全 文 ：思茅松不同组织 DNA的提取*
吴丽圆
(云南省林业科学院 云南省森林植物培育与开发利用重点实验室 ,云南昆明 650204)
摘　要:以思茅松 (P inus kesiya var. langbianensis)嫩针叶 、半木质化韧皮部 、木质化韧皮部及
成熟针叶为实验材料 ,采用高盐沉淀法提取思茅松的总 DNA。结果表明:除成熟针叶外 ,其它
3种组织中次生物质含量少 ,均为提取 DNA的极好材料 , DNA的得率达到 21. 32 ～ 29. 85 μg
g- 1 , A 260 /A 280值在 1. 6左右 。清晰明亮的 RAPD产物也表明所提取的 DNA无论在质量还是
数量上均可满足 DNA分子标记的要求。因此 ,根据不同季节 ,可选择不同的植物组织来提取
高质量的 DNA。
关键词:思茅松;组织;DNA提取
中图分类号:S722　　文献标识码:A　　文章编号:1001-7461(2005)02-0083-03
DNA Extraction from D iffe rent T issues ofP inus kesiya var. langbianensis
WU L i-yuan
(Yunnan P rovincia lKey Labora tory of Cu ltiva tion＆Developm en t of Forest P lan t , Yunnan Acad em y of Forest S cien ce, Yun lan, Kunm ing 650204, Ch ina )
Abstact:The genom ic DNA was ex tracted from d ifferen t tissues o fP inus kesiya var. langbianensis by high sa lt pre-
cipitation method. The results ind ica te that except forma ture leaf, othe r tissues, such as young leaf, ha lf-ligneous
phloem and phloem can be used to extractDNA easily and successfully. In addition, the value ofA260 /A280 forDNA
samp le extracted from th ree kinds o f tissuesmen tioned above is 1. 6 o r so, and the quantity is 21. 32 ～ 29. 85μg
g
- 1
. A lso, clear and bright products of RAPD revea l that the DNA may mee t needs of DNA mo lecu larm arkers.
A ccordingly, diffe rent tissues may be used to ex tract DNA of good qua lity in different seasons.
Key words:P inus kesiya va r. langbianensis;tissue;DNA ex traction
　　在 DNA水平上进行遗传分析的分子生物学实
验方法 ,如:随机扩增多态 DNA (RAPD),串联重复
序列 (SSR),扩增酶切片段长度多态性 (AFLP)等 ,
这些方法已广泛应用于生物学研究的各个领域 ,在
这些技术的实验过程中 , DNA的质量是影响实验成
败的关键因素之一。由于针叶树的针叶内树脂 (萜
烯类化合物 )和酚类化合物含量高 ,从针叶中提取
高纯度 DNA相对比较困难 [ 1] 。笔者在进行思茅松
群体分子遗传多样性研究的工作中 ,分别以思茅松
不同组织器官为实验材料提取 DNA ,并对所得到的
DNA的产量和纯度等进行比较 ,以利于选择 DNA
得率高 、次生物质少的实验材料 。
1　材料与方法
1. 1　实验材料
　　思茅松 (P inus kesiya var. langbianensis)当年生
嫩叶 、半木质化韧皮部 、木质化韧皮部和成熟叶。
1. 2　主要药品与试剂
1. 2. 1　药品 　 RnaseA、 λDNA、 Primer等购自
