H R柱层析得到精制的裂褶菌多糖。凝胶柱层析
和 HPLC 法检测其为均一的组分。体积排阻色谱测得其重均分子质量(Mw)和数均分子质量(Mn)分别为 2.5
×107 u 和 1.2×107 u。由 H PLC、紫外光谱 、红外光谱分析可确定其为 β 葡聚糖。通过淀粉酶 、纤维素酶降解试
验以及 GC/MS 和13C NMR数据分析 , 确证其精细结构为β(1※3)主链上每隔3 个葡萄糖单元产生 1 个 β(1※6)
分支。经扫描电镜观察 , 所制备的高分子量裂褶菌多糖和细菌纤维素的表面形态十分相似 ,推断该高分子质量
的裂褶菌多糖有望应用于食品 、生物材料等领域。
关键词　裂褶菌多糖 , 分离纯化 ,结构鉴定 , 葡聚糖
第一作者:博士 ,讲师。
　＊广东药学院博士科研启动基金(No.2006SMK01)
收稿日期:2008-07-24
　　裂褶菌多糖(schizophy llan)是裂褶菌经深层发
酵产生的中性胞外多糖 ,由于其良好的抗肿瘤活性 ,
日本最早将其开发为抗肿瘤药物 。国内外对裂褶多
糖的分离纯化和结构已有报道[ 1 , 2] ,但由于菌种 、培
养条件等不同 ,各研究者所提取的裂褶多糖的分子质
量 、结构可能存在差异。而多糖的分子质量 、单糖组
成 、取代度等结构因素直接影响到多糖的生物学活性
及应用。目前已报道的裂褶菌多糖相对分子质量多
集中在 0.1×106 ～ 2.0×106 [ 1 ～ 4] 。前期研究发现 ,提
取的高分子量裂褶菌多糖表现出良好的吸湿和保湿
性能以及流变学性质[ 5 , 6] 。扫描电镜观察的结果也
提示 ,高分子量的裂褶多糖有可能开发成生物医学材
料或应用于食品 、造纸等工业 。文中对这种高分子量
裂褶多糖的纯化方法和结构进行了报道 ,为其进一步
的开发应用奠定基础 。
1　材料与方法
1.1　菌　株
裂褶菌(Schizophy l lum commune Fr.)菌株由
广东省微生物研究所提供 ,按照文献[ 1] 进行培养。
1.2　试剂与仪器
LD5-10 型离心机 ,北京医用离心机厂;Viva-
f low 50超滤系统 ,德国赛多利斯公司;Sephadex G-
100 , Sephacry l S -400 HR , Pharmacia 公司产品;
Dex tran系列标准品 ,Waters 公司产品;其余试剂为
国产分析纯。A LPHA2-4冷冻干燥机 ,德国 Christ
公司;HPLC ,美国 Waters公司;体积排阻色谱 ,美国
Waters公司;UV-2102PC 紫外可见分光光度计 ,上
海 UNICO 公司;Vecto r 33傅立叶变换红外光谱仪 ,
德国 Bruker 公司;Varian Saturn 2200 气相色谱-质
谱联用仪 , 美国 Varian公司;DRX-400超导核磁共
振分析仪 ,德国 Bruker 公司;S-550分析型扫描电
子显微镜 ,日本日立公司。
1.3　方　法
1.3.1　多糖的分离纯化
离心除去发酵液菌体(4 000 r/min , 20 min),将
清液适当稀释后加入 0.5%活性炭于 40℃恒温水浴
脱色 30 min ,除去活性炭后的发酵液于 60℃真空浓
缩 ,浓缩液经 Sevag 法[ V(CHCl3)∶V(正丁醇)=5
∶1]脱蛋白数次至有机溶剂层无絮状物 ,加入 2倍体
积体积分数为 95%的乙醇 , 4℃沉淀 24 h 得到粗多
糖 。采用柱层析进一步纯化 ,将 Sephacryl S -400
HR填料装填于 1.6 cm ×20 cm 层析柱中 ,以 0.05
mol/ L NaCl溶液洗脱 ,流速 0.5 mL/min ,每管收集
3 mL ,取少量收集液 490 nm 苯酚-硫酸法检测 OD
值 ,合并最大峰处的洗脱液 ,蒸馏水透析 24 h ,透析
液经 50 ku膜包浓缩约 10倍后进行冷冻干燥 ,得到
精制的裂褶菌多糖 SPG 。
1.3.2　纯度鉴定
1.3.2.1　凝胶柱层析
将 Sephadex G-100装于 1.6×20 cm 玻璃旋塞
柱并平衡 ,SPG 上样量 1 mg ,用双蒸水洗脱 ,每管收
集 3 mL ,流速 0.5 mL/min 。采用硫酸-苯酚法在490
nm 处隔管检测 OD 值。
1.3.2.2　高效液相色谱
DOI :10.13995/j.cnki.11-1802/t s.2008.12.003
食品与发酵工业 FOOD AND FERMENTAT ION IND USTRIES
48　 2008 Vol.34 No.12(Total 252)
