全 文 ：高效液相色谱法测定甜叶菊糖中的
甜菊苷和莱鲍迪苷 A
刘　超 , 李来生 , 许丽丽 , 周志明
(南昌大学分析测试中心 , 南昌 330047)
摘　要:建立甜叶菊糖中甜菊苷(简称为ST)和莱鲍迪苷A(简称为 RA)的 HPLC
定量分析方法。色谱分离采用Kromasil NH2柱(250 mm×4.6mm i.d., 5μm), 以
V(乙腈)∶V(水)=75∶25为流动相 , 采用质谱检测器鉴定甜叶菊糖中主要的成
分 。ST 和 RA质量浓度分别为 9.0 ～ 287.6 mg L和 3.9 ～ 126.1 mg L时线性关系
良好 , 两者平均回收率分别为 98.61%和 97.40%, RSD分别为 2.3%和 1.3%
(n=5)。本实验还利用经典的 Eschweiler-clark甲基化反应将氨基柱的伯胺转变
为叔胺 , 发现上述溶质保留减小 , 同时分离选择性减小 , 说明氨基与糖苷类化
合物的氢键作用和偶极-偶极作用对分离有重要贡献。
关键词:高效液相色谱法;甜菊苷;莱鲍迪苷;甜叶菊糖;测定;分离机理
中图分类号:O657.7　　文献标识码:A　　　文章编号:1000-0720(2007)07-023-04
　　甜叶菊(Stevia Yebaudi-ana Bertoni)属菊科甜菊
属多年生草本植物 , 甜叶菊糖是从甜叶菊叶片中
提取出来的一种天然甜味剂 , 它以其高甜度 、低
热量 、安全无毒等特点逐渐受到人们的青睐 , 并
已取代了一些人工合成的甜味剂[ 1] , 甜叶菊糖主
要含有甜菊醇 、甜菊苷(简称为ST)、斯替维伯苷 、
莱鲍迪苷A(简称为 RA)、莱鲍迪苷 B 、莱鲍迪苷
D 、莱鲍迪苷 E 、杜尔可苷A 、杜尔可苷 B 、悬钩子
苷[ 2 ,3] 。市售甜菊糖一般以甜菊苷为主要成分 , 该
组分甜度为蔗糖的 200倍左右 , 其后味略带甘苦
味。其中莱鲍迪苷 A 约占 25%左右 , 其甜度为蔗
糖的 350 ～ 400 倍 , 口味纯正 , 没有后苦味。含
80%RA苷的甜菊糖市价比一般混合型甜菊糖要高
出4 ～ 5倍 。目前报道的分离手段主要有:高效液
相色谱法[ 4] , 液滴逆流分配层析法 , 薄层色谱法 ,
重结晶法 , 超临界萃取法 , 毛细管电泳法等[ 5] 。
Tomas Vanek等[ 6] 采用反相色谱法对甜叶菊糖进行
了分离 , 本实验用氨基柱对 ST 和 RA两种主要成
分进行分离鉴定 , 对分离条件进行了进一步探索 ,
获得了较好的分离效果 。
1　实验部分
1.1　仪器和试剂
Waters ZQ-4000 2695 型液相色谱-质谱联用
仪 , Waters 2996 型二极管阵列检测器 , Masslynx
4.0 色谱工作站。甜叶菊糖标准品(Sigma), 乙腈
(分析纯), 水为二次蒸馏水 , 甜菊糖粗品由赣菊
糖厂提供 。
1.2　色谱及质谱条件
色谱柱:Kromasil NH2柱(250 mm ×4.6 mm
i.d., 5μm);流动相:V(乙腈)∶V(水)=75∶25;
柱温:30 ℃;流速:0.6 mL min;进样量:20 μL;
DAD检测:210 ～ 400 nm 。
ESI离子源电离 , 毛细管电压:3.0 kV;锥孔
电压:30 V;离子源温度:110 ℃;脱溶剂温度:
350 ℃;脱溶剂气流速:250 L h;扫描质量范围:
50 ～ 1500 amu。负离子模式。
1.3　标准溶液配制
准确称取甜叶菊糖标准样品 10.5 mg 于25 mL
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收稿日期:2006-06-20;修订日期:2006-08-27
基金项目:江西省教委基金(JJ2006-07)项目资助
作者简介:刘　超(1982-), 男 , 硕士研究生
DOI :10.13595/j.cnki.issn1000-0720.2007.0191
容量瓶中 , 用 V(乙腈)∶V(水)=70∶30定容至刻
度 , 再超声 5 min , 得到浓度为 0.4200 mg mL 的甜
叶菊糖标准溶液 。
2　结果与讨论
2.1　色谱条件的选择
国外有报道选用 ODS柱进行测定 , 但实验发
现分离效果不理想。很大可能是甜叶菊糖结构中
含有葡萄糖单元 , 易溶于水 , 有很强的极性 , 对于
这类物质的分离选用氨基柱更为适合。分别选用
甲醇-水 、乙腈-水不同体积比作为流动相 , 发
现甲醇-水作为流动相时不能将甜叶菊糖各组分
分离开来 , 而乙腈-水作为流动相时 , 乙腈比例
太低分离效果不好 , 乙腈比例太高保留时间太长 ,
当 V(乙腈)∶V(水)=75∶25时分离效果较好 。由此
可以说明甜叶菊糖的色谱行为类似正相色谱。在
不同 pH 情况下进行分离 , 实验发现甜叶菊糖在酸
性条件下分离效果不好 , 可能是由于使用的氨基
柱在酸性条件下 , 氨基被质子化 , 具有离子交换
