全 文 ：分子植物育种，2016年，第 14卷，第 2期，第 396-402页
Molecular Plant Breeding, 2016, Vol.14, No.2, 396-402
研究报告
Research Report
基于分子标记稳定性的甜叶菊组培苗 DNA提取方法优化
何克勤 1 李艳阳 1 胡能兵 1* 崔广荣 1 周玉丽 2
1安徽科技学院农学院,凤阳, 233100; 2安徽科技学院生命科学学院,凤阳, 233100
*通讯作者, hunengbing@126.com
摘 要 本试验采用甜叶菊组培苗叶片为材料，以 RAPD分子标记检验水浴温度与时间、取样重量以及优
化步骤等三个 DNA提取影响因素，进而以 SRAP和MSAP分子标记技术对 RAPD结果进行验证，以提高甜
叶菊组培苗 DNA提取效率。结果表明，水浴温度、时间为 70℃ 30 min (A2)，取样量为 0.1 g (B2)时，提取到常
规步骤⑨的上清液 V(C4)即可满足常规分子标记要求，且提取时间可减少 1 ~1.5 h。
关键词 甜叶菊, DNA提取,分子标记
Optimization of DNA Extraction Method of Tissue Culture Seedlings in
Stevia rebaudiana Bertoni Based on Molecular Marker Stability
He Keqin 1 Li Yanyang 1 Hu Nengbing 1* Cui Guangrong 1 Zhou Yuli 2
1 College of Agriculture, Anhui Science and Technology University, Fengyang, 233100; 2 College of Life Sciences, Anhui Science and Technology
University, Fengyang, 233100
* Corresponding author, hunengbing@126.com
DOI: 10.13271/j.mpb.014.000396
Abstract In this experiment, using leaves of tissue culture seedlings of Stevia rebaudiana Bertoni as materials,
three DNA extraction factors, namely, bath temperature and time, sample weight and optimization steps were
tested by RAPD molecular marker, and further by SRAP and MSAP molecular markers to improve the DNA
extraction efficiency. The results showed that, water bath temperature and time of 70℃ for 30 min (A2), sampling
weight of 0.1g (B2) and extract supernatants V (C4) of conventional steps ⑨ could meet the requirements of the
conventional molecular markers and extraction time could be reduced 1~1.5 h.
Keywords Stevia rebaudiana Bertoni, DNA extraction, Molecular marker
基金项目：本研究由安徽科技学院青年基金(ZRC2014430)和 2014年安徽省大学生创新创业训练计划项目共同资助
甜叶菊(Stevia rebaudiana Bertoni)又称甜菊、蜜
菊，是菊科多年生短日照草本植物，其叶片中含有的
甜菊糖苷具有甜度高(是蔗糖 300 倍以上)、热量低
(是蔗糖的 1/300)、安全易吸收等特点，被世界公认为
最有开发价值和前途的天然甜味添加剂。因此，自八
十年代初在我国引种栽培成功以来，甜叶菊新品种
选育及种质创新已经引起广大学者们的高度重视(杨
文婷等, 2010;董振红, 2015)。然而，作为一种异花授
粉植物，甜叶菊后代不能保持亲本的原有优良性状，
