全 文 ：基金项目:哈尔滨市科技创新人才研究专项资金项目(2006RFQXS097);黑龙江省教育厅科学技术研究资助项目(11511289);黑龙江大学博士
启动基金项目
作者简介:郑春英 , 女, 副教授 , 博士　　＊通讯作者:平文祥 , 男 , 教授 , 硕士生导师　　Tel:(0451)86608586　　E-mail:wenxiangp@ya-
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毛细管电泳法同时检测刺五加叶中的芦丁和金丝桃苷含量
郑春英 ,刘松梅 ,李宏涛 ,石震华 ,平文祥＊(黑龙江大学生命科学学院 ,微生物黑龙江省高校重点实验室 ,哈尔滨 150080)
摘要:目的　建立简单 、快速且能同时分离测定刺五加叶中芦丁 、金丝桃苷含量的毛细管电泳法。 方法　采用毛细管电泳法 ,
缓冲体系为 0.2mol· L-1NaH2PO4 , 0.1 mol· L-1 Borax及双蒸水(10∶7∶3, pH8.8),熔融石英毛细管柱(25μm×45cm),分离
电压为 20kV, 检测波长为 254nm, 进样时间为 30s, 进样高度 10cm。结果　芦丁 、金丝桃苷在 125 ～ 750, 200 ～ 1 200mg· L-1
与峰面积线性关系良好 ,线性方程分别为:Y=144 145ρ+423.8(r=0.999 9)及 Y=216 836ρ-191.57(r=0.999 9), 样品平均
回收率为 99.38%及 100.39%。结论　该方法简单 、快速 、准确 、重现性好 ,不同生长时期 、不同产地的刺五加叶中两成分均存
在一定的差异。
关键词:刺五加叶;高效毛细管电泳;芦丁;金丝桃苷
中图分类号:R286.02　　　文献标识码:A　　　文章编号:1001-2494(2008)10-0783-04
SimultaneousDeterminationofRutinandHyperininAcanthopanaxsenticosus(Rupr.etMaxim)Leaves
byHigh-PerformanceCapilaryElectrophoresis
ZHENGChun-ying, LIUSong-mei, LIHong-tao, SHIZhen-hua, PINGWen-xiang＊(KeyLaboratoryofMicrobiology,
LifeScienceCollege, HeilongjiangUniversity, Harbin150080, China)
ABSTRACT:OBJECTIVE　Todevelopasimpleandrapidhigh-performancecapilaryelectrophoresis(HPCE)coupledwithUV
detectionmethodforthedeterminationofrutinandhyperininAcanthopanaxsenticosus(Rupr.etMaxim)leavessimultaneously.
METHODS　Thebufferwascomposedof0.2 mol· L-1 NaH2PO4 , 0.1 mol· L-1 Boraxanddoubledistilledwater(10∶7∶3, pH
8.8)solution.Capillaryelectrophoresiswasperformedusinga25μm×45cmfusedsilicacapillarycolumn.Separationvoltagewas20
kV, detectionwavelengthwassetat254 nm, andtheinjectiontimewas30 sataheightof10cm.RESULTS　 Thelinearrangeof
rutinwasfrom125 ～ 750mg· L-1 , itslinearregressionequationwasY=144 145ρ+423.87(r=0.999 9), andtheaveragerecovery
was99.38%, whilethelinearrangeofhyperinwasfrom200 ～ 1 200 mg· L-1 , itslinearregressionequationwasY=216 836ρ-
191.57 (r=0.999 9), andtheaveragerecoverywas100.39%.CONCLUSION　Thismethodcanbeusedforthequalitycontrolof
theAcanthopanaxsenticosus(Rupr.etMaxim)leaveswithgoodprecision.Thecontentsofrutinandhyperinarediferentin
Acanthopanaxsenticosus(Rupr.etMaxim)fromdiferentplacesanddiferentcolectionperiods.