的功能 , 不利于甜叶菊糖的分离。最后实验发现
甜叶菊糖在中性条件下分离效果较好。
2.2　标准品及样品色谱图
图中 1为甜菊苷(ST), 2为莱鲍苷 A (RA)。
图2的样品经过结晶提纯 , 得到图 3 和图 4的样
品。
2.3　甜叶菊糖质谱分析
甜叶菊糖的两种主要成分 ST 与 RA对应峰的
质谱如图 5 所示 , ST 的质谱信息为 m z 803 , 为
[M-H] - , 其相对分子质量为 804。RA的质谱信息
为 m z 965 , 为[M-H] - , 其相对分子质量为 966。
图 1　甜叶菊糖标准品色谱图
Fig.1　Chromatogram of stevia standard
1-ST;2-RA
图 2　粗提样品色谱图
Fig.2　Chromatogram of stevia sample
1-ST;2-RA
图 3　ST 成分较高样品色谱图
Fig.3　Chromatogram of the sample containing high content
ST
1-ST;2-RA
图 4　RA 成分较高样品色谱图
Fig.4　Chromatogram of the sample containing high content
RA
1-ST;2-RA
图中丰度较高的碎片峰 m z 182 , 与甜叶菊糖结构
中的葡萄糖单元相对应 。
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图 5　甜叶菊糖样品的质谱图
Fig.5　Mass spectra of stevia
2.4　标准曲线
取标准溶液分别稀释到原溶液的 1 2 , 1 4 ,
1 8 , 1 16 , 1 32 , 分别取 20 μL 进样。由色谱工作
站处理数据 , 以质量浓度为横坐标 , 峰面积为纵
坐标 , 制得两条标准曲线 , ST 与RA相应的回归方
程分别为 Y =2190962ρ-769.55 , r=0.9999;Y =
2088554ρ-871.30 , r=0.9998。
2.5　回收率测定
在样品中加入一定量的标准品 , 测定 ST 和
RA 回收率 , 两者平均回收率分别为 98.61%和
97.40%, RSD分别为 2.3%和 1.3%(n =5)。
2.6　检出限
按3 倍噪声信号推算 , 甜菊苷和莱鲍迪苷 A
的检出限分别为 0.3和 4.7 ng L。检出限很低 , 这
是由于本实验采用的是总离子流(TIC)进行检测 ,
大大提高了检测的灵敏度 。
2.7　样品测定
分别称取样品 7.9 , 8.4 , 6.1 mg , 样品加入 20
mL 流动相 , 超声溶解 10 min , 离心 , 清液转入 25
mL 容量瓶中 , 用流动相定容 , 过滤后进样分析 ,
每个样品测定 3次 , 测得的样品溶液的平均浓度
见表 1。由此可计算出ST 和RA在3个样品中的质
量分数分别为 51.8%和 25.7%, 50.6%和25.3%,
41.5%和 56.9%。
2.8　分离机理的探讨
由于甜叶菊中甜菊苷(stevioside , ST)和莱鲍迪
苷A(rebaudiodside A , RA)(结构式见图 6)的结构
非常相似 , 只相差一个葡萄糖基 , 用 ODS 柱难以
实现两者的有效分离 , 而改用氨基柱却很容易实
现 , 所以本实验分别用氨基柱与 DAB 柱对 ST 和
RA进行分离 , 从而探讨氨基柱适合分离糖类物质
的原因。
DAB柱的制备:取5 g制备的氨基键合固定相
于 150 mL 圆底烧瓶中 , 加入 40 mL 无水甲苯 , 用
N2 保护 , 在 100 ℃油浴条件下滴加 5 mL甲酸和 5
mL甲醛的混合液(控制速度 , 滴加约 2 h), 反应
24 h , 冷却 , 用甲苯抽提 24 h , 依次用丙酮 、甲醇
和丙酮洗涤两次 , 60 ℃下真空干燥 8 h , 得N ,N-二
甲基氨基键合固定相(DAB)(见图 7)。
表 1　样品测定结果
Tab.1 　 Determination results of ST and RA in stevia
(mg mL, n=3)
样品编号 ρST (mg mL) ρRA (mg mL)
1 0.164 0.0813
2 0.170 0.0849
3 0.101 0.139
图 6　甜菊苷(ST)和莱鲍迪苷A(RA)的结构式
Fig.6　Molecular structures of ST and RA
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Si★ (CH2)3NH2 +HCHO +HCOOH 100 ℃
N2
Si★ (CH2)3N CH3
CH3
　DAB 固定相
图 7　氨基固定相转变为 N , N-二甲基胺基键合固定相(DAB)的路线
Fig.7　Reaction route of amino groups on the stationary phase transformed into tertiary amino groups
