全 文 ：食 品 科 技
FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY提取物与应用
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2016年 第41卷 第08期
香草兰(Vanilla planifolia Andrews)又名香荚
兰、香果兰，是兰科香草兰属植物，原产于印度
收稿日期：2016-02-25
基金项目：陕西省教育厅2012年科学研究计划项目(12JK0602)。
作者简介：刘军海(1972—)，男，硕士，副教授，主要从事天然产物应用的研究工作。
及马来西亚，是世界上名贵香料之一，素有食品
“香料之王”的美称。我国香草兰主要分布在中
刘军海，李志洲，王俊宏
(陕西理工学院化学与环境科学学院，汉中 723000)
摘要：根据Box-Behnken中心组合实验设计，采用响应面分析优化了微波提取香草兰豆荚中香
兰素的工艺条件，并对其抗氧化活性进行研究。得到的微波提取香草兰豆荚中香兰素的最佳提
取工艺条件为：乙醇体积分数80%、料液比1:18.6 g/mL、微波时间5 min、微波温度55 ℃、微
波功率350 W，此条件下香兰素提取率为8.883 mg/g。香兰素提取液具有较好的抗氧化活性，
对DPPH自由基和羟自由基清除率分别达65.326%和89.471%，IC50分别为150.538、6 .271 μg/
mL。香草兰豆荚中的香兰素具有一定的抗氧化能力，是很有应用价值的天然食品添加剂。
关键词：香草兰豆荚；香兰素；响应面；提取；抗氧化活性
中图分类号：TS 209 文献标志码：A 文章编号：1005-9989(2016)08-0210-07
Antioxidation activities and extraction of vanilin from vanilla pods by
microwave
LIU Jun-hai, LI Zhi-zhou, WANG Jun-hong
(College of Chemistry & Environmental Science, Shaanxi University of Technology,
Hanzhong 723000)
Abstract: The microwave extraction of vanillin from vanilla pods were optimized by response surface
analysis according to Box-Behnken central composite experiment, and the anti-oxidation activities were
studied. The optimization conditions of microwave extraction technologies were ethanol volume fraction
of 80%, microwave time of 5 min, microwave temperature of 55 ℃, microwave power of 350 W, ratio of
solid of solvent of 1:18.6 (g/mL), the extraction rate of vanilin was 8.883 mg/g under this conditions. The
scavenging rate of DPPH and ·OH amounted to 65.326% and 89.471%, and the IC50 for 150.538 μg/mL
and 63.271 μg/mL respectively, which improved that the vanillin have good anti-oxidation activities, is
very valuable in the application of natural food additives.
Key words: vanilla pods; vanilin; response surface; extraction; anti-oxidation activities