导致国内甜叶菊品种的优良性状退化，给传统的田
间杂交新品种选育带来困难，而采用离体快繁结合诱
变技术既有助于保持材料的优良种性，亦是开展甜叶
菊生物技术育种的基础(李红, 2013;朱琼琼, 2011)。
任何物种都具有特定结构和顺序的 DNA，而快
速提取高质量的 DNA是开展分子生物学研究方面
工作的前提。目前，DNA分子标记已广泛运用于遗
传多样性检测、遗传图谱构建、基因定位、系谱分析
及品种鉴定，有助于提高育种效率(田广厚, 2008;文
亚峰和何钢, 2007;李雪林等, 2004;孙振久等, 2006)。
影响 DNA提取的因素很多，徐建堂等(2007)用 CTAB
法提取红麻总 DNA技术优化研究中，提取中加 β-
巯基乙醇、使用 2.5% CTAB可获得高质量 DNA；王
岩等(2006)研究辣椒叶片 DNA提取方法的优化中，
在 CTAB中加 0.2%二硫苏糖醇可有效防止酚类物
质氧化，所提 DNA的质量和得率均较高，能够达到
各种分子标记等研究技术的要求。
表 1 DNA检测
Table 1 Biophotometer plus detection
编号
Number
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
OD260/280
1.01
1.43
1.53
0.78
1.04
1.01
1.64
1.56
2.06
2.12
1.97
1.90
1.94
1.86
1.81
浓度(ng/μL)
Concentration (ng/μL)
554.40
53.20
79.30
52.30
795.10
428.30
1 098.90
1 195.80
502.20
240.40
235.60
225.00
66.10
99.40
255.30
编号
Number
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
OD260/280
1.08
0.98
1.46
1.52
1.46
1.45
1.99
1.86
1.98
1.88
1.76
1.85
1.79
1.79
1.98
浓度(ng/μL)
Concentration (ng/μL)
1 437.90
410.80
70.50
684.90
1 057.70
1 103.00
239.90
355.50
631.70
89.50
137.00
213.10
72.30
90.50
383.50
编号
Number
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
OD260/280
1.06
0.95
0.98
1.52
1.24
1.52
2.00
1.94
1.96
1.90
1.84
1.87
1.81
1.75
1.77
浓度(ng/μL)
Concentration (ng/μL)
918.20
261.40
361.00
816.30
874.70
1 068.70
237.50
327.40
615.70
90.90
108.90
223.10
68.50
83.50
212.20
图 1 DNA琼脂糖电泳图谱
Figure 1 DNA agarose gel electrophoresis
关于甜叶菊 DNA提取方法的研究鲜有报道，本课题
组甜叶菊 DNA的提取现用胡能兵等(2011)改良 CT-
AB法，整个提取步骤需要近 4个小时，花费时间较
多。基于此，本试验拟从叶片重量、水浴温度及时间、
优化提取步骤等三个方面开展甜叶菊组培苗 DNA
提取质量的影响因素的研究，并运用 RAPD、SRAP
以及MSAP等分子标记技术予以验证，以筛选出更
合适的甜叶菊组培苗 DNA提取方法。
1结果与分析
1.1核酸蛋白测定仪检测
纯 DNA的 OD260/280比值为 1.8，比值为 1.8左右
进行分子标记检测时，图片较为清晰，如果比值较低
说明受到了蛋白质或酚类物质的污染；比值较高说
明 RNA的含量较高(Reyna-López, 1997)。水浴 65℃
45 min、70℃ 30 min和水浴 80℃ 20 min时，不管取
样量的多少，提取步骤的水平 C1、C2 时，即样品
1-6、16-21、31-36DNA 的 OD260/280 比值远小于 1.8，
且电泳看不到条带；而提取步骤的水平 C4、C5时，即
9-15、24-30、39-45DNA 的 OD260/280 比值接近于 1.8
