全 文 ：基金项目:国家自然科学基金项目(30672620);上海-SK研究与发展基金项目(2003012-t)
作者简介:何芬 ,女 ,硕士研究生　　＊通讯作者:李晓波 ,女 ,教授 ,博士生导师　　Tel:(021)34204806　　E-mail:xbli@sjtu.edu.cn
粗吻海龙蛋白质组分体外抗肿瘤活性的研究
何芬 ,马旭东 ,王梦月 ,秦孙星 ,王威 ,李晓波＊(上海交通大学药学院 ,上海 200240)
摘要:目的　探讨粗吻海龙水溶性蛋白质组分的抗肿瘤活性。方法　应用四甲基偶氮唑盐法检测药物细胞毒效应 , 应用流式
细胞术分析药物对 A549细胞周期和凋亡率的变化 , 琼脂糖凝胶电泳 、荧光显微镜观察药物对 A549细胞凋亡和细胞周期相关
性质改变。结果　粗吻海龙蛋白对 L1210、CCRF-CEM、A549、LOVO细胞的 IC
50
分为 1.86, 1.56, 0.88, 1.74 g· L-1。粗吻海龙
蛋白质组分对 A549细胞作用表现出凋亡细胞特征性的改变 , 并能增强甲氨蝶呤 、丝裂霉素对 A549的细胞毒作用。结果　粗
吻海龙蛋白质组分对肿瘤细胞增生有明显的抑制作用 ,可引起肿瘤细胞凋亡。
关键词:粗吻海龙;蛋白质;抗肿瘤;凋亡
中图分类号:R965　　　文献标识码:A　　　文章编号:1001-2494(2008)12-0903-04
StudyontheAnti-TumorEffectsofProteinsfromTrachyrhamphusserratusinVitro
HEFen, MAXu-dong, WANGMeng-yue, QINSun-xing, WANGWei, LIXiao-bo＊(SchoolofPharmacy, Shanghai
JiaoTongUniversity, Shanghai200240, China)
ABSTRACT:OBJECTIVE　Tostudytheanti-tumoractivityofthewater-solublecrudeproteinsfromTrachyrhamphusserra-
tus.METHODS　MTTassaywasusedtoevaluatetheinhibitoryefectsofthecrudeproteinsonproliferationofcancercellines.Cell
cycleandapoptosisofA549celswereanalyzedbyflowcytometry.Apoptosisinductionwasalsoprovedbyelectrophoresisandmorpho-
logicassessment.RESULTS　TheIC
50
valuesofthecrudeproteinsforL1210、CCRF-CEM、A549、LOVOcelsdetectedbyMTTassay
were1.86, 1.56, 0.88, 1.74 g· L-1 , respectively.Moreover, thecrudeproteinsinducedapoptosisinA549 cels.Atsub-cytotoxicity
concentration, thecrudeproteinshowedsynergisticeffectswithmethotraexate(MTX) andmitomycin( MMC)inA549
cels.CONCLUSION　ThecrudeproteinsfromTrachyrhamphusseratushaveanti-proliferationeffectandinductionofapoptosisin
tumorcellsinvitro.