KEYWORDS:Acanthopanaxsenticosus(Rupr.etMaxim)leaves;HPCE;rutin;hyperin
　　刺五加 [ Acanthopanaxsenticosus(Rupr.＆ Max-
in)Harms]系五加科植物 [ 1] , 主产于黑龙江省山区 ,
为北方道地药材 ,其根 、根茎(五加参)、叶 、花及果
均可入药 [ 2] 。刺五加的各部位均含有黄酮类化合
物 ,其叶含量最高 [ 3] ,并以金丝桃苷 、芦丁 、槲皮素
等为主要活性成分[ 4] 。
关于刺五加叶中黄酮类成分的检测方法 ,大多
采用比色法 [ 5-6] 或 HPLC[ 7-8] 。高效毛细管电泳
(HPCE)以其高效 、快速 、低消耗的特点而倍受人们
青睐 ,并广泛的用于中草药的活性成分检测 [ 9] 。关
于 HPCE测定刺五加叶中芦丁 、金丝桃苷含量的研
究 ,未见报道。本实验采用 HPCE测定刺五加叶中
2种主要黄酮类成分———芦丁及金丝桃苷的含量 ,
旨在建立一种简单 、快速且能同时分离测定刺五加
叶中芦丁 、金丝桃苷含量的方法 ,并为评价刺五加叶
的质量提供参考。
1　仪器与试剂
1229-HPCE高效毛细管电泳仪(北京新技术应
用研究所);HW2000色谱工作站;pHS-25型电子
pH计(上海精科雷磁);电子天平(MetlerToledo,美
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国);KQ100-DE型超声波清洗机(昆山市超声仪器
有限公司);摇摆式高速粉碎机(大德公司);石英毛
细管柱(25μm×45cm,河北永年光学纤维厂)。
芦丁及金丝桃苷对照品均购于中国药品生物制
品检定所 (批号分别为:100080-200306, 11521-
200303);刺五加药材采自黑龙江省 ,并经黑龙江省
中医研究院付克治研究员鉴定为五加科植物刺五
加 ,该样品现保存于黑龙江大学生命科学学院;试剂
均为分析纯 。
2　方法与结果
2.1　电泳条件
无涂布毛细管柱 25 μm×45 cm,有效长度 30
cm;温度 ,室温;重力进样 ,进样高度 10 cm;进样时
间 30 s, 缓冲体系为 0.2 mol· L-1 NaH2 PO4 -0.1
mol· L-1 Borax-双蒸水 (10∶7∶3, pH8.8);分离电
压 20kV;检测波长 254nm。
毛细管柱在第一次使用前依次用 0.1 mol·L-1
NaOH、双蒸水 、0.1 mol·L-1 HCl、双蒸水 、缓冲溶液
分别冲洗 5h。每次进样间隔均依次使用 0.1mol·
L-1 NaOH、双蒸水冲洗毛细管各 5 min,再以缓冲液
冲洗毛细管 5 min后进样分析 。
2.2　对照品储备液的制备
分别精密称取芦丁及金丝桃苷对照品各 2mg,
以甲醇溶解成 2 000 mg·L-1的对照品储备溶液;放
置 -4 ℃冰箱中保存 。在使用前 ,按要求稀释为不
同质量浓度的工作溶液。
2.3　供试品的制备
取刺五加叶样品粉末(60目)1.0 g,精密称定 ,
置具塞锥形瓶中 ,精密加入甲醇 30 mL,称定重量 ,
超声提取 30 min后 ,取出 ,放冷 ,再称定重量 ,加甲
醇补足减失的重量 ,摇匀 ,滤过 , 精密量取滤液 20
mL,浓缩至近干 , 残渣以甲醇定容至 1 mL, 并以
0.22μm的微孔滤膜滤过后作为供试品溶液 ,备用 ,
或置于 -4 ℃的冰箱中储存。
供试品中芦丁及金丝桃苷的鉴别采用对照品加
入法。
2.4　线性关系考察
分别精密吸取 0.125, 0.250, 0.375, 0.500,
0.625及 0.750 mL芦丁对照品储备液置于 6个 2
mL量瓶内 , 并依次加入金丝桃苷对照品储备液
0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0及 1.2 mL后用甲醇稀释至
刻度 ,摇匀 ,作为对照品混合溶液 ,进样 ,测定峰面
积 。以对照品的质量浓度(mg·L-1)为横坐标(ρ),
峰面积为纵坐标(Y)绘制标准曲线 ,计算各自的回
归方程 ,芦丁及金丝桃苷的线性关系见表 1,电泳图
见图 1。
表 1　芦丁及金丝桃苷线性关系考察结果
Tab.1　Linearrangesofrutinandhyperin
Analyte Regresionequation
Corelation
coeficient
Linearrange
/mg· L-1
LOD
/μg· L-1
Rutin Y=144 145ρ+423.87 0.999 9 125 ～ 750 1.83
Hyperin Y=216 836ρ-191.57 0.999 9 200 ～ 1 200 1.22