Promegen公司 , Tag polymerase等购自宝生生物有限
公司 。
1. 2. 2　所用主要试剂 　(1)提取液:100 mmo l /L
Tris-HC l , pH 8. 0;1. 4 mmol /L NaC l;20 mmo l /L
EDTA;2% CTAB (W /V) ;3% PVP (W /V) ;3%
β-巯基乙醇 。 (2) TE缓冲液:10 mmo l /L Tris-HC l,
pH 8. 0;0. 1mmol /L EDTA
1. 3　DNA提取及纯度测定
DNA的提取采用高盐沉淀法 [ 2, 3] ,具体操作步
骤如下:
(1)分别秤取 1 g样品(嫩叶 、半木质化韧皮部 、
西北林学院学报　2005, 20(2):83 ～ 85
Journal o fNo rthwe st Fo restry Un ive rsity
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
* 收稿日期:2004-06-30
基金项目:国家林业局 “云南珍稀濒特森林植物保护与繁育重点实验室 ”开放研究基金 ( 2001C01 )
作者简介:吴丽圆(1967-),女 ,云南人 ,副研究员 ,硕士 ,从事林木遗传育种研究。
木质化韧皮部和成熟叶 ),用液氮研磨至细粉状后 ,
迅速倒入装有 3 mL DNA提取液 (65 ℃)的 10 mL
离心管中 ,充分摇匀后 , 65 ℃水浴保温 30 m in ;
(2)5 438×g离心 10m in ,取上清液 ,加入等体
积氯仿:异戊醇(24∶1), 充分混匀;
(3)5 438×g离心 10m in ,取上清液 ,加入等体
积氯仿:异戊醇(24∶1), 混匀;
(4)5 438×g离心 10m in ,取上清液 ,加入 2. 5
倍体积无水乙醇 (预冷 ),在冰箱中静置 1 h后 ,用广
口吸管将白色絮状物吸出 ,转入 1. 5 mL离心管中 , 4
579×g离心 10 m in ,倒掉水相;
(5)将所得沉淀用 70%乙醇洗涤 2次 ,风干后
溶于 100 μL TE中。
(6)待 DNA充分溶解于 TE后 ,加入适量 4 mol
/ L N aC l ,使溶液中 N aC l的终浓度达到 2. 5mo l / L
,然后再次用无水乙醇将 DNA沉淀出来 ,经洗涤风
干后 ,溶于 100 μL TE中 。
用紫外分光光度计测定所提取 DNA的 OD260和
OD 280值 ,计算 A260 /A280值表示 DNA的纯度 ,并测定
DNA的浓度[ 4] 。
1. 4　DNA的 PCR扩增
RAPD扩增反应在 Perkin - E lmer 9700基因扩
增仪上进行 , 20 μL反应体系:其中 10倍反应缓冲
液 2μL(100mmo l /L - pH 8. 3 T ris-HC l , 500mmol
/ L KC l , 20mmo l / L M gC l2 , 0. 01%明胶), Taq聚
合酶 1单位 , dATP、 dTTP、 dCTP 和 dGTP 各 100
μmo l /L , 引物 5 pmo l , DNA模板 20 ng左右。扩增
程序为:94 ℃预变性 1 m in ;再 40个循环:94 ℃变
性 30 s , 37℃退火 30 s和 72℃延伸 2m in;最后于
72 ℃延伸 7 m in 。扩增产物用 1. 2%的琼脂糖凝胶
电泳检测。
2　结果与分析
2. 1　DNA纯度与产量
不同组织所提取 DNA的纯度和产量有所不同 ,
但均以幼嫩组织所提取 DNA产量和纯度为高 (表
1),它们的 A260 /A280都在 1. 6左右 ,与标准纯 DNA
的 A 260 /A 280比值(1. 8)相比 ,其纯度达到 88. 89%左
右 。对于成熟叶 ,其 DNA纯度低 ,而且带有褐色 。
从 DNA的琼脂糖凝胶电泳结果 (图 1)来看 , DNA
谱带清晰 ,拖尾不明显 ,此外也说明植物组织越嫩 ,
所提取植物基因组的得率也越高。
2. 2　DNA的 PCR扩增
将思茅松不同组织所提取的 DNA稀释为 10
ng /μL作为模板进行 RAPD反应 。结果 (图 2)表
明 ,这些 DNA都能扩增出清晰的谱带 ,片段大小在
250 ～ 2 000 bp。