KEYWORDS:Trachyrhamphusserratus;protein;anti-tumor;apoptosois
　　海龙为传统的补益中药 ,具有温肾壮阳 、散结消
肿功效 。 《中国药典 》收载海龙为刁海龙 [ Solenog-
nathushardwicki(Gray)] 、拟海龙 [ Syngnathoides
biaculeatus(Bloch)] 或尖海龙 [ Syngnathusacus
L.] 的干燥体 [ 1] 。粗吻海龙 [ Trachyrhamphussera-
tus(Temmincketschlegel)] 资源丰富 ,不少地方与
同科的药典收载种同等入药 [ 2-3] 。有报道 ,采用小
鼠移植性肿瘤(Heps、EAS)模型 ,对粗吻海龙的抗肿
瘤有效部位进行筛选 ,结果体积分数为 40%乙醇提
取物经大孔树脂分离 ,其蒸馏水洗脱部分对小鼠移
植性肝癌作用最强 ,并推断该部分应为大分子水溶
性化合物 [ 4] 。为进一步探讨粗吻海龙的抗肿瘤活
性成分 ,我们从粗吻海龙制得一蛋白质组分 ,体外活
性实验发现其对肿瘤细胞生长具有显著抑制作用。
1　材料和方法
1.1　粗吻海龙蛋白质组分的制备
粗吻海龙药材购自海南省海口市 ,经笔者鉴定
为粗吻海龙的干燥全体 。粗吻海龙蛋白质提取物自
制。
粗吻海龙粉碎 ,过 20目筛 。称取粉末 100g,加
蒸馏水 800 mL, 4 ℃浸提 12 h,在此期间不时搅拌。
8 000×g离心 10 min,取上清 ,得到总蛋白质提取
液。加入硫酸铵盐析 ,饱和度为 85%。静置 4h后 ,
8 000×g离心 20 min,收集沉淀物。沉淀物用蒸馏
水溶解 ,搅拌促溶 ,待蛋白质溶解完全后离心 ,收集
蛋白质上清液 , 超滤 (超滤膜截留相对分子质量
1 000)除盐 、浓缩 、冷冻干燥后得到粗吻海龙蛋白质
(Hailongcrudeprotein, HCP)0.86 g。以牛血清白
蛋白为标准品 ,经考马斯亮蓝 G-250染料法测定
HCP质量分数为 43.2% 。
1.2　试剂与仪器
RPMI1640培养基 、HanksF-12KNutrition培养
·903·中国药学杂志 2008年 6月第 43卷第 12期　　　　　　　　　　　　　　　 ChinPharmJ, 2008 June, Vol.43No.12
基(美国 Gibicobrl公司);胎牛血清(杭州四季青生
物工程材料有限公司);胰蛋白酶 -EDTA(Trysin-ED-
TA,德国 Biochromag公司);Hoechst33342、碘化丙
啶(propidiumjodide, Sigma公司);琼脂糖和 100 bp
DNAMarker(美国 MBI公司);溴化乙锭 (ethidium
bromide, EB)、二甲基四氮唑盐(MTT,美国 Amreco
公司);其余试剂均为国产分析纯。
ALPHA2-4真空冷冻干燥器 (德国 Christ公
司);SW-CJ-1C超净工作台(苏州仪器厂);5701
水套式 CO2 培养箱 、MultiskanMK3酶标仪 (美国
ThermoForma公司);BDFASCCalibur流式细胞仪
(美国 BDBioscience公司);水平电泳槽 、GIS2010
凝胶成像系统(上海 Tanon公司);Centrifuge5417R
冷冻离心机(德国 Eppendorf公司);搅拌式超滤杯
系统 8050(美国 Milipore公司)。
1.3　细胞和细胞培养
人肺癌细胞株 (A549)、小鼠白血病细胞株
(L1210)、人白血病细胞株 (CCRF-CEM)(中国科
学院上海细胞研究所),培养在含 10%牛血清的
RPMI1640培养基中;人结肠癌细胞株(LOVO,上海
交通大学药理研究室),培养在含 10%牛血清的
HanksF-12KNutrition。贴壁细胞用 0.25%胰蛋白
酶消化传代 。悬浮细胞离心传代。
1.4　MTT法检测药物对细胞的增生作用
取对数生长期细胞消化 ,计数 , 5 000个每孔铺于
96孔板 ,在 37 ℃,含 5%CO2的培养箱培养 24 h后 ,