微波提取香草兰豆荚中香兰素及其
抗氧化活性研究
DOI:10.13684/j.cnki.spkj.2016.08.049
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部及南部地区，海南的种植条件较好，其品质也
相对较佳。香兰素是香草兰的主要风味物质，在
食品工业中常用作定香剂、抑菌剂、抗氧化剂
等，除此之外，在医药、农业、电镀及日用化学
品等领域也有重要的应用价值[1]。近年来，随着
香兰素应用领域的拓展，需求量不断增加，但化
学合成的香兰素纯度及收率都较低，而且还存在
环境污染等问题，已经被很多国家禁止应用[2]。
随着人们对食品安全问题的日益关注，消费者更
期望从香草兰中提取天然的香兰素用作食品添加
剂，因此研究提取效率高的香兰素提取方法意义
重大。
香草兰中香兰素的提取方法目前主要报道的
有超声提取[3]、酶解法[4]、超高压[5]等。微波提取
香草兰香兰素未见报道。微波辅助提取特殊的加
热方式能快速穿透细胞壁进入物质内部对物料直
接加热，反应高效且选择性强，与传统提取方法
比较，具有节省溶剂、操作简便、提取周期短、
副产物少、提取率高等优点，已经在天然产物提
取领域展现出很好的应用前景[6-8]。本文采用微波
辅助提取香草兰豆荚中香兰素，并对其抗氧化活
性进行了研究，旨在为香草兰的合理开发及香兰
素在食品工业中的应用提供理论参考。
1 实验材料及方法
1.1 实验材料及仪器
香草兰豆荚：产自海南，清洗除杂后干燥粉
碎，过40目筛于阴凉干燥处放置备用；香兰素标准
品(纯度≥98%)：中国药品生物制品检验所；乙醇、
醋酸钠、冰醋酸、硫酸亚铁、双氧水、水杨酸、
2,2-二苯代苦味酰基苯肼基(DPPH)等：分析纯。
TU-1810紫外-可见分光光度计：北京普析通
用仪器有限公司；SHZ-D(Ⅲ)循环水式真空泵：巩
义市予华仪器有限公司；GR-200电子天平：日本
AND公司；101型电热鼓风干燥箱：北京科伟永兴
仪器有限公司；DHG-9075A型电热鼓风干燥箱：
上海一恒科技有限公司；WF-2000微波快速反应
系统：上海屹尧分析仪器有限公司；80-1型离心
机：江苏金坛正基仪器有限公司；FW117中草药
粉碎机：天津泰斯特仪器有限公司；pHS-3TC(0.01
级)精密酸度计：上海天达仪器有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 香兰素标准曲线的绘制 将香兰素标准品于
100 ℃干燥至恒重，精密称取0.05 g，用无水乙醇
溶解，移入250 mL的容量瓶中定容，配制0.2 mg/
mL的香兰素溶液。精密移取1 mL放入100 mL的容
量瓶中用无水乙醇定容，配制2 μg/mL的香兰素标
准液。分别精密移取0、1、2、4、6、8、10 mL放
入7个10 mL的具塞试管中定容作为待测液。以无
水乙醇作为空白参比在波长280 nm处测定各浓度
待测液的吸光度，记为y，并以其为纵坐标，香兰
素待测液浓度为横坐标绘制标准曲线，得回归方
程为：y=0.3187x+0.0697，R2=0.9968，说明香兰素
浓度在(0~2) μg/mL范围内线性关系良好。
1.2.2 香草兰豆荚中香兰素的提取 将备用的香草
兰豆荚粉末和乙醇水溶液按照一定的料液比配制
好后移入微波反应系统，设定微波功率、微波时
间、微波温度进行微波提取，提取后所得的混合
液经过抽滤、离心得到上清液，按照1.2.1的方法测
定吸光度，计算香草兰豆荚中香兰素的提取率。
1.2.3 香兰素提取率的计算
香 兰 素 提 取 率 ( m g / g ) = ( y - 0 . 0 0 6 9 7 ) × Q ×
V/0.3187
式中：y为待测液吸光度；
V为测定液的体积，mL；
Q为稀释总倍数。
1.3 响应面实验设计
响应面实验能很好地检验各因素及其交互作
用对香草兰豆荚中香兰素提取率的影响，在单因素
实验的基础上，根据Box-Benhnken中心组合实验设
计原理，选取乙醇体积分数X1、料液比X2、微波时
间X
3
、微波温度X4 4个因素，固定微波功率为350
W，以香兰素提取率为响应值，设计4因素3水平的