表 1　思茅松不同组织的 DNA纯度和产量
Tab le 1　Pu rity and y ield of DNA on d ifferen t tissues of
P inus kesiya var. langbianen sis
实验材料 A260 /A 280 得率 /μg g- 1
嫩叶 1. 631 29. 85
半木质化韧皮部 1. 626 27. 63
木质化韧皮部 1. 597 21. 32
成熟叶 1. 513 5. 11
样品号:1.半木质化韧皮部;2.嫩叶;3.成熟叶;4.韧皮部
图 1　思茅松不同组织的 DNA琼脂糖凝胶电泳结果
Fig. 1　Resu lts of agarose gel electrophoresis of DNA from
differen t tissues ofP inus kesiya var. langbianensis
3　结论与讨论
3. 1　DNA提取的方法差异
由于植物组织所含复杂次生化合物的影响 ,从
植物组织中提取高纯度 DNA相对比较困难 , DNA
的提取往往花去研究者大量的时间和精力 。 DNA
提取的难易程度首先取决于植物种自身 。目前有关
植物 DNA提取的文献大都是关于研究用不同的方
法提取不同植物的 DNA[ 5 ～ 8] ,如:CTAB法 、SDS法
和 DNA提取试剂盒等。通常 ,由 DNA提取试剂盒
提取得到的 DNA纯度较高 , A 260 /A 280在 1. 8左右 ,
但由于 DNA提取试剂盒价格昂贵 ,在样品数量较多
的情况下 ,使用 DNA提取试剂盒提取 DNA成本较
高 ,因此 ,大多数研究者都力求寻找其它的有效方法
来提取 DNA 。本研究针对针叶树的特点 ,选择了 4
种 DNA提取方法 , 即简易提取法 、高盐沉淀法 、
CTAB沉淀法和高盐低 pH法 ,从思茅松嫩针叶中提
取 DNA ,实验结果显示 ,高盐沉淀法和高盐低 pH法
提取得到的 DNA在质量和数量上均能满足 RAPD
扩增的需要 ,但从操作程序的角度考虑 ,高盐沉淀法
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比高盐低 pH法省时省力 ,因此 ,确定高盐沉淀法为
提取思茅松总 DNA的最佳方法 , 详细情况见文
献 [ 9] 。
引物:AGGGCCGTCT;样品号:1.韧皮部;
2.成熟叶;3.嫩叶;4.半木质化韧皮
图 2　思茅松不同组织 DNA的 RAPD产物
Fig. 2　RAPD produ cts of the genom ic DNA from differen t
tissu es ofP inus kesiya var. langbianen sis
3. 2　DNA提取的组织间差异
许多研究已经表明植物组织中的多糖和其它一
些次生代谢产物 ,如:酚 、酯 、萜等 ,对 DNA的提取造
成很大困难 [ 7] ,而且这些物质随着植物器官的增长
而增加 。因此 ,在实际工作中人们总是选择幼嫩叶
来作为植物 DNA提取的理想材料。但对于大多数
植物种而言 ,幼嫩叶采集受到季节限制。一般除春
季外 ,一年的大部分时间里都很难采集到幼嫩叶 ,这
给研究工作带来很大的不便 。从思茅松不同组织
DNA提取的情况来看 ,除成熟叶外 ,幼嫩叶 、半木质
化韧皮部和木质化韧皮部次生物质含量少 ,都是
DNA提取的极好材料 ,所提取 DNA无论在质量还
是数量上均能满足 DNA分子标记的要求 。因此 ,根
据不同季节 ,可选择不同的植物组织来提取高质量
的 DNA。
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(上接第 73页 )
属的分析表明 ,属于热带成分的有 96属 ,占总属数
72. 7%,其中泛热带比例最高 ,为 45属 ,占总属数的
34. 1%。与其他省区相比较 ,与广东省的共有种最
多 ,有 180种 ,其次为广西 (165种 ),与属的分析是
一致的 ,厦门地区藤本植物属于热带性质 。
致谢:本文在调查研究过程中承蒙福建省亚热带植物研究所张永田
研究员 、厦门植物园名誉主任 、高级工程师陈榕生先生的指导和厦门
植物园农艺师王成聪先生的帮助 ,特致谢忱 
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