图 1　芦丁及金丝桃苷对照品电泳图
1-芦丁;2-金丝桃苷
Fig.1　Electropherogramofstandardsolutionof500mg· L-1
rutinand800mg· L-1 hyperin
1-rutin;2-hyperin
2.5　精密度考察
取对照品混合液(芦丁 500 mg· L-1 ,金丝桃苷
800mg·L-1)连续进样 6次 ,每次进样 30s,测得芦
丁与金丝桃苷对照品峰面积的 RSD分别为 3.23%和
2.12%(n=6);迁移时间的 RSD分别为 2.18%及
2.19%(n=6)。结果表明 ,此分析方法精密度良好。
2.6　稳定性实验
取对照品混合液(芦丁 500mg·L-1、金丝桃苷
800 mg·L-1)于配制当日每隔 2 h,连续 12 h考察
样品的日内稳定性 ,测得日内芦丁 、金丝桃苷对照品
峰面积的 RSD分别为 1.73%和 2.25%(n=6);迁
移时间的 RSD分别为 2.08%及 2.59%(n=6)。日
间稳定性实 验 , 取对照品 混合液 (芦丁 500
mg· L-1 、金丝桃苷 800mg·L-1)在配制 6d内 ,每
日进样 ,考察样品的日间稳定性 ,结果芦丁与金丝桃
苷对照品在 6日内峰面积的 RSD分别为 3.09%和
2.44%(n=6);迁移时间的 RSD分别为 1.28%和
1.27%(n=6),表明芦丁 、金丝桃苷对照品溶液在 6
日内稳定性良好。
2.7　方法重现性实验
取同一产地刺五加叶样品(尚志 , 5月末)6份 ,
按 “ 2.3”项下操作方法制备样品溶液 ,经测定样品
中芦丁和金丝桃苷的含量分别为 0.292 8 mg· g-1
和 0.711 1 mg· g-1 , 其 RSD分别为 1.96%和
1.37%(n=6),结果表明 ,该方法对芦丁和金丝桃
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苷的含量测定具有较好的重现性。
2.8　回收率实验
精密称取同一已知含量的刺五加叶样品(尚
志 , 5月末),共 5份 ,分别精密加入芦丁和金丝桃苷
对照品 ,按供试液制备方法制备样品 ,以优选的条件
进行测定 ,结果见表 2。
表 2　回收率实验结果 .n=5
Tab.2　Recoveryofsyringinandchlorogenicacidinsamples.n=5
Sample
Rutin Hyperin
Amountsin
samples
/mg
Spiked
amounts
/mg
Found
amounts
/mg
Recoveries
/%
Mean
recoveries
/%
RSD
/%
Amounts
insamples
/mg
Spiked
amounts
/mg
Found
amounts
/mg
recoveries
/%
Mean
recoveries
/%
RSD
/%
1 0.292 9 0.375 0 0.670 2 100.61 0.712 5 0.600 0 1.318 2 100.95
2 0.293 0 0.375 0 0.665 3 99.28 0.709 0 0.600 0 1.312 7 100.62
3 0.292 8 0.375 0 0.658 2 97.43 99.38 1.82 0.715 3 0.600 0 1.310 9 99.27 100.39 1.53
4 0.292 8 0.375 0 0.679 4 101.73 0.709 7 0.600 0 1.301 2 98.58
5 0.292 7 0.375 0 0.659 7 97.87 0.713 9 0.600 0 1.329 0 102.52
　　从表 2中可以看出 , 样品中芦丁回收率为
97.43% ～ 101.73%;金 丝 桃 苷 的 回 收 率 为
98.58% ～ 102.52%。
2.9　样品测定
取不同采集地点及不同生长时期的刺五加叶样
品 ,每种样品按供试品制备方法制得刺五加叶供试
品液 5份 ,采用外标一点法测定样品 ,计算含量 ,结
果见表 3 ,电泳图见图 2。
表 3　供试品测定结果
Tab.3　Contentsofrutinandhyperininsamples
Sample ColectingTime
Producing
area
Rutin
/mg· g-1
Hyperin
/mg· g-1
1 May Shangzhi 0.292 8 0.711 1
2 June Shangzhi 0.180 7 0.225 7
3 July Changshou 0.133 2 0.200 0
4 July Mudanjiang 0.297 9 0.587 8
