全 文 ： 研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY　BULLETIN 2006年增刊
超滤法提取裂褶菌胞外多糖几个主要参数的研究
王斌 1, 2*　连宾1　潘牧1
(1贵州大学发酵工程与生物制药贵州省重点实验室 , 贵阳 550003;2河南科技学院生物工程系 , 新乡 453003)
　　摘　要:　对超滤法提取裂褶菌胞外多糖进行了研究 , 采用 “二次回归旋转正交组合设计”得出超滤法提取裂
褶菌胞外多糖的最优条件为:压力 0. 11MPa,温度 55. 20℃, pH4. 01。 在上述条件下超滤速度达 31. 92m l /m in, 制得
的裂褶菌胞外多糖是以 D-葡聚糖为主的混合多糖 ,其纯度为 75. 13%,收率可达 82. 06%。
关键词:　裂褶菌　胞外多糖　超滤　收率
Study on Param eters in Extracting Extracellular Polysaccharide of
Schizophyllum by U ltrafiltrating
Wang B in
1, 2*　Lian B in1　PanM u1
(1 The ProvincialKey Laboratory of F erm en tation Eng ineering and B io-Pharmaceu tical,
Guizhou Un iversity, Guiyang 550003;2 Departmen t of B iology Engineering, Henan
Institute of Seience and Technology, X inxiang 453003)
　　Abstract:　Ex traction o f ex trace llu lar po ly saccharide of S chizophy llum commune in ferm ention b ro th w ith u ltrafiltra-
tion m em brane we re investigared and the conditionsw ere founded by using dua lity quadratic reg ress ro tatable com posite in-
tersect de sign. . They we re 0. 11Mpa for pressure, 55. 20℃ fo r temperature, PH 4. 01. The resu lt showed the speed o f u ltrafil-
tration w as 31. 92m l /m in, the content o f ex trace llular po lysaccha ride in the rough-po ly saccharide was 75. 13%, and ex tra tion
ra tew as 82. 06%。
Key words:　S ch izophy llum　Ex trace llular po ly saccharide　U ltrafiltration　Ex trac tion ra te
　　作者简介:王斌(1977-),男 ,甘肃会宁人 ,贵州大学在读硕士研究生 ,研究方向:微生物发酵工程
*联系作者:w angb in6339@163. com
　　裂褶菌 (Schizophy llum commune)属担子菌纲 ,
蘑菇目 ,裂褶菌科 ,裂褶菌属 ,是一种珍贵的药用真
菌 [ 1] ,其胞外多糖是水溶性的 β-D-葡聚糖 ,因其良
好的水溶性及带有 β-(1 ～ 6)分枝的 β-(1 ～ 3)-D葡
聚糖的独特活性结构 ,在调节免疫功能 、抗肿瘤 、抗
辐射等方面有显著的功效 ,是一种非常好的生物应
答效应物[ 2, 3] ;此外 ,裂褶菌胞外多糖对抗菌素具有
增效作用 , 同时还具有降低抗菌素副作用的功
效 [ 4 ～ 6] ,因而在理论和实际应用中具有研究价值。
提取分离食药用真菌多糖的方法较多 ,有水提
醇沉法 [ 7 ～ 11] 、碱提法 [ 11, 12] 、酸提法[ 13]及酶法[ 14, 15]和
超滤法[ 16, 17]等 ,其中超滤法具有稳定性好 、试剂使
用量少 、工艺简单 、可连续操作等优点 ,若将食药用
真菌多糖溶出液的微滤预处理和超滤纯化相结合 ,
可实现提取 、分离和纯化工艺的连续操作 ,省去分段
工艺的不便。本文对超滤法提取裂褶菌胞外多糖几