采用 Wate rs高效糖柱(4.6 mm ×250 mm), 1
mg/mL SPG 进样量 20 μL ,柱温 40℃,流动相为双
蒸水 ,流速 1.0 ml/min ,Waters 2410 示差折光检测
器检测。
1.3.3　相对分子质量测定
采用 TSK G5 000 PWx l和 G3 000 PWx l两柱
依次串联 。将重均分子量(Mw)分别为 5200 , 11
600 , 23 800 , 48 600 , 148 000 , 273 000 , 410 000 , 668
000的标准 Dextran 相继进样 ,记录其洗脱体积(或
保留时间)。1 mg/mL S PG 上样量 20μL ,流动相为
0.02 mo l/L KH2 PO4 水溶液 ,流速 0.6 mL/min ,柱
温 40 ℃,记录其保留时间。利用随机 Breeze 软件计
算 SPG数均分子量 Mn和重均分子量 Mw 。
1.3.4　结构分析
1.3.4.1　单糖组成分析
取2 mg 精制的 SPG ,加入5 mL 2 mol/LH2 SO 4
溶液后封管 ,100 ℃水解 8 h , BaCO 3 中和 , 10 000 r/
min离心 10 min ,上清液真空浓缩 ,0.22 μm 微孔滤
膜过滤后进行高效液相色谱分析。色谱柱为 Agilent
糖柱(4.6 mm ×250 mm),流动相 V(乙腈)∶V(水)
=3∶1 ,流速 1.0 mL/min , 柱温 30 ℃。进样量 10
μL。在相同的色谱条件下对照单糖水解液和标准品
的保留时间(Rf)定性。每个样测 3次取平均值。标
准品为葡萄糖 、果糖 、木糖 、半乳糖 ,浓度均为 10 mg/
mL 。
1.3.4.2　酶　解
分别用 1 mL 淀粉酶和 1 mL 纤维素酶溶液作用
于 3 mL SPG 溶液 ,各溶液浓度均为 1 mg/mL。其
中 ,淀粉酶溶解于 pH6.8的磷酸盐缓冲液 ,纤维素酶
(绿色木霉)溶解于 pH4.5的柠檬酸盐缓冲液 ,均于
40 ℃保温 1 h。用 DNS 法测还原糖[ 7] ,空白参照样
用沸水浴 5 min灭活的酶液 。
1.3.4.3　紫外光谱分析
室温下用紫外可见分光光度计对一定浓度的
S PG溶液进行 190 ～ 600 nm 区域扫描 ,记录其扫描
曲线 。
1.3.4.4　红外光谱分析
将 2 mg 干燥的 SPG样品 ,与 100 ～ 200 mg 经干
燥的 KBr 粉末在玛瑙研钵中研磨均匀 ,压片机压成
薄片后在 4 000 ～ 500 cm-1扫描测定。
1.3.4.5　甲基化分析
取5 mg S PG ,按Ciucanu I 和Kerek F 方法[ 8] 进
行甲基化 ,用 1 mL 2 mo l/L 的 TFA 120℃水解 2 h ,
经 N aBH 4还原 ,乙酸酐-吡啶乙酰化 ,产物用 CH 2Cl2
溶解后进行 GC/MS 分析 。GC/MS 条件:Agilent
DB-5ms毛细管柱(30 m×0.25 mm ×0.25μm),载
气 He ,流量 1 mL/min ,柱温 60 ～ 250 ℃程序升温 5
℃/min ,进样器温度 250 ℃,进样量 1 μL 。气-质谱
联接通道温度为 250℃。EI 离子源温度 200℃,电子
能量 70eV 。
1.3.4.6　13 C NMR
13
C NMR:约 10 mg 样品 ,重水溶解。参考标准
为四甲基硅烷 ,5 mm 样品管 ,检测温度 23.5℃,累加
次数:15 000次。
1.3.5　扫描电镜观察
将充分干燥精制的裂褶多糖用蒸发镀膜法制备
电镜样品 ,置于扫描电镜的样品室中扫描分析 。调节
加速电压 5 kV , 放大倍数分别为×10 k和×30 k ,用
随机工作站进行拍摄 ,观察多糖表面的形态。仪器主
要技术指标:分辩率 0.6nm 、放大倍数 20 ～ 200 000 、
加速电压 1 ～ 30kV 。
2　结果与讨论
2.1　理化性质
乙醇沉淀的粗多糖呈白色絮状 ,冷冻干燥后的精
制多糖 SPG 呈白色纤维状 。冻干的样品在水中充分
溶涨后方可溶解 。经硫酸-苯酚试剂反应呈红色 ,而
碘反应未呈蓝色 ,表明其结构不同于淀粉 。
2.2　纯度及相对分子质量
图 1　SPG 在 190 ～ 600 nm 紫外吸收光谱
所制得的精制多糖 SPG经 Sephadex G-100柱
层析和 HPLC检测 ,均可得到对称的单峰 。紫外光
谱扫描未见明显的蛋白质或核酸的吸收 ,进一步说明
其为均一的多糖组分(图 1)。采用体积排阻色谱法