响应面实验设计优化微波提取香草兰豆荚中香兰素
的提取工艺[8]，实验因素与水平设计见表1。
表1 实验设计因素水平编码表
水平
因素
乙醇体积分数
/% X1
料液比/(g/mL)
X2
微波时间/
min X3
微波温度/℃
X4
-1 70 1:15 4 50
0 80 1:20 5 55
+1 90 1:25 6 60
1.4 香草兰豆荚中香兰素提取液抗氧化活性实验
1.4.1 清除DPPH自由基活性[10] 精密称取0.01 g的
DPPH，用无水乙醇溶解，在250 mL容量瓶中定容
作为DPPH工作液，分别量取5 mL移入编号为1~8
的10 mL具塞试管中，分别加入0.5 mL不同浓度的
香草兰豆荚香兰素提取液，震荡摇匀，于室温下
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避光静置30 min，以等量的无水乙醇加入到DPPH
组作为空白参比，于517 nm处测定吸光度，香兰
素样品液测定吸光度记为A
样品
，无水乙醇空白参
比吸光度记为A
对照
，以同浓度下的Vc清除DPPH自
由基能力做比较，按照下式计算清除率：
DPPH清除率(%)＝((1-A
样品
)/A
对照
)×100
1.4.2 清除羟自由基活性[11] Fe2+与H
2
O
2
发生Fenton
反应生成羟自由基，准备8个具塞试管并编号，每
个试管分别依次加入2 mL的6 mmol/L FeSO
4
溶液、
2 mL的6 mmol/L H
2
O
2
溶液、1 mL不同浓度的香草
兰豆荚香兰素提取液，震荡摇匀，于室温下避光静
置10 min，再加入2 mL的6 mmol/L水杨酸溶液，摇
匀，静置30 min后于510 nm处测得吸光度值A
样品
，
用蒸馏水代替水杨酸测得的吸光度记为A
参比
，用
蒸馏水代替香兰素提取液的吸光度记为A
空白
，将
同浓度下的Vc作为比较组来评价香兰素提取液清
除羟自由基能力。按照下式计算清除率：
羟自由基清除率(%)＝(1－(A
样品
-A
对照
)/A
空白
)
×100
1.5 实验数据处理
为了实验达到更高的精确度和可重复性，所
有的实验均平行3次，取平均值作为最终实验结
果，响应面实验数据采用SAS V8.02分析，其余
实验数据分析采用SPSS V17.0分析，作图用Origin
V8.0。
2 单因素实验结果与分析
2.1 乙醇体积分数的选择
实验过程中设定微波功率350 W，微波温度
50 ℃，料液比1:15 g/mL，微波时间5 min，考察
乙醇体积分数分别为40%、50%、60%、70%、
80%、90%时对香草兰豆荚中香兰素提取率的影
响，结果如图1所示。
积分数为80%时，提取率最大，此时提取剂的极
性和提取物香兰素的极性较为接近，利于提取；
乙醇体积分数大于80%后，香草兰豆荚中香兰素
的提取率显著降低。乙醇体积分数过大或者过小
均不利于香草兰豆荚中香兰素的充分提取，因此
选择体积分数为80%的乙醇作为提取剂较合适。
2.2 料液比的选择
实验过程中设定微波功率350 W，微波温度
50 ℃，微波时间5 min，乙醇体积分数80%，考察
料液比分别为1:5、1:10、1:15、1:20、1:25 g/mL时
对香草兰豆荚中香兰素提取率的影响，结果如图2
所示。
图1 乙醇体积分数对香兰素提取率的影响
图2 料液比对香兰素提取率的影响
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ඊ HN-
由图2可知，香草兰豆荚中香兰素提取率在
(1:10~1:20)g/mL范围内随着料液比的增大而增大，
1:20 g/mL时提取率最大，之后提取率小幅度减
少。料液比小，香兰素在提取剂中的传质速率也
相对较小，因此提取率低；随着料液比的增大，
传质速率增大，香草兰豆荚中大部分香兰素都能
溶出，因此提取率不断增大，但是料液比过大会
使其他醇溶性物质溶出，影响提取物品质且提取
率降低。由图2可以看出，料液比为1:15、1:20 g/
mL所对应的提取率相差很小，兼顾提取率和提取
成本，选择1:15 g/mL为较佳料液比。
2.3 微波功率的选择
实验过程中设定料液比1:15 g/mL，微波温度
50 ℃，微波时间5 min，乙醇体积分数80%，考察