加入药物 ,每个药物浓度设 3 ～ 6个平行孔 ,连续培养
48h后 ,每孔加入 20μL5g·L-1MTT,继续培养 4h,
贴壁细胞倾去培养基后每孔加入 150 μL二甲基亚砜
(DMSO),轻轻振摇;悬浮细胞每孔加入 50μL的三联
液(10%SDS-5%异丁醇-0.1%盐酸), 37 ℃培养箱中
过夜。在酶标仪检测各孔 492nm吸光度(A)值 ,并计
算抑制率。计算公式为:抑制率 =(对照组 A值 -实
验组 A值)/对照组 A值 ×100%[ 5] 。
1.5　DNA琼脂糖凝胶电泳
收集药物处理后的细胞约 2 ×106个 , PBS洗 2
次 ,加入细胞消化液 , 37℃消化 1h,再加入 RNaseA
至终质量浓度 0.25 g· L-1 , 37 ℃继续消化 1 h,
12 000×g离心 10min,取适量上清与上样缓冲液混
匀 , 1.5%琼脂糖凝胶电泳 , EB染色 ,拍照 [ 5] 。
1.6　荧光显微镜形态学观察
收集药物处理后的细胞 , PBS洗涤 1次 ,加入荧
光染料 Hoechst33342(终质量浓度 10 mg· L-1)
37 ℃恒温染色 10min,离心去除染液 , PBS洗 2次 ,
细胞重悬于 PBS中 ,滴片 ,用荧光显微镜观察并照
相[ 5] 。
1.7　流式细胞术分析细胞周期和凋亡率
收集药物作用后的细胞 , PBS洗 2次 ,加入 -20℃
预冷的体积分数为 70%乙醇 4 ℃固定过夜 ,离心弃乙
醇 , PBS洗 1次 , RNaseA(50mg·L-1)37 ℃消化 45
min,碘化丙啶(PI, 50mg·L-1)4℃避光染色 30 min,
流式细胞仪检测细胞凋亡及细胞周期的变化[ 5] 。
1.8　药物联合作用评价
两药相互作用指数(CDI)计算公式为 CDI=
AB/(A×B), AB为两药联用组与对照组的比值 , A、
B是药物单独作用组与对照组的比值 ,当 CDI<1时
两药有协同作用[ 6] 。
1.9　数据处理
各组数据用均值 ±标准差( x±s)表示。所有数
据用 SSPS11.5统计软件包作数据处理。
2　实验结果
2.1　粗吻海龙蛋白质组分对肿瘤细胞的增生抑制
作用
MTT法检测结果发现 , HCP对 L1210、CCRF-
CEM、A549和 LOVO细胞的生长均具有不同程度的
抑制作用 ,并呈明显的量效关系 ,结果见表 1。对肿
瘤细胞 L1210、CCRF-CEM、A549和 LOVO的 IC50分
别为(1.86±0.08)、(1.56 ±0.06)、(0.88 ±0.08)
和(1.74±0.09)g· L-1 ,其中 A549细胞最为敏感。
2.2　粗吻海龙蛋白质组分诱导肿瘤细胞凋亡
表 1　粗吻海龙蛋白质组分对不同肿瘤细胞株的影响 .n=3, x±s
Tab.1　EfectsoftheHailongcrudeprotein(HCP)onproliferationoftumorcelsinvitro.n=3, x±s
Concentration
/g· L-1
Absorbanceofdiferentgroups
L1210 CCRF-CEM A549 LOVO
5 0.39±0.042) 0.37±0.082) 0.23±0.022) 0.37±0.042)
2.5 0.42±0.032) 0.41±0.042) 0.25±0.032) 0.38±0.062)
1 0.43±0.062) 0.44±0.052) 0.34±0.062) 0.41±0.052)
0.5 0.50±0.081) 0.55±0.092) 0.38±0.142 0.44±0.122)
0.1 0.72±0.091) 0.71±0.111) 0.62±0.171) 0.63±0.112)
0 0.76±0.12 0.79±0.04 0.69±0.10 0.72±0.16
注:与 0g· L-1组比较 , 1)P<0.05, 2)P<0.01
Note:comparedwith0 g· L-1 group, 1)P<0.05, 2)P<0.01
·904· ChinPharmJ, 2008June, Vol.43No.12　　　　　　　　　　　　　 中国药学杂志 2008年 6月第 43卷第 12期