(图 1;表 1)。
1.2水浴温度和时间的 RAPD分子检测
在相同的优化步骤和取样量条件下，随着温度
和处理时间的不同，条带的清晰度呈现增加的趋势
(图 2)。除了在优化步骤 C1、C2均未检测到扩增出条
带(1-6; 16-21; 31-36)，以水浴 70℃ 30 min 和 80℃
20 min时扩增后检测 DNA条带较为清晰(图 2中的
A2, A3)，其中，尤以 70℃ 30 min的处理无明显拖尾。
1.3不同取样量的 RAPD分子检测
在相同的优化步骤中和水浴温度条件下，随着
取样量的增大，DNA扩增量也随之增大，表现为条
带更清晰、更粗(图 3)。不同取样量时，条带都是在提
取步骤为 C3 时开始出现(7-9; 22-24; 37-39)，且在
C4 (10-12; 25-27; 40-42)和 C5 (13-15; 28-30; 43-45)
时表现得更为清晰。综合比较不同取样量后 RAPD扩
基于分子标记稳定性的甜叶菊组培苗 DNA提取方法优化
DNA Extraction Method of Tissue Culture Seedlings in Stevia rebaudiana Bertoni Based on Molecular Marker Stability 397
分子植物育种
Molecular Plant Breeding
图 2不同水浴温度、时间扩增的 RAPD图谱
Figure 2 Amplification RAPD profile with different water tem-
peratures and time
图 3不同取样量扩增的 RAPD图谱
Figure 3 Amplification RAPD profile with different weight
图 4不同优化步骤扩增的 RAPD图谱
Figure 4 Amplification RAPD profile with different optimization
steps
图 5 SRAP引物 F3R3(左), F5R4(中), F6R7(右)扩增不同样品图
Figure 5 Amplification SRAP profile with primers of F3R3 (left),
F5R4 (middle), F6R7 (right)
增的结果，取样量以 0.1 g (B2)或 0.2 g (B3)较为合适。
1.4 DNA提取步骤优化的 RAPD分子检测
在提取步骤的 5个水平下，C1、C2在不同水浴
温度、时间和取样量的情况下均未检测到 DNA条带
(图 4)，可能由于提取液中蛋白质和脂肪含量较高、
DNA含量较少以及纯度不高所致。C3、C4、C5均有类
似的条带检测出，但 C4、C5条带的亮度优于水平 C3。
1.5基于 SRAP稳定性的分子检测
在 RAPD分子标记基础上，以水浴温度与时间、
取样重量以及优化步骤三个因素的优化，综合考虑
样本量以 0.1 g、水浴温度和时间以 70℃ 30 min为合
适。由于在提取步骤优化时，从 C3到 C5均出现类
似的条带。因此，分别以 SRAP和MSAP对提取步骤
进一步验证。
以常规的 0.1 g、65℃ 45 min 的 C3-C5 步骤为
对照，比较其与 0.1 g、70℃ 30 min的 C3-C5之间的
差异(图 5)。在 3个引物中，尽管 0.1 g、65℃ 45 min
的 C3(8)、C4(11)和 C5(14)与 0.1 g、70℃ 30 min 的
C3(23)、C4(26)和 C5(29)主条带基本保持一致，但也
存在扩增量变少(图 5中箭头 a所示)、条带缺失(图 5
中箭头 b所示)以及条带增加(图 5中箭头 c所示)的
情况，即 0.1 g、65℃ 45 min处理在 3个提取步骤的
遗传稳定性要低于 70℃ 30 min的 3个处理，而后者
无论从条带清晰度、条带的数量等方面都保持较好
的一致性。
1.6基于MSAP稳定性的分子检测
HpaⅡ和 MspⅠ为同裂酶，尽管它们都能够识别
并切割 5-CCGG序列，但对该位点胞嘧啶的甲基
化的反应不同，酶切产物经 PCR 扩增后产生多态
性，这就是 DNA甲基化扩增敏感多态性(MSAP)技
术的原理。
以常规的 0.1 g、65℃ 45 min 的 C3-C5 步骤为
对照，比较其与 0.1 g、70℃ 30 min的 C3-C5之间的