微波功率分别为200、250、350、350、400、450
W时对香草兰豆荚中香兰素提取率的影响，结果
如图3所示。
微波辐射过程中产生的微波能在体系中短
时间内升温会使细胞壁破裂，促进香兰素的溶出
及在提取剂中的扩散。微波功率越大破壁效果越
好，但是过大的微波功率虽然在提取初期有利于
香兰素的溶出，但是随着提取时间的延长，产生
的局部过热现象会破坏香兰素的结构，导致提取
由图1可知，随着乙醇体积分数的增加，香草
兰豆荚中香兰素的提取率不断增大，当乙醇的体
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率降低。由图3可知，在(200~450)W微波功率范围
内，香兰素提取率先增大后减小，350 W时对应的
提取率最大，因此选择350 W为较佳微波功率。
2.4 微波温度的选择
实验过程中设定料液比1:20 g/mL，微波功率
350 W，微波时间5 min，乙醇体积分数80%，考
察微波温度分别为40、45、50、55、60、65 ℃
时对香草兰豆荚中香兰素提取率的影响，结果如
图4所示。
图3 微波功率对香兰素提取率的影响
图4 微波温度对香兰素提取率的影响
图5 微波时间对香兰素提取率的影响
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微波温度是微波辐射能的一个重要反映，
在提取香兰素过程中，微波能转化为热能，这种
热效应迅速穿透香草兰豆荚颗粒细胞壁进入分子
内部，使细胞内部温度迅速升高，从而使细胞破
裂，同时加快了香兰素分子的热运动。随着微波
温度的升高，香兰素溶出速率不断增大，提取率
也增大，微波温度为55 ℃时提取率最大，过高
的微波温度则易造成局部热量聚集，香兰素在高
温下不稳定且易挥发变质，因此提取率下降。综
上，选择55 ℃为较佳微波温度。
2.5 微波时间的选择
实验过程中设定料液比1:15 g/mL，微波功率
350 W，微波温度50 ℃，乙醇体积分数80%，考察
微波时间分别为2、3、4、5、6、7 min时对香草
兰豆荚中香兰素提取率的影响，结果如图5所示。
由图5可知：在(2~6)min范围内，香草兰豆荚
中香兰素提取率随微波时间的延长不断增大，6
min时对应的提取率最大，微波时间再延长提取率
减小。充足的微波时间为微波在香草兰豆荚颗粒
内部均匀加热提供了保障，使其达到活化状态，
增强香草兰豆荚颗粒分子内部的有效碰撞，促进
香兰素的扩散及溶出。微波时间短，不能将香草
兰豆荚颗粒中的香兰素完全提取，微波时间过长
容易使提取剂及香兰素挥发损失，因此微波时间
为6 min较佳。
3 响应面实验结果及分析
3.1 实验结果
表2 中心组合实验设计及结果
实验号
因素
提取率/(mg/g)
X1 X2 X3 X4
1 -1 -1 0 0 6.894
2 -1 1 0 0 6.483
3 1 -1 0 0 7.136
4 1 1 0 0 5.589
5 0 0 -1 -1 6.953
6 0 0 -1 1 6.645
7 0 0 1 -1 5.361
8 0 0 1 1 7.021
9 -1 0 0 -1 6.102
10 -1 0 0 1 6.227
11 1 0 0 -1 5.927
12 1 0 0 1 5.421
13 0 -1 -1 0 7.595
14 0 -1 1 0 8.027
15 0 1 -1 0 7.562
16 0 1 1 0 5.914
17 -1 0 -1 0 7.001
18 -1 0 1 0 6.709
19 1 0 -1 0 7.301
20 1 0 1 0 7.128
21 0 -1 0 -1 6.957
22 0 -1 0 1 7.110
23 0 1 0 -1 5.205
24 0 1 0 1 6.161
25 0 0 0 0 8.887
26 0 0 0 0 8.794
27 0 0 0 0 8.685
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按表1安排进行实验，响应面实验共有27组，
其中1~24是析因实验，模型的拟合度凭此检验，
25~27是零点平行实验，用来估算实验误差。响应
面实验结果见表2。