测得其数均分子量 Mn=1.2×107 ,重均分子量 Mw
=2.5×107 , Mw/Mn=2.1 ,表明样品分子量分布较
分散。说明所制得的精制多糖 SPG 分子量较大 ,其
主要原因可能是由于菌种和培养条件的不同。关于
研究报告
2008年第 34卷第 12期(总第 252期) 49　
发酵条件对裂褶菌多糖分子质量及其分布的影响则
有待进一步的研究。
2.3　结构分析
2.3.1　单糖组成和酶解实验
SPG 水解液的 Rf(9.807)与葡萄糖标准品的 Rf
(9.833)一致 ,表明 SPG 是一种葡聚糖 。淀粉酶 、纤
维素酶作用后经 DNS 法在 550 nm 测定 ,无还原糖
释放 ,初步判断其分子结构中无α(1※4)及 β(1※4)
糖苷键。
2.3.2　红外光谱
由图 2可知 ,SPG 在 3 600 ～ 3 200 cm-1的宽峰
是O-H 的伸缩振动 。没有氢键的二级 O-H 其吸
收峰一般在 3 630 cm-1附近 ,分子内的氢键在 3 560
cm-1附近 , 分子间的氢键在 3 400 cm -1以下 。而
S PG在 3 395 cm-1有一最大吸收峰 ,说明存在分子
间的氢键 。3 000 ～ 2 800 cm-1的一组较弱的峰是糖
类C-H 的伸缩振动 ,该区域的吸收峰是糖类的特征
吸收峰。1 400 ～ 1 200 cm-1的弱吸收带是 C-H 的
面外弯曲振动。1 200 ～ 1 000 cm -1的强吸收峰由两
种 C-O伸缩振动所产生 ,其中一种属于 C-O-H ,
另外一种是糖环的 C-O-C 。890 cm-1处吸收峰是
吡喃糖 β型 C-H 弯曲振动的特征吸收峰 。因此 ,红
外光谱可进一步表明 SPG 是一种 β型葡聚糖。
图 2　SPG 在 4 000 ～ 500cm -1红外吸收光谱
2.3.3　甲基化分析
SPG 经完全甲基化 、水解 、还原及乙酰化后得到
甲基化糖醇乙酸酯 ,利用 GC/MS 随机软件进行定性
分析 ,结果见表 1。通过峰面积可以计算出 2 , 3 , 4 ,6-
四甲基葡萄糖 , 2 , 4 , 6-三甲基葡萄糖 , 2 , 4-二甲基葡
萄糖对应的摩尔比约为 1∶2∶1 ,故可推断其结构为
β(1※3)主链上每隔 3个葡萄糖单元产生 1个 β(1※
6)分支 。
表 1　SPG的甲基化分析
Aldi tol acetate 摩尔比 Reten tion t ime Main f ragments(m/ z) linkage
2 , 3 , 4 , 6-四甲基葡萄糖 1.00 27.263 43, 45 , 71 , 101 , 117 , 129 , 161 , 205 1※
2 , 4 , 6-三甲基葡萄糖 2.06 29.554 43, 45 , 87 , 101 , 117 , 129 , 161 , 233 1※3
2 , 4-二甲基葡萄糖 0.94 32.923 43 , 45 , 87 , 117 , 129 , 189 1※3 , 1※6
2.3.4 　13C NMR
表 2　SPG的13C化学位移
Assigh ed C-1 C-3 C-5 C-3′ C-2′ C-2 C-6 C-4 C-6/ C-6′
Chemical shif t 103.60 87.05 76.83 75.26 74.33 73.16 70.65 69.12 61.57
Sub sti tu ted Y Y N N N N Y N N
　　注:C-1～ C-6 为主链碳原子 , C-2′、C-3′、C-6′为支链碳原子。
　　根据多糖的化学位移规律:糖环上发生取代的碳
的化学位移向低场变化;未发生取代的 C-2 、C-3 、
C-4的化学位移通常在 70 ～ 77ppm;未发生取代的
C-6通常位于 60 ～ 64ppm;发生取代后则位移至 67
～ 70ppm 。对糖环上各碳原子进行了归属 ,结果见表
2。结合上述分析可以确证所提取的裂褶多糖的结构
如下 。
2.4　扫描电镜结果
经冷冻干燥的样品放大 10k 时表面呈细密的丝
状 ,放大 30k可以观察到 SPG 为圆柱状 ,排列紧密 ,
圆柱体的直径约为 57nm 。通过对文献的分析 ,可以
发现 SPG的扫描电镜观察结果和细菌纤维素十分相
似[ 9 , 10] ,且两者都是微生物分泌的胞外多糖 。由于细
菌纤维素有很好的材料性能 ,且应用广泛[ 11] ,因此可
以推测该高分子量裂褶多糖有望应用于食品 、生物材
料等领域。
3　结　论
裂褶菌发酵液经离心除菌体 、活性炭脱色 、Sevag
食品与发酵工业 FOOD AND FERMENTAT ION IND USTRIES
