全 文 ：荧光法猝灭测定木槿叶中混合氨基酸的总量
任凤莲 , 肖　劲 , 廖　律 , 宋　鸽
(中南大学化学化工学院 , 长沙 410083)
摘　要:在乙酸-乙酸钠缓冲介质中 , 氨基酸能猝灭壳聚糖-茚三酮体系荧光 , 基
于此 , 对木槿叶中混合氨基酸进行测定 , 并对该方法的测定条件进行了讨论。
线性范围为 0.5 ～ 3.0 mmol L , 检出限为 0.1 mmol L。木槿叶干粉中游离氨基酸
的质量分数为 10.18%, 相对标准偏差为 1.3%, 回收率为 102.5%～ 94.3%。
关键词:木槿叶;氨基酸;荧光猝灭法;壳聚糖
中图分类号:O657.39　　文献标识码:A　　　文章编号:1000-0720(2007)06-073-04
　　木槿(Hibiscus syriacus L.)是集药用 、食用 、
观赏 、绿化 、工业价值于一身的木本植物[ 1, 2] , 木
槿叶中含丰富的营养成分与无机元素[ 4] , 测定木
槿叶中的氨基酸对木槿的综合开发利用有一定的
意义 。
氨基酸与茚三酮反应生成 ruhemann s purple
(RP), 溶液呈蓝紫色 , 利用分光光度计在 565 nm
处测定其吸光度 , 可定量测定氨基酸 , 该方法灵
敏度高 , 已经广泛应用于氨基酸的测定[ 3 , 4] 。
RP可产生荧光 , 但由于 RP 荧光很弱 , 应用
时有一定的局限性。目前已有用金属离子和稀土
离子络合提高 RP 的荧光强度的报道[ 5] , 但荧光强
度仍较小 。
在一定条件下 , 壳聚糖与茚三酮相互作用产
生较强荧光[ 6, 7] , 加入氨基酸后 , 由于氨基酸与茚
三酮相互作用生成 RP , 可以有规律的猝灭该体系
荧光 , 基于此建立的新的氨基酸分析方法已有报
道[ 8] , 本文在此基础上 , 对该测定方法进行了改
进 , 并将其应用于木槿叶中游离氨基酸含量的测
定 , 测定准确度高 , 效果较好。
1　实验部分
1.1　仪器和试剂
FL-4500型荧光分光光度计(日本日立公司);
PHS-3C 型酸度计(萧山市鑫龙医疗仪器有限公
司)。
4.0 g L壳聚糖溶液:称取 0.400 g 的壳聚糖
(脱乙醚度大于 90%), 用稀乙酸溶液溶解后定容
到 100 mL , 用超声波匀质 10 min;50 mmol L 茚三
酮溶液:称取0.223 g 茚三酮 , 水溶解后定容于 25
mL棕色试剂瓶中 , 避光保存;10 mmol L氨基酸贮
备液:准确称取一定量氨基酸(国药集团化学试剂
有限公司 , 生化试剂), 水溶解后 , 定容至 100 mL ,
避光保存;HAc-NaAc缓冲溶液(pH 5.5)。
所用试剂均为分析纯 , 水为二次蒸馏水。
1.2　实验方法
于 25 mL比色管中依次加入 0.3 mL 茚三酮溶
液和 0.4 mL壳聚糖溶液 , 以 pH 5.5的 HAc-NaAc
缓冲溶液定容至 10 mL , 沸水浴 40 min , 室温下放
置 1 h后 , 于 340 nm 处激发 , 430 nm 处测量荧光
强度 F0 。
同时于另一支比色管中依次加入同样量的茚
三酮和壳聚糖 , 然后加入 1 mL 氨基酸溶液 , 其余
操作同上 , 测量荧光强度 F 。两者的差值 ΔF , 在
一定范围内与氨基酸含量成正比 。
2　结果与讨论
2.1　体系荧光光谱的考察和测定波长的选择
在乙酸-乙酸钠缓冲介质中 , 按照 1.2所述实
验方法 , 利用荧光分光光度计对壳聚糖-茚三酮体
系(空白体系)和壳聚糖-茚三酮-谷氨酸测定体系
进行波长扫描 。设定 λem=425 nm , 波长范围250 ～
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第 26 卷第 6期
2007 年 6月 　　　　　　　　　　　　 分析试验室Chinese Journal of Analy sis Laboratory　　　　　　　　　　　　Vol.26.No.62007-6
收稿日期:2006-06-20;修订日期:2006-09-01
作者简介:任凤莲(1945-), 女 , 教授
DOI :10.13595/j.cnki.issn1000-0720.2007.0174
400 nm;λex =340 nm , 波长范围 360 ～ 600 nm , 分
别进行激发和发射光谱扫描 。扫描速度 240
nm min , 狭峰宽度 2.5 nm , 扫描电压 700 V , 结果
如图 1所示。
结果表明 , 壳聚糖-茚三酮荧光体系的荧光光
谱为一个很强的单峰 , 激发和发射波长分别为 340
和430 nm , 在相同的实验条件下 , 茚三酮无荧光 ,
而壳聚糖仅在 414 nm 处有很弱的荧光 , 对体系无
影响 , 体系中加入氨基酸后 , 光强明显降低 , 吸收
峰没有移动 , 可在此处进行定量测定 。
图 1　空白以及加入氨基酸后荧光体系的激发发射光谱图
Fig.1　Excitation and emission spectra
1-测定体系;2-空白体系
2.2　氨基酸对体系荧光的猝灭情况及氨基酸标准
的选择
分别配制 2 mmol L 的谷氨酸 、色氨酸 、酪氨
酸 、苯丙氨酸 、赖氨酸和白氨酸溶液 , 在 λex 250 ～
450 nm和 λem 250 ～ 550 nm 范围内进行 3D扫描 ,