差异(图 6)。在 3个引物中，无论是用 HpaⅡ或 MspⅠ
进行酶切，其多态性条带与其它处理的一致性、条带
清晰度、条带的数量等都以处理 26为最好(图中红色
箭头所示)，即提取物为 0.1 g时，70℃ 30 min条件下
以 C4(26)步骤即可满足MSAP的要求。
2讨论
DNA是染色体的主要组成部分，是生物遗传信
398
基于分子标记稳定性的甜叶菊组培苗 DNA提取方法优化
DNA Extraction Method of Tissue Culture Seedlings in Stevia rebaudiana Bertoni Based on Molecular Marker Stability
图 6 MSAP引物 E3H2(左), E3H3(中), E4H3(右)检测的的甲基化类型
注: H和M分别表示由 EcoRⅠ-HpaⅡ和 EcoRⅠ-MspⅠ切割的位点
Figure 6 Methylation patterns that were detected using the primer combination E3H2 (left), E3H3 (middle) and E4H3 (right)
Note: The letter H and M indicating the enzyme sites that were cut with EcoRⅠ-HpaⅡ and EcoRⅠ-MspⅠ, respectively
息的载体和遗传物质的基础，其中，核 DNA占植物
全部遗传物质的 90%以上，而细胞核中 DNA大部分
是以 DNA-蛋白复合物的形式存在，因此，去除蛋白
质是 DNA提取首要的任务。除此之外，酚类、糖类以
及脂肪等大分子也是植物 DNA提取时所要考虑的
影响因素。
目前，DNA 提取以 CTAB 法和 SDS 法较为常
见，上述两种方法的原理不同。CTAB是一种阳离子
去污剂，可以与核酸结合，从而实现与蛋白质分离的
目的，且该 CTAB-核酸复合物在低盐溶液中因溶解
度降低而沉淀，能够实现与多糖予以分离，因此是最
为常见的 DNA提取方法。SDS法是另一种经典的
DNA提取方法，它主要是通过破坏蛋白质的次级键
从而引起天然构象的解体，进而使核基因组得以释
放，但该方法提取的多糖较多(孙璐宏等, 2010;易庆
平等, 2007;刘红艳, 2014)。
甜叶菊作为一种新型食品添加剂，其糖苷含量
比较高，因此，本试验选用 CTAB法开展研究。此前，
基于该方法所做的研究，也取得了比较理想的结果，
但该方法所耗费时间比较长(胡能兵等, 2011; 周玉
丽等, 2014;胡能兵等, 2012;何克勤等, 2012a; 2012b)。
本试验以甜叶菊组培苗为材料，从提高水浴温度、降
低水浴时间、优化提取步骤以及提取物质量等方面
考虑，以对 DNA质量要求较低的 RAPD分子标记进
行初步验证，进而以 SRAP、MSAP等两种方法对结
果进行进一步验证，其中，由于 MSAP是以 AFLP技
术演化而来，对 DNA的浓度和质量要求较高(Xiong
et al., 1999)。结果表明，水浴 65℃ 45 min、70℃ 30 min
和水浴 80℃ 20 min 时，70℃ 30 min 处理无明显拖
尾，要优于其它时间和温度的组合。在提取步骤方
面，经过 RAPD分子标记验证的 45个处理，都是在
步骤 C3时出现条带，且步骤 C4、C5条带的亮度优
于步骤 C3。步骤 C2处理是 DNA经过两次氯仿去
除蛋白质，而步骤 C3处理则是在步骤 C2的基础上
用 75%乙醇去除盐离子，而 RAPD验证时步骤 C2
无条带出现、步骤 3 时出现条带，进一步表明盐离
子对后续分子标记技术的干扰；取样量方面，尽管
试验表明 0.2 g时扩增后检测条带较粗、较清晰，但
甜叶菊组培苗单株的叶片重量较难达到 0.2 g的水
平，因此，以取样量为 0.1 g较适合甜叶菊组培苗的
DNA的提取时质量。在上述优化条件下，可减少提
取时间 1~1.5 h。
3材料与方法
3.1试验材料
甜叶菊为安徽科技学院农学院组织培养室提供
的“B1”试管苗。
3.2试验试剂
RAPD 随机引物、SRAP 引物和 MSAP 引物由
上海生工生物工程有限公司合成；Taq DNA 聚合
酶(5 U/μL)、dNTPs、Marker 等购于北京康为世纪
有限公司。
3.3试验方法
3.3.1甜叶菊 DNA提取常规步骤
①取幼嫩叶片，液氮研磨，加 20 μL巯基乙醇+
1 000 μL CTAB提取液，水浴加热。