50　 2008 Vol.34 No.12(Total 252)
法脱蛋白 、Sephadex G -100 柱层析 、蒸馏水透析以
及 50kDa 膜包浓缩 ,可获得均一的裂褶多糖 。通过
HPLC 、紫外光谱 、红外光谱的分析可以确定所制得
的多糖为 β-葡聚糖 。体积排阻色谱测得其重均分子
量和数均分子量分别为 2.5×107 和 1.2×107 。淀粉
酶 、纤维素酶降解试验提示可能不含α(1※4)及 β(1
※4)糖苷键 ,由 GC/MS 和13 C NMR数据进一步确
证其结构为:1 , 3-β-D 吡喃葡萄糖构成主链 ,主链上
大约每隔 3个葡萄糖分子有1个1 ,6连接的 β-D 吡
喃葡萄糖分支。扫描电镜观察的结果显示该高分子
量的裂褶多糖与细菌纤维素十分相似 ,推测其在食
品 、生物材料等方面有应用潜力 ,具体的应用还有待
进一步研究。
参 考 文 献
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Purification and Identification of High Molecular Weight Schizophyllan
Zhou Lin
1 , Guo Siyuan2 ,Zheng Bisheng2
1(College o f Life Science and Biolog ical Pharmacy , Guangdong Pha rmaceutical Univer sity , Guang zhou 510006 , China)
2(Co lleg e of Light Industry and Food Science , South China Univ ersity of Technology , Guang zhou 510640 , China)
ABSTRACT　C rude poly saccharide w as iso lated from the fermenta tion suspensions of Schizophyllum Com-
mune.After purif ied by Sephacryl S-400 HR , a homogeneous poly saccharide w as obtained identified by gel
filt ration and HPLC method.The w eight-averaged(Mw)and number-averaged (Mn)molecular weights o f
S chizophy llan measured by Size Exclusion Chromatog raphy(SEC)we re 2.5×107 and 1.2×107 daltons , re-
spectively.Schizophyllan have β-D-g lucan structure according to the UV 、IR spet rum and HPLC analysis.
The deg radation expe riment by amy lase and cellulase combined wi th the GC-MS and 13C NMR data show ed
that SPG was composed of β-1 ,3 glucan w ith sing le β-1 ,6 g lucosyl side chain linked to the main chain at every
three g luco se residues.The surface characteristic of the high mo lecula r Schizophyllan w as very simi lar o f that
of bacterial cellulose observed by Scan Electron M icroscopic(S EM), i t w as inferred the high molecular
S chizophy llan has applicat ion potential in the f ield of fo od and biomaterial.
Key words　Schizophy llan , iso lation and purification , st ructural identif ication , dex tran