　　采用剂量为 1, 3, 6 g· L-1HCP处理 A549细胞
24 h后 ,流式细胞术分析结果显示 ,亚 G1期比率分
别为 1.23%, 3.79%和 41.8%,而对照组为 0.62%,
表明 HCP具有诱导 A549细胞凋亡的作用且呈浓度
依赖性(图 1)。
图 1　粗吻海龙蛋白质组分对 A549细胞凋亡影响
A-A549细胞空白对照;B-1g· L-1处理 24h;C-3g· L-1处理 24 h;D-6
g· L-1处理 24 h
Fig.1　EfectsofHCPonA549 celcycles
A-A549celscontrol;B-A549 celstreatedbyHCP(1 g· L-1)for24h, C-
A549celstreatedbyHCP(3 g· L-1)for24 h;D-A549 celstreatedbyHCP
(6g· L-1)for24 h
琼脂糖凝胶电泳分析结果显示 , 3, 6 g· L-1
HCP分别作用于 A549细胞 24 h后 ,琼脂糖凝胶电
泳出现 DNA梯形条带(laddershape),大约相当于
180 ～ 200bp的整倍数 ,提示 DNA在核小体间断裂 ,
呈细胞凋亡的典型特征 ,而培养相同时间的对照组
无 DNA梯形条带出现(图 2)。
图 2　粗吻海龙蛋白质组分对 A549细胞总 DNA的影响
M-100bpmarker;1-A549细胞空白对照;2 -1g· L-1药物处理 24 h;3 -
3g· L-1药物处理 24h;4-6g· L-1药物处理 24 h
Fig.2　EfectsofHCPontotalDNAofA549 cells
M-100bpDNAmarker;1-A549celscontrol;2-A549celstreatedbyHCP(1
g· L-1)for24h;3-A549 celstreatedbyHCP(3 g· L-1)for24 h;4-A549
celstreatedbyHCP(6 g· L-1)for24h
荧光显微镜下可见 ,对照组细胞核呈圆形 ,淡蓝
色 ,染色质在核内均匀分布。 HCP6 g· L-1处理 24
h后 A549细胞发生凋亡 ,细胞核由于浓集而呈亮蓝
色(图 3)。
图 3　Hoechst33342染色后荧光显微镜观察粗吻海龙蛋白
质组分对 A549细胞核的影响
A-空白对照;B-6g· L-1HCP处理 24h
Fig.3　EffectofHCPonA549celsnuclearmorphologydetec-
tedwithHoechst33342 stainingbyfluorescencemicroscope
A-blank;B-HCP6g· L-1 24h
2.3　粗吻海龙蛋白质组分对 A549细胞周期的影响
流式细胞术分析结果表明 , HCP对 A549细胞
周期的影响呈浓度依赖性。细胞周期的变化主要表
现为 S期的蓄积(表 2)。
表 2　粗吻海龙蛋白质组分对 A549细胞周期的影响 .n=3,
x±s
Tab.2　CelcycledistributionofA549 celstreatedwithHCP
for24 h.n=3, x±s
Concentration
/g· L-1
G0/G1phase
/%
Sphase
/%
G2/Mphase
/%
0 76.6±1.56 4.65±0.78 13.9±0.97
1 79.5±2.101) 5.86±1.35 13.4±2.27
3 82.0±1.321) 7.29±0.78 3.38±0.432)
注:与 0 g· L-1组比较 , 1)P<0.05, 2)P<0.01
Note:comparedwith0g· L-1group, 1)P<0.05, 2)P<0.01
2.4　粗吻海龙蛋白质组分增强抗癌药物的细胞毒
作用
MTT法检测显示 , 0.05 g· L-1 HCP对 A549细
胞基本无细胞毒作用 ,与抗癌药物甲氨蝶呤(metho-
traexate, MTX)、丝裂霉素(mitomycin, MMC)合用