3.2 实验结果方差分析
对表2实验结果用SAS统计软件包进行响应面
分析，模型方差分析结果如表3所示。
由表3可以看出，各因素中料液比达到非常
显著统计程度(P<0.01)，说明实验过程中料液比对
香兰素的提取影响很大；微波温度达到显著统计
程度(P<0.05)。通过比较各因素所对应的F值可知
各因素对提取率的影响由大到小的顺序是：料液
比(X
2
)>微波时间(X
3
)>微波温度(X
3
)>乙醇体积分数
(X
1
)。交互项中的X
2
X
3
、X
3
X
4
以及所有二次项达到
非常显著统计水平(Pr<0.01)。说明香兰素提取过
程中，X
2
X
3
、X
3
X
4
的交互作用对实验结果影响较
大，因此实验过程中要控制好条件。
表3中模型已达到0.01显著统计程度，因此，
可以用该回归方程替代实验真实点对实验结果进
行分析。决定系数R2=0.9551，总量变异中仅有
4.49%不能由该模型解释，这是因为香兰素提取过
程中影响因素并不仅限于表1所列的4个变量，未
计入方程的变量、以及这些变量与表1变量之间的
交互作用对回归方程造成一定影响，同时实验过
程中总会不可避免地产生随机误差，因此模型可
以用来模拟香兰素的实际提取情况。失拟检验中
Pr>0.05，不显著，说明此模型与实际实验拟合情
况好，无失拟因素存在，可用该模型来分析和预
测香兰素的提取率。从实际生产角度出发，无需
考虑更多因素对产品香兰素提取率的影响。
综合以上分析可知，可以用该回归方程替代
实验真实点对实验结果进行预测和分析。最后得
到的回归方程为：
Y=8.788667-0 .076167X
1
-0 .567083X
2
-
0 . 2 4 1 4 1 7 X
3
+ 0 . 1 7 3 3 3 3 X
4
- 1 . 2 5 5 7 9 2 X
1
2 -
0.284X
1
X
2
+0.02975X
1
X
3
-0.15775X
1
X
4
-0.916417X
2
2-
0.52X
2
X
3
+0.20075X
2
X
4
-0.593417X
3
2+0.492X
3
X
4
-
1.609292X
4
2
3.3 提取工艺的响应曲面分析与优化
3.3.1 响应曲面分析 采用Statistica6.0绘制响应面
及等高线图形，结果见图6。
响应曲面图及等高线图可直观地反映出交互
作用对实验结果影响的显著程度，由响应曲面图
可看出影响因素与指标的变化规律。图6中(a)、
(b)、(c)、(e)的等高线基本接近圆形，说明交互
作用不显著；而(d)、(f)的等高线呈现明显的椭圆
形，且响应曲面陡峭，说明X
2
(料液比)与X
3
(微波
时间)、X
3
(微波时间)与X
4
(微波温度)的交互作用
对实验结果影响，这与表3分析结果吻合。同时
由图6还可以看出，椭圆的中心点均处于-1与1
之间，即各交互因素的最佳作用点都落在实验
范围之内，说明响应面优化实验因素水平选择
比较成功。
3.3.2 回归方程的优化 对3.2得到的回归方程
选择回归分析的向后法，剔除回归方程中显著
水平小于0.05的项，以简化方程。得到的最后
方程为：
Y=8.78867-0.56708X
2
-0.24142X
3
-1.25579X
1
2-
0.91642X
2
2-0.52X
2
X
3
-0.59342X
3
2+0.492X
3
X
4
-
1.60929X
4
2
决定系数R2＝91.62%，即剔除变量后，回
归方程自变量的变化仍可以解释91.62%的因变量
变化，且剔除变量后的方程达到0.01显著统计程
度，结果理想。
对此方程分别对X
1
、X
2
、X
3
、X
4
求偏导，
并等于零。可求得X
1
＝0、X
2
＝-0.285701、X
3
表3 模型的方差分析
因素 自由度 平方和 均方 F值 Pr 显著性
X1 1 0.06980.06980.71300.4150
X2 1 3.85903.859039.43500. 001**
X3 1 0.69890.69897.14210.0203*
X4 1 0.3605.36053.68430.0790
X1
2 1 8.41198.411985.96050.0001**
X1X2 1 0.32260.32263.29690.0945