个主要参数进行了探讨 ,考察了压力 、温度 、发酵液
pH对超滤速度的影响 ,采用 “二次回归旋转正交组
合设计[ 18] ”对超滤条件进行了优化。
1　材料与方法
1. 1　材料
1. 1. 1　发酵液:过滤除去菌丝体的裂褶菌发酵液
1. 1. 2　实验仪器:NDJ-4型粘度计 ,WAY-2S折射
计 , 0. 5μm滤芯的微滤器 , YF3型超滤系统 (截留分
子量为 1. 2×104韩国), Sigma3K-18型台式离心机 ,
F reZone 6升台式冻干机 , Perew E lmeu r红外光谱仪 ,
DOI牶牨牥牣牨牫牭牰牥牤j牣cnki牣bio tech牣bul l牣牨牴牳牭牣牪牥牥牰牣s牨牣牨牥牳
2006年增刊 王斌等:超滤法提取裂褶菌胞外多糖几个主要参数的研究
RE-3000A旋转蒸发器 , MettlerAG64型电子天平 ,
Delta320台式 pH计 。
1. 2　方法
1. 2. 1　固形物浓度测定:取清液 ,用WAY-2S折射
计测定
1. 2. 2　粘度测定:用 NDJ-4型粘度计测定
1. 2. 3　胞外多糖浓度测定:苯酚-硫酸法 [ 19]
1. 2. 4　发酵液的预处理 [ 16, 17] :采用 0. 5μm滤芯的
微滤器微滤和 4 000r /m in离心两种方法进一步除
去发酵液中的固形物 ,以降低超滤时固形物对膜的
堵塞。
1. 2. 5　超滤条件的优化:采用 “二次回归旋转正交
组合设计”方法进行试验以便取得超滤速度的预测
值的等精度估计和最优的超滤条件。
1. 2. 6　裂褶菌胞外多糖的制备 、纯度测定及收率计
算:超滤后取滤液进行浓缩 ,将浓缩液真空冷冻干燥
得多糖粗品 ,外观为灰白色粉末 。
纯度和收率计算方法分别为:
P =C 1 ×V1
M
, Y = M
C2 ×V2
　　其中:P:纯度(%), 　　　　Y:收率(%),
C1:浓缩液多糖浓度 (g /L), C2:预处理后发酵
液中多糖含量(g /L),
V1:浓缩液体积(L)V2:预处理后发酵液体积(L)
M:粗多糖质量(g)
1. 2. 7粗多糖制品红外光谱分析 [ 16, 20, 21] :将适量多
糖制品压片后作红外光谱分析 ,根据红外吸收图谱
分析制品中所含基团 。
2　结果与分析
2. 1　工艺流程
采用超滤法提取裂褶菌胞外多糖的工艺流程
为:
发酵液→过滤除菌丝体→滤液预处理→超滤→
浓缩→干燥→粗多糖
2. 2　预处理
不论是采用 0. 5μm滤芯的微滤器微滤还是采
用 4 000 r /m in离心均可进一步除去发酵液中的固
形物(表 1)。结果表明微滤法除固形物较离心法彻
底 ,并且有多糖损失少 ,操作简便 、连续的优点 。
表 1　预处理结果
发酵液性质 固形物浓度(g / L) 粘度(cp)
多糖含量
(g /L)
未处理的发酵液 0. 315 1. 279 2. 891
离心处理的发酵液 0. 118 1. 130 2. 735
微滤处理的发酵液 0. 088 1. 015 2. 801
2. 3　超滤最佳条件的确定
2. 3. 1　影响因素水平编码　为了消除影响因素之
间的交互作用对超滤结果的影响 ,以超滤速度 (m l /
m in)为指标 , 选取对超滤速度影响较大的温度
(X1),超滤压差(X2),发酵液 pH(X3)为因素 ,采用
“二次回归旋转正交组合设计” ,以 10L预处理后的
发酵液为原料进行试验 。
各因素取值范围 (X i1≤X i≤X i2):40℃≤X1 ≤
80℃, 0. 05M Pa≤X2≤0. 15M Pa, 4. 0≤X3≤8. 0
编码公式如下:
上星号臂 X i2;下星号臂 X i ;零水平 X i0 =
X i +X i2
2
;上水平 X i =X i0 +X i2 -X i0Δi ;
下水平 X i =X i0 +X i1 -X i0Δi ;ΔX i=X i2 -X i1;Δ=
X i2 -ΔX i
1.682
影响因素水平编码结果见表 2
表 2　因素水平编码表
因素 X1(℃) X2(MPa) X 3
上星号臂(+1. 682) 80 0. 15 8. 0
上水平(+1) 61. 682 0. 13 21. 468
零水平(0) 60 0. 10 6. 0
下水平( - 1) 58. 318 0. 07 8. 532
下星号臂( -1. 682) 40 0. 05 4. 0
Δi 11. 891 0. 030 1. 189
2. 3. 2　实验方案及结果　将编码的因素作变换:Zi