399
分子植物育种
Molecular Plant Breeding
表 2甜叶菊 DNA样品编号
Table 2 The DNA number of Stevia rebaudiana Bertoni
项目
Items
C1 (上清液Ⅱ)
C1 (SupernatantⅡ)
C2 (上清液Ⅲ)
C2 (SupernatantⅢ)
C3 (DNA溶液Ⅳ)
C3 (SupernatantⅣ)
C4 (上清液Ⅴ)
C4 (SupernatantⅤ)
C5 (DNA溶液Ⅵ)
C5 (SupernatantⅥ)
B1 (0.05 g)
1
4
7
10
13
B2 (0.1 g)
2
5
8
11
14
B3 (0.2 g)
3
6
9
12
15
B1 (0.05 g)
16
19
22
25
28
B2 (0.1 g)
17
20
23
26
29
B3 (0.2 g)
18
21
24
27
30
B1 (0.05 g)
31
34
37
40
43
B2 (0.1 g)
32
35
38
41
44
B3 (0.2 g)
33
36
39
42
45
A1 (65℃水浴 45 min)
A1 (65℃ water bath 45 min)
A2 (70℃水浴 30 min)
A1 (70℃ water bath 30 min)
A3 (80℃水浴 20 min)
A3 (80℃ water bath 20 min)
②将水浴好的样品冷至常温，10 000 r/min，20℃
离心 12 min。
③将上清液Ⅰ倒入离心管中，加入等体积的酚：
氯仿：异戊醇，充分混匀，12 000 r/min，4℃离心 10min。
④取上清液Ⅱ，加入一定体积的氯仿：异戊醇，
混匀，12 000 r/min，4℃离心 10 min。
⑤取上清液Ⅲ，加入 2倍预冷无水乙醇，摇匀，
12 000 r/min，4℃离心 10 min。
⑥倒去上清液，沉淀用 75%乙醇洗涤 1~2次，风
干，用 100 μL TE溶解，为 DNA溶液Ⅳ。
⑦加入 20 μL 1 mg/mL的 RNase，溶解后放在
37℃水浴 30 min。
⑧加入等体积氯仿：异戊醇，混匀，12 000 r/min，
4℃离心 10 min。
⑨取上清液 V，加入 2×预冷无水乙醇摇匀，
12 000 r/min，4℃离心 10 min。
⑩沉淀用 75%乙醇洗涤 1~2次，风干后用 100μL
TE溶解，为 DNA溶液Ⅵ。
3.3.2试验设计
试验分别从水浴条件(A)、取样质量(B)、提取步
骤(C)等三因素来优化。其中，水浴条件设 65℃ 45 min
(A1)、70℃ 30 min (A2)、80℃ 20 min (A3)三水平；取
样质量设 0.05 g (B1)、0.1 g (B2)、0.2 g (B3)三水平；
提取步骤为五水平，具体为：步骤④的上清液Ⅱ
(C1)、步骤⑤的上清液Ⅲ(C2)、步骤⑥的 DNA溶液Ⅳ
(C3)、步骤⑨的上清液Ⅴ(C4)、步骤⑩的 DNA溶液Ⅵ
(C5)。试验为三因素所有水平的全试验组合，共 45
个设计(表 2)。
3.3.3 DNA的分光光度计检测
用移液器移取待测样 3 μL滴入微量比色皿中
进行检测，读取波长 260 nm与 280 nm吸光度的比
值(OD260/280)和浓度值。
3.3.4 DNA样品的 RAPD检测
用于 RAPD扩增的引物“B”(序列为 5-GGGAA
GAGCC-3)，RAPD反应体系为 13.6μLddH2O、3.0μL
Buffer、1.2 μL dNTP、1.0 μL 引物、1.0 μL DNA 模
板、0.2 μL Taq 聚合酶，PCR 反应程序为：94℃预变
性 4×60 s、94℃变性 30 s、35℃退火 30 s、72℃延伸
60 s、40个循环，72℃延伸 7×60 s，扩增后放入 4℃
冰箱中保存(胡能兵等, 2011)。琼脂糖凝胶浓度为
1.2%，取扩增后样品 4 μL点入琼脂糖凝胶梳孔中，
100 V恒压电泳 1.5 h后放入凝胶成像系统中进行观
察、照相。
3.3.5 DNA样品的 SRAP、MSAP检测
以 RAPD结果为基础，筛选出合适的甜叶菊组
培苗 DNA提取体系。进而以优化后的 DNA样品进
行 SRAP和MSAP检测(表 3)。具体为：
用于 SRAP扩增的引物组合为：F3R3 (5-TGAG
TCCAAACCGGAAT-3与 5-GACTGCGTACGAAT