　　由于 DAB 上大部分氨基上的氢已被甲基取
代 , 与糖类化合物的偶极-偶极作用力以及与糖
中羰基形成分子间氢键的作用力大大减弱 , 导致
与糖类化合物的作用比氨基柱弱 , 在相同色谱条
件下对同一样品的保留时间提前且不能完全分离
开。在色谱过程中还发现当 DAB 柱流动相中乙腈
量增至85%时 , ST 和 RA 能完全分离开。采用氨
基柱和乙腈-水作流动相时 , 在强极性的糖类化
合物分离中具有优越性。实验发现 , 一方面当流
动相为甲醇体系即使是氨基柱也难于实现良好分
离;另一方面用乙腈-水作流动相在 ODS 柱上对
糖类化合物分离选择性有限。这表明 , 要实现对
糖类化合物的有效分离 , 固定相和流动相均需对
溶质有相互作用。
参考文献
[ 1] 　陈天红 , 张　杨 , 刘晓航等.中国科学(B 辑), 1999 ,
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food composition and analysis , 2001 , 14:383
Separation and identification of stevioside and rebaudiodside A in stevia by HPLC
LIU Chao , LI Lai-sheng＊ , XU Li-li and ZHOU Zhi-ming (Center of Analysis and Testing , Nanchang University ,
Nanchang 330047), Fenxi Shiyanshi , 2007 , 26(7):23 ～ 26
Abstract:A HPLC method for determination of stevioside(ST)and rebaudiodside A(RA)in stevia was developed.
The chromatographic analysis was performed on a Kromasil NH2 column by using acetonitrile-water(75∶25 , v v)as
mobile phase at a flow rate of 0.6 mL min.Diode array detector(DAD)was used to monitor in the wavelength range
from 210 to 400 nm.Meanwhile , the two components were identified by mass spectrometry.The calibration curves had
good linearity in the range of 9.0 ～ 287.6 mg L for ST and 3.9 ～ 126.1 mg L for RA.The average recoveries of ST
and RA were 98.6%(n =5 , RSD=2.3%)and 97.4%(n=5 , RSD=1.3%), respectively.The method is a
convenient , rapid and effective method for separation and qualitatively analysis of stevia.In addition , the primary ami-
no groups on the stationary phase were converted into tertiary amino groups via classical Eschweiler-clark methylation
reaction.The results showed that the retention time of the above compounds deceased with limited separation selectivi-
ty.It indicated that hydrogen-bonding and dipole-dipole interactions between the amino groups on the packing and
steviosides played a significant role in the separation.
Keywords:High performance liquid chromatography;Stevioside;Rebaudiodside A;Stevia;Determination;Separa-
tion mechanism
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