狭缝宽2.5 nm , 扫描速度1200 nm min , 扫描步长5
nm , 研究不同测定体系的出峰情况 , 并在 340 nm ,
430 nm处进行定量测定 , 比较不同氨基酸对壳聚
糖-茚三酮体系荧光的猝灭情况 , 如表 1和表 2所
示。
表 1　不同壳聚糖-茚三酮-氨基酸体系的出峰情况
Tab.1　The appearance situation of different chitosan-nin-
hydrin-amino acid systems
氨基酸 出峰位置λex/ nm λem/ nm
空白溶液 340 430
谷氨酸 340 430
色氨酸 340(285) 435(370)
白氨酸 365 455
酪氨酸 345(280) 440(325)
赖氨酸 345 435
苯丙氨酸 340 440
表2　氨基酸对空白体系荧光猝灭效果的比较
Tab.2　Comparison of the quenching effect of different amino acids on the blank system
氨基酸 空白溶液(F0) 谷氨酸 赖氨酸 色氨酸 苯丙氨酸 酪氨酸 白氨酸
荧光强度(F)
ΔF 423.5
286.8
136.7
291.2
132.3
288.5
135.0
293.1
130.4
289.4
134.1
295.3
128.2
　　由表 1可知 , 加入谷氨酸后的溶液和空白溶
液的相比 , 峰没有位移 , 而其它氨基酸 , 除了白氨
酸峰位置离空白溶液峰位置较远外 , 均与此峰一
致。色氨酸和酪氨酸本身具有较强天然荧光 , 3D
扫描图上出现小峰 , 但此峰离测定峰位置较远 ,
且当溶液浓度降低后 , 小峰不再出现 , 对测定影
响不大。
表2可以看出 , 在激发波长340 nm , 发射波长
430 nm处进行定量荧光测定 , 所得 6 种氨基酸对
壳聚糖-茚三酮荧光体系荧光猝灭值接近。研究表
明 , 含有仲氨基的氨基酸荧光猝灭效果比较好[ 9] ,
但在天然氨基酸中 , 只有组氨酸 , 脯氨酸和色氨
酸含有仲氨基 , 且它们在天然产物中含量较低 ,
且色氨酸在提取过程中易被酸破坏 。谷氨酸有伯
氨基 , 能代表大部分氨基酸 , 且木槿叶中谷氨酸
的量最高 , 占氨基酸总量的 14%左右[ 10] 。故实验
确定谷氨酸为标准 。
2.3　实验条件的讨论
2.3.1　荧光体系稳定性及冷却时间的考察　空白
体和测定体系在沸水浴中加热 , 室温冷却 1 h后 ,
荧光强度同时达到稳定 , 荧光强度差最大 , 并且
在 2 h内基本保持不变 , 实验选择冷却 1 h后进行
测定 。
2.3.2　水浴加热时间　按照 1.2所述方法 , 在其
他实验条件不变的情况下 , 改变空白体系和测定
体系水浴加热时间 , 结果如图 2所示。
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图 2　加热时间对 ΔF 的影响
Fig.2　The effect of heating time on the ΔF
1-测定体系;2-空白溶液
在加热 40 min之前空白体系荧光强度随着加
热时间的增加而增大 , 40 min 后空白体系反应完
全 , 荧光强度趋于稳定 , 而随着加热时间的延长 ,
加入氨基酸后的体系荧光强度逐渐增大 , 35 ～ 40
min时两体系荧光强度差最大。实验表明 , 加热 40
min , 可获得最大荧光强度差 , 有利于定量分析 。
2.3.3　pH 的影响
荧光体系分别用不同 pH 乙酸-乙酸钠缓冲溶
液定容 , 考察 pH对体系荧光强度和它们荧光强度
差的影响 , 如图 3所示。
图 3　pH 对 ΔF 的影响
Fig.3　The effect of acidity on the ΔF
1-测定体系;2-空白溶液
　　当乙酸-乙酸钠缓冲溶液的 pH 低于 4.6时 ,
空白溶液的出峰位置发生位移 , 荧光强度明显偏
低 , 甚至比加了谷氨酸后的体系荧光强度还小 。
随着 pH 升高 , 溶液出峰位置回到测定波长处 ,
F 0 、F 、ΔF 随之增大。当pH升高到 5.68以上后 ,
溶液呈现 RP的浅紫色 , 溶液发射峰明显紫移 。实
验还发现当溶液 pH大于 6.5时 , 壳聚糖溶液形成
絮状沉淀 , 影响反应和测定。所以选择 pH 为 5.5
的乙酸-乙酸钠缓冲溶液是最合适的 。
2.3.4　试剂加入量　在一定条件下 , 随着壳聚糖
和茚三酮用量的增加 , ΔF 增大 , 但当试剂用量增
大到一定程度后 , ΔF 逐渐减小 , 特别是随着茚三
酮加入量增加 , 溶液呈紫色 , 最大激发和发射波
长明显发生位移 , 荧光强度明显偏低 , 已无定量
关系 。实验表明 , 壳聚糖和茚三酮的用量分别为
0.4 mL和 0.3 mL时 ΔF 最大 , 且线性关系较好 。
2.4　方法的标准曲线及检出限
按照实验方法进行氨基酸的测定和标准曲线
的绘制 , 结果发现氨基酸浓度在 0.5 ～ 3.0 mmol L
范围内线性关系较好 , 测定的线性方程为 ΔF =
6.16+63.5c (mmol L), 相关系数为 0.9994。选用
工作曲线最低值 0.5 mmol L 的标准溶液测定 11
次 , 根据测定的标准偏差和测量平均值 , 计算出