=X i2 -ΔX iΔi , Z′i =Zi
2
-
∑Z2i
n
,代入二次回归正交组
合设计表 ,实验结果见表 3。
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生物技术通报 B iotechnology　Bulletin 2006年增刊
表 3　实验方案及实验结果
实验号 Z0 Z1 Z2 Z3 Z1Z2 Z1Z3 Z2Z3 Z1′ Z2′ Z3′ Y
1 1 1 1 1 1 1 1 0. 406 0. 406 0. 406 26. 72
2 1 1 1 - 1 1 - 1 - 1 0. 406 0. 406 0. 406 28. 13
3 1 1 -1 1 - 1 1 - 1 0. 406 0. 406 0. 406 24. 50
4 1 1 -1 - 1 - 1 - 1 1 0. 406 0. 406 0. 406 25. 91
5 1 -1 1 1 - 1 - 1 1 0. 406 0. 406 0. 406 27. 23
6 1 -1 1 - 1 - 1 1 - 1 0. 406 0. 406 0. 406 29. 42
7 1 -1 -1 1 1 - 1 - 1 0. 406 0. 406 0. 406 26. 93
8 1 -1 -1 - 1 1 1 1 0. 406 0. 406 0. 406 24. 51
9 1 1. 682 0 0 0 0 0 2. 234 -0. 594 -0. 594 24. 94
10 1 - 1. 682 0 0 0 0 0 2. 234 -0. 594 -0. 594 23. 82
11 1 0 1. 682 0 0 0 0 - 0. 594 2. 234 -0. 594 26. 05
12 1 0 - 1. 682 0 0 0 0 - 0. 594 2. 234 -0. 594 23. 17
13 1 0 0 1. 682 0 0 0 -0. 594 -0. 594 2. 234 28. 13
14 1 0 0 - 1. 682 0 0 0 -0. 594 -0. 594 2. 234 26. 93
15 1 0 0 0 0 0 0 -0. 594 -0. 594 -0. 594 27. 70
16 1 0 0 0 0 0 0 -0. 594 -0. 594 -0. 594 28. 47
17 1 0 0 0 0 0 0 -0. 594 -0. 594 -0. 594 27. 80
18 1 0 0 0 0 0 0 -0. 594 -0. 594 -0. 594 26. 27
19 1 0 0 0 0 0 0 -0. 594 -0. 594 -0. 594 27. 70
20 1 0 0 0 0 0 0 -0. 594 -0. 594 -0. 594 26. 60
21 1 0 0 0 0 0 0 -0. 594 -0. 594 -0. 594 27. 27
22 1 0 0 0 0 0 0 -0. 594 -0. 594 -0. 594 27. 97
23 1 0 0 0 0 0 0 -0. 594 -0. 594 -0. 594 27. 80
Bi 615. 97 - 1. 52 18. 27 - 1. 22 - 1. 37 -3. 70 -5. 23 -15. 27 -6. 71 2. 54
di 23 13. 66 23. 66 13. 66 8 8 8 15. 89 15. 89 15. 89
b i 26. 78 - 0. 11 1. 34 - 0. 09 - 0. 17 -0. 46 -0. 65 -0. 96 -0. 42 0. 16
U i 0. 17 24. 44 0. 11 0. 23 1. 71 3. 42 14. 68 2. 83 0. 41
F i 0. 19 27. 11 0. 12 0. 26 1. 90 3. 79 16. 28 3. 14 0. 45
　　根据表 3进行统计检验:
计算得:总平方和 SST =59. 72, fT =n - 1 =22;
回归平方和 U=48, fU =9;剩余平方和 Qe2 =ST -U
=11. 72 , fe2 =13;误差平方和 Qe =3. 80, fe =8;失
拟平方和 QLf =Qe2 -Qe=7. 92, fLf =5;
将 b0 、b1、b2 、b3、b12、 b13 、b23 、b11、b22、 b33的值代
入二次回归模型得回归方程为:
Y=26. 78 - 0. 11Z1 +1. 34Z2 - 0. 09Z3 - 0.