X1X3 1 0.00360.00360.03680.8511
X1X4 1 0.09950.09951.01720.3331
X2
2 1 4.47864.478645.76700. 001**
X2X3 1 1.0816.081611.05280.0061**
X2X4 1 0.16120.16121.64730.2236
X3
2 1 1.87861.878619.19760.0009**
X3X4 1 0.96830.96839.89460.0084**
X4
2 1 13.81173.8117141.14090.0001**
模型 14 24.97531.784018.23020.0001**
总误差 12 1.17430.0979
纯误差 2 0.0204.0102
失拟项 10 1.15380.115411.290.0841
R2=0.9551
注：P<0.01为极显著，标为**，P<0.05为显著，标为*。
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＝-0.0835309、X
4
＝-0.0127687，最大响应值为
8.880。由此可求得最佳工艺条件，考虑到实际操
作的便利性，则乙醇体积分数80%、料液比1:18.6
g/mL、微波时间5 min、微波温度55 ℃，固定微波
功率为350 W，进行3次平行验证实验，得香兰素
平均提取率为8.883 mg/g。
4 香草兰豆荚香兰素提取液的抗氧化活性研究
4.1 DPPH自由基清除能力
清除率增幅不明显，而Vc依然线性增大。香兰素
提取液在270 μg/mL时对DPPH的清除率最大，为
65.326%。通过线性回归方程得到的香兰素提取
液的IC
50
为150.538 μg/mL，Vc的IC
50
为91.882 μg/
mL，说明香兰素提取液清除DPPH自由基能力不
及Vc。
4.2 羟自由基清除能力
图7 清除DPPH自由基实验结果
图8 清除羟自由基实验结果
ຌᬓည ใऎ7DᯭПገଡԨ «HN-
ຌᬓည ใऎ «HN-
7DᯭПገଡԨ 按照1.4.2的方法进行羟自由基清除实验研
究，结果如图8所示。由图8可以看出，香兰素提
取液清除羟自由基能力在(0~180)μg/mL范围内均
弱于Vc，随着提取液浓度的增大，香兰素提取液
清除羟自由基能力不断增强，在高浓范围内清除
羟自由基能力与Vc比较接近，在180 μg/mL时清
除率达到了89.471%。通过线性回归方程得到的
图6 响应曲面分析
: : : ::: 9 9 9 9 999 99 999
B C DE F G
按照1.4.1的方法进行DPPH自由基清除实验
研究，结果如图7所示。由图7可以看出，随着Vc
及香兰素提取液浓度的增大，DPPH自由基的清
除率不断增大，表现出一定的量效关系。香兰素
提取液在浓度大于210 μg/mL后DPPH自由基的
食 品 科 技
FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY提取物与应用
· 216 ·
2016年 第41卷 第08期
香兰素提取液的IC
50
为63.271 μg/mL，Vc的IC
50
为
40.360 μg/mL，说明香兰素提取液具有较强的清
除羟自由基能力，但比Vc稍弱。
5 结论
与传统工艺相比，微波提取具有提取成本
低、快速、高效、绿色环保等特点。采用响应面
优化所得的微波提取香草兰豆荚中香兰素的最佳
工艺条件为：乙醇体积分数80%、料液比1:18.6
g/mL、微波时间5 min、微波温度55 ℃、微波功
率为350 W，在此条件下，香兰素提取率达8.883
mg/g。
香草兰豆荚香兰素提取液对DPPH自由基和羟
自由基均具有一定的清除能力，最大清除率分别
达65.326%、89.471%，清除效果与浓度呈量效关
系，效果稍弱于Vc。香兰素作为天然的食品香料
及抗氧化剂具有很好的应用前景，其开发利用还
需进行更多的深入研究。
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本刊启事
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