方法检出限为 0.1 mmol L。
3　样品测定
3.1　样品的预处理
取 10 g木槿叶干粉 , 6 mol L HCl加热回流数
小时 , 抽滤 、活性炭脱色后 , 得到浅黄绿色透明溶
液 , 取 2 mL 定容至 50 mL。
3.2　样品的测定及精密度的考察
按照前面所述的操作过程 , 取同一待测样品5
份 , 对木槿叶中的氨基酸进行测定 , 并考察方法
的精密度 , 结果如表 3所示。
表 3　样品测定结果和精密度
Tab.3　Determination results of precision and samples
样品 测定荧光强度 F 空白荧光强度 F0 ΔF 样品浓度 c (mmol L) w % 平均值 w % RSD %
1 318.4 105.8 1.569 10.10
2 319.2 105.0 1.556 10.02
3 317.9 424.2 106.3 1.577 10.15 10.18 1.3
4 315.4 108.8 1.616 10.40
5 317.1 107.1 1.590 10.24
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　　实验测得木槿叶干粉中游离氨基酸的质量分
数为 10.18%, 精密度实验表明 , 该方法比较稳
定 , 相对标准偏差小。
3.3　回收率实验
加入 2 mL 待测溶液至 50 mL 容量瓶中 , 同时
在1 ～ 3号容量瓶中加入 5 mg 谷氨酸 , 4 ～ 6 号容
量瓶中加入 7.5 mg谷氨酸 , 用二次蒸馏水定容至
50 mL , 按上述方法进行测定 , 结果表明在测定过
程中氨基酸回收率在 102.5%～ 94.3%之间 , 氨基
酸损失很少。
表 4　谷氨酸的回收率
Tab.4　Recovery of glutamic acid
样品 测量值 c (mmol L) 标准加入量 c (mmol L) 实测量 c (mmol L) 回收率 % RSD %
1 1.564 2.261 102.5 3.5
2 1.558 0.6798 2.231 99.3
3 1.586 2.227 94.3
4 1.570 2.571 98.1 2.1
5 1.551 1.020 2.585 101.4
6 1.568 2.551 97.4
4　结论
利用茚三酮与壳聚糖生成一种荧光较强的荧
光物质以及氨基酸对该荧光物质的猝灭建立了一
种氨基酸的分析方法 , 并对木槿叶中氨基酸进行
了测定 。激发波长和发射波长分别为 340和 430
nm , 茚三酮和壳聚糖的加入量分别为 0.3和 0.4
mL , 用 pH 5.5的乙酸和乙酸钠缓冲溶液 , 水浴加
热40 min后 , 冷却 1 h , 测定荧光强度差 。本方法
在0.5 ～ 3.0 mmol L范围内线性关系较好 , 其测定
回收率为 102.5%～ 94.3%, 测得木槿叶中游离氨
基酸的质量分数为 10.18%, RSD为 1.3%。
参考文献
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Fluorescence quenching spectrophotometry for determination of mixed amino acids in hibiscus syriacus L.
Leaves
REN Feng-lian , XIAO Jin＊ , LIAO Lǜ and SONGGe(School of Chemistry and Chemical Engineering , Central South
University , Changsha 410083), Fenxi Shiyanshi , 2007 , 26(6):73 ～ 76
Abstract:The mixed amino acids from Hibiscus syriacus L.leaves have been determined , which was based on fluores-
cence quenching effect by adding amino acid into the reaction system of chitosan and ninhydrin.The linear range for
determination of amino acid was 0.5 ～ 3.0 mmol L , the limit of detection was 0.1 mmol L.The total content of free
amino acid in Hibiscus L.leaves was 10.18%, coefficient of variation was 1.3%and the recoveries of glutamic acid
were in the range of 102.5%～ 94.3%.
Keywords:Hibiscus syriacus L.leaves;Amino acid;Fluorescence quenching spectrophotometry;Chitosan
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