时 ,合并用药组的细胞毒作用于相应单独用抗癌药
物的相比有显著差异 , CDI均小于 0.85(图 4),表明
HCP与这两种抗癌药物有协同作用。但是与抗癌
药物长春新碱(vincristine, VCR)合用时 , CDI>1,没
有增强该药物细胞毒作用。
3　讨　论
近年动物类中药的蛋白质 、多肽组分的活性报
道日渐增加 ,涉及广泛的药理作用 [ 6-7] 。从动物中发
现具有抗肿瘤 、增强免疫调节的蛋白质 、多肽已成为
新药开发的一个重要领域 [ 8] 。本实验通过对 HCP
的体外抗肿瘤活性研究发现 ,它能够抑制肿瘤细胞
增生;通过荧光显微镜 、琼脂糖凝胶电泳 、流式细胞
术技术对其抗肿瘤作用机制进行了研究 ,结果发现 ,
HCP能诱导肿瘤细胞凋亡;联合用药结果表明 , HCP
还能够增强甲氨蝶呤 、丝裂霉素对肿瘤细胞毒性。
·905·中国药学杂志 2008年 6月第 43卷第 12期　　　　　　　　　　　　　　　 ChinPharmJ, 2008 June, Vol.43No.12
　　
基金项目:北京市科技计划项目(Z0004105040231)
作者简介:扈金萍 ,女 ,助理研究员　　＊通讯作者:李燕 ,女 ,研究员 ,博士生导师　　 Tel:(010)63165172　　E-mail:yanli@imm.ac.cn
S(+)盐酸氯胺酮对大鼠肝微粒体细胞色素 P450同工酶的影响
扈金萍 ,陈晖 ,李燕＊(中国医学科学院-中国协和医科大学药物研究所 ,北京 100050)
摘要:目的　研究 S(+)盐酸氯胺酮对大鼠肝微粒体细胞色素 P450(CYP450)6种主要同工酶的诱导或抑制作用。方法　应用
HPLC-UV测定 CYP450 6种主要同工酶的特异性探针底物右美沙芬(CYP2D)、双氯酚酸钠(CYP2C6)、奥美拉唑(CYP2C)、氨苯
砜(CYP3A)、非那西丁(CYP1A2)和氯唑沙宗(CYP2E1)的代谢速率。大鼠 iv给予 S(+)盐酸氯胺酮 25 mg· kg-1· d-1 ,连续给
药 7d,评价药物对大鼠肝微粒体 CYP450主要同工酶的诱导或抑制作用。结果　S(+)盐酸氯胺酮 50 μmol· L-1时可明显抑制
大鼠肝脏 CYP2C, 2C6和 3A,分别为对照组的 61.4%, 45.8%和 31.3%,其中以对 CYP2C的抑制作用最为明显。 S(+)盐酸氯胺
酮 1和 10μmol· L-1对 CYP450同工酶无明显影响 ,仅 10 μmol· L-1 S(+)盐酸氯胺酮对 CYP2C有轻度抑制作用。 S(+)盐酸
氯胺酮 iv给药 7 d后 ,对大鼠肝微粒体 CYP1A2和 CYP2C有不同程度的诱导作用 , 分别诱导 137.5%和 117.6%,对 CYP2E1, 3A,
2D, 2C6无明显影响。结论　S(+)盐酸氯胺酮 50 μmol· L-1时可明显抑制肝脏 CYP2C, 2C6和 3A,连续给药 7 d后可诱导
CYP1A2和 CYP2C, 提示 S(+)盐酸氯胺酮与经上述同工酶代谢的药物联合应用时 , 应注意药物-药物相互作用的可能性。
关键词:S(+)盐酸氯胺酮;细胞色素 P450;探针底物;高效液相色谱法
中图分类号:R965　　　文献标识码:A　　　文章编号:1001-2494(2008)12-0906-04
EfectofS(+)-KetamineonLiverMicrosomalCytochromeP450 IsozymesinRats
HUJin-ping, CHENHui, LIYan＊(InstituteofMaterialMedica, ChineseAcademyofMedicalScience＆PekingUnionMedical
Colege, Beijing100050, China)
ABSTRACT:OBJECTIVE　TodeterminetheinhibitoryorinductiveefectofS(+)-ketamineonlivermicrosomalCYP450 isozymes
inrats.METHODS　RatsweregivenS(+)-ketamineoncedailyintravenouslyforsevendays.Thelivermicrosomeswaspreparedfor