TGAC-3)，F5R4 (5-TGAGTCCAAACCGGAATG-3
与 5-GACTGCGTACGAATTTGA-3)，F6R7(5-TGA
GTCCAAACCGGTAG-3与 5-GACTGCGTACGAA
TTATG-3)，SRAP反应体系为 12.3 μL ddH2O、3.0 μL
Buffer、1.2 μL dNTPs、前后引物各 0.75 μL、1.0 μL
DNA 模板、1.0 μL Taq 聚合酶，PCR 反应程序为：
94℃变性 60 s、35℃退火 60 s、72℃延伸 60 s，5个循
环，94℃变性 60 s、50℃退火 60 s、72℃延伸 60 s，35
个循环，72℃延伸 10× 60 s，扩增后放入 4℃冰箱中
保存。聚丙烯酰胺凝胶浓度为 6%，取扩增后样品 4μL
进行电泳，180 V恒压电泳 4 h后进行银染、照相(徐
400
表 3接头和引物序列
Table 3 Sequence of adaptor and primers
接头 /引物
Adaptor/Primer
接头
Adaptor
预扩增引物
Pre-amplification primer
EcoRⅠ (E) (5-3)
CTCGTAGACTGCGTACC
AATTGGTACGCAGTC
GACTGCGTACCAATTCA (E0)
GACTGCGTACCAATTCAAG (E3)
GACTGCGTACCAATTCACT (E4)
HpaⅡ-MspⅠ(HM) (5-3)
GATCATGAGTCCTGCT
CGAGCAGGACTCATGA
ATCATGAGTCCTGCTCGGT (H0)
ATCATGAGTCCTGCTCGGTAC (H2)
ATCATGAGTCCTGCTCGGTCC (H3)
序列
Sequence
德昌等, 1997)。
MSAP 试验步骤等参照 Reyna-López 等 (1997)
方法并做了略微的调整。接头和引物序列见下表，所
用的双酶切组合为 EcoRⅠ/HpaⅡ(MspⅠ)。过程包括
酶切、连接、预扩增和选择性扩增等四个步骤，具体
为：酶切体系(20 μL)：10 μL模板 DNA，5 U EcoRⅠ，
10 U的 HpaⅡ或 MspⅠ，2 μL的 10× Tango Buffer。
上述反应体系置于 37℃酶切 3 h，然后置于 65℃灭
活 10 min，备用。
连接体系(40 μL)：在上述酶切体系的基础上，加
入 5 pmol EcoRⅠ接头，50 pmol HpaⅡ-MspⅠ接
头，5 U的 T4 DNA连接酶和 2 μL 10× Tango Buffer。
上述反应体系置于 16℃连接过夜(12 h)，然后稀释
至 400 μL，备用。
预扩增体系(25 μL)：取 5 μL的连接产物，加上
10pmol的E0和H0引物，1UTaqDNA聚合酶，5mmol/L
的 dNTPs和 2.5 μL 10×PCR Buffer (含有 15 mmol/L
MgCl2)。上述体系置于 PCR仪上进行扩增，扩增程序
为：94℃ 30 s, 56℃ 60 s 和 72℃ 60 s，20 个循环，最
后 72℃延伸 5×60 s。
选择性扩增体系 (25 μL)：取 5 μL的预扩增产
物，加上 10 pmol的选择性扩增引物，1 U Taq DNA
聚合酶，5 mmol/L的 dNTPs和 2.5 μL 10×PCR buffer
(含有 15 mmol/L MgCl2)。上述体系置于 PCR仪上进
行扩增，扩增程序为：94℃ 30 s，65℃ 60 s和 72℃ 60 s，
12次循环，接着 94℃30 s, 56℃ 60 s和 72℃ 60 s，23
次循环，最后 72℃延伸 10×60 s。
聚丙烯酰胺凝胶浓度为 6%，取扩增后样品 4 μL
进行电泳，180 V恒压电泳 4 h后进行银染、照相。
作者贡献
何克勤是本试验的实验设计和实验研究的执行
人；何克勤和刘晨完成数据分析，论文初稿的写作；
周玉丽和李艳阳参与实验研究和结果分析；胡能兵和
崔广荣是项目的构思者及负责人，指导实验设计，论
文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。
致谢
本研究由安徽科技学院青年基金(ZRC2014430)
和 2014年安徽省大学生创新创业训练计划项目共
同资助。
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