17Z1Z2 - 0. 46Z1 Z3 - 0. 65Z2Z3 - 0. 96Z1′- 0. 42Z2′
+0. 16Z3′
分别对模型拟合度 、回归效果和各偏回归系数
的显著性进行检验 ,结果为:模型拟合度 FLf =3. 33
F0. 01(9 ,
13)=4. 19,因此模型拟合是合适的 ,回归效果显
著;偏回归系数 Fi的值如表 2所示 ,除 b1 、b3 、b12 、
b33外 ,其它回归系数都在不同程度上显著 ,鉴于设
计具有正交性 , 可将不显著项剔除 , 将 Z i =
X i2 -ΔX i
Δi , Z′i =Z
2
i -
∑Z2i
n
代入上述回归方程得用自然变量表示的回归方
程为:
Y= - 0. 007X1 2 +1. 008 X 1 - 466. 667 X22 +
247. 242 X2 +3. 741X 3 - 0. 032 X1X 3 - 18. 207 X2X 3
-23. 791
运用多元函数极值理论求得:当 X1 =55. 20 , X 2
=0. 11, X3 =4. 01时 , Y存在极大值且 Y =31. 96,
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2006年增刊 王斌等:超滤法提取裂褶菌胞外多糖几个主要参数的研究
即超滤法提取裂褶菌胞外多糖的最优条件为:压力
0. 11M Pa,温度 55. 20℃, PH4. 01 ,在此条件下超滤
速度预测值可达 31. 96m l /m in。
对所得的最优超滤条进行件验证 ,将 10L预处
理的发酵液在压力 0. 11MPa、温度 55. 20℃、pH4. 01
的条件下超滤 ,得滤液 9L,测得的超滤速度为 31.
92m l /m in。将滤液置于真空度为 0. 095M Pa,温度为
60℃的条件下浓缩至 2. 0L,测得浓缩液中多糖浓度
为 11. 493g /L,再将浓缩液在真空度为 0. 095M Pa,
温度为 -45℃下冷冻干燥 14h,最终得灰白色多糖
粉末 30. 594g,经测定多糖纯度为 75. 13%,收率达
82. 06%。
2. 4　多糖制品红外光谱分析
将适量多糖制品压片后置红外光谱仪上分析 ,
结果如图 1所示 。
图 1　胞外多糖的红外分析图谱
裂褶菌胞外多糖在 3 200 ～ 3 600cm - 1的区间是
O-H伸缩振动。 2 800 ～ 3 000cm -1的峰为糖类 C-H
伸缩振动 ,此区域的吸收峰是糖类的特征吸收峰。 1
200 ～ 1 400cm -1的吸收峰是 C-H 的变角振动引起
的 。 1 000 ～ 1 200cm -1的吸收峰是由两种 C-O伸缩
振动所致。 880. 60cm -1处的吸收峰为吡喃糖 β型
C-H的变角振动的特征吸收峰 ,而呋喃糖是没有此
吸收峰的 ,由此推断糖苷键应为 β型 ,糖环形态为
吡喃糖环。
3　结论
通过 “二次回归旋转正交组合设计”,比较准确
地确定了超滤法提取裂褶菌胞外多糖的最优条件 ,
即:压力 0. 11MPa,温度 55. 20℃, pH4. 01,在此条件
下超滤速度可达 31. 92m l /m in,制得的裂褶菌胞外
多糖为以 D -葡聚糖为主的混合多糖 ,其纯度为
75. 13%, 收率可达 82. 06%。该方法与传统的盐
析 、醇析等方法相比 ,具有工艺过程简单 ,生产周期
短 ,大幅度减少酸 、碱 、乙醇等的使用 ,多糖纯度和收
率较传统方法高的优点 。
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