图 4　HCP与抗肿瘤药物共同作用及抗肿瘤药物单独作用
于 A549细胞 .n=3, x±s
HCP0.08 g· L-1;甲氨蝶呤 0.16mg· L-1;长春新碱 2mg· L-1;丝裂霉素
0.4 mg· L-1;1)CDI<0.85,与单独加药组相比 , P<0.05
Fig.4　InhibitoryefectofHCPcombinedwithmethotraexate,
vincristine, mitomycinandHCPaloneonproliferationofA549
cels.n=3, x±s
HCP0.08g·L-1;methotraexate0.16 mg· L-1;vincristine2 mg· L-1;mitomy-
cin0.4mg· L-1;1)CDI<0.85, P<0.05, comparedwithanti-tumordrugalone
本实验首次证明 HCP具有一定抗肿瘤活性 ,为海龙
蛋白质药物开发提供了基础数据。
REFERENCES
[ 1] 　 Ch.P(2005)Vol.Ⅰ (中华人民共和国药典 2005年版 .一
部)[ S].2005:207.
[ 2] 　 XUDH, XIEJH, MEIXT, etal.Advanceintheresearchof
syngnathidaeinChina[J] .ChinJMarDrugs(中国海洋药物),
2005, 24(2):51-56.
[ 3] 　 ZHANGZH, XUGJ, XVLS, etal.Surveyonmedicinalre-
sourcesofsyngnathidae[ J] .ChinaJChinMaterMed(中国中药
杂志), 1997, 20(5):224-226.
[ 4] 　 ZHANGZH, NIQG, WULY, etal.Studiesonanti-tumorac-
tivityofTrachyrhamphusserratus[ J].ChinJMarDrugs(中国海
洋药物), 1998, 68(4):10-12.
[ 5] 　 XUSY, BIANRL, CHENX.MethodologyinPharmacological
Experiment(药理实验方法学)[ M] .3rd.Beijing:People s
MedicalPublishingHouse, 2002:1816-1822.
[ 6] 　 WANGYH, ZHANGSH, ZHENRX, etal.Asiaticosidein-
ducingapoptosisoftumorcelsandenhancinganti-tumoractivity
ofvincristine[J] .ChinJCancer(癌症), 2004, 23(12):1599-
1604.
[ 7] 　 YAORY, CHUX, CHENSG, etal.Anti-tumoreffectsofpol-
ypeptidesfromarcagranosalinnaeusinvitroandinvivo[ J].
ChinPharmJ(中国药学杂志), 2006, 41(11):868-870.
[ 8] 　 WUL, ZHANGL, DUGH, etal.Studyontheactiveprotein
fractionsfromscorpiitegument[ J] .ChinaJChinMaterMed(中
国中药杂志), 2006, 30(14):1083-1086.
[ 9] 　 ZHANGP, WUW T.Advanceonstudiesofmarineactiveanti-
tumorproteinsandpeptides[ J].ChinJMarDrugs(中国海洋药
物), 2004, 98(2):32-39.
(收稿日期:2007-06-23)
·906· ChinPharmJ, 2008June, Vol.43No.12　　　　　　　　　　　　　 中国药学杂志 2008年 6月第 43卷第 12期