5 July MaoerMountain 0.406 7 1.047 0
6 August MaoerMountain 0.367 4 1.039 0
图 2　供试品电泳图
1-芦丁;2-金丝桃苷
Fig.2　Electropherogramofsample
1-rutin;2-hyperin
3　讨　论
3.1　缓冲液体系及缓冲液浓度对分离的影响
实验过程中 , 分别以不同浓度 NaH2PO4溶液 、
Borax溶液及 NaH2PO4-Borax缓冲液为分离体系 ,考
察缓冲体系对分离效果的影响 ,结果当运行缓冲体
系(runningbufer)为 0.2 mol· L-1 NaH2 PO4 , 0.1
mol·L-1 Borax及双蒸水(10∶7∶3)时 ,芦丁与金丝
桃苷得到了较好的分离 。因此确定最佳缓冲液体系
为 0.2 mol·L-1 NaH2PO4 , 0.1mol· L-1 Borax及双
蒸水(10∶7∶3)。
3.2　缓冲体系 pH值的选择
缓冲体系 pH值是影响分离度的重要因素。实
验中 ,固定分离电压与进样时间 ,对缓冲液 pH值从
5.0 ～ 11.0每隔 1个单位进行考察 ,结果发现 , pH
值在低于 6.0及高于 10.0时 ,分离效果较差;因此
确定缓冲液最佳 pH值范围在 6.0 ～ 10.0内 ,并又
在此范围内每隔 0.2个单位进行系统考察 ,结果当
缓冲液 pH值为 8.8时 ,芦丁与金丝桃苷峰形最好
且与其他物质有较好的分离 ,故选择缓冲液的 pH
值 8.8为最佳条件。
3.3　分离电压的筛选
施加在工作电极上的电压对获得较好的分离度
及灵敏度有重要的影响 ,在实验中 ,分别以 14, 16,
18, 20, 22, 24 kV为分离电压对供试品进行分析。
当分离电压为 20 kV时 ,芦丁与金丝桃苷得到较好
的分离 ,且迁移时间及峰面积适中;当分离电压过低
时 ,迁移时间延后且峰形有拖尾现象;当分离电压过
高时 ,迁移时间提前 ,样品没有较好的分离。所以实
验过程中选择 20 kV为分离电压。
3.4　进样时间的选择
进样时间是影响供试品分离效果的关键因素 ,
进样时间过短将导致灵敏度低;进样时间过长将使
毛细管负载 ,并使峰形加宽。本实验采用重力进样 ,
在进样高度为 10 cm时依次考察了进样时间 5, 10,
15, 20, 25, 30, 35及 40 s对供试品中芦丁及金丝桃
苷的峰面积及迁移时间的影响 ,结果发现随着进样
时间的增加 ,芦丁及金丝桃苷的峰面积增高 ,迁移时
间延长 ,在进样时间超过 30 s时 ,芦丁及金丝桃苷
　　 (下转第 800页)
·785·中国药学杂志 2008年 5月第 43卷第 10期　　　　　　　　　　　　　　　 ChinPharmJ, 2008May, Vol.43No.10
在小鼠肺中药物分布数据为根据进行对比 , 见图 2。由图 2
可见两者拟和非常好 ,说明我们所设计的多室线性循环模型
能很好刻画靶室中药动学过程。同时求得参数如下:
F% = DTFQ0 =
KT(1+ΘT)(KT+KNT)[ 1 -e
-(KT+KNT)t0 ]
e-K-1(t-t0)=A(1-e-Kt0)e-K-1(t-t0)
A=1.369 3, K=0.961 6, K-1 =0.036 1, t0 =1.076 5。
图 2　白蛋白微球肺中药物分布-时间曲线
-＊--实验数据点;----拟合曲线
Fig.2　Drugdistribution-timecurveinlung
-＊--experimentaldata;----regresedcurve
2.2　方程 15的准确性
以文献 [ 4]中白蛋白微球在小鼠体内药物分布数据为根
据 , 利用实验所得血液中药-时曲线求出初值 , 应用牛顿迭代
法求得血室中药-时函数表达式。 应用此表达式计算 0 ～ 72
h血室中药物浓度 , 求得药-时曲线。以文献 [ 4]中白蛋白微球
在小鼠血液中药物分布数据为根据进行对比 , 见图 3。由图
3可见基本吻合。这可能是由于白蛋白微球都集中到靶室 ,
血液中药物浓度比较小 , 影响因素比较多造成一定拟合偏
差。说明我们所设计的多室线性循环模型能很好刻画血液
中药动学过程。
2.3　由讨论 “ 2.1”, “ 2.2”可见 , 方程 12对靶器官中药-时曲
　　
图 3　白蛋白微球血液中药物分布-时间曲线
-＊--实验数据点;----拟合曲线
Fig.3　Drugdistribution-timecurveinblood
-＊--experimentaldata;----regresedcurve
线的拟合非常准确 ,说明模型是正确的。而方程 15对血液中
药-时曲线的拟合偏差稍微大一些 ,这可能是由于 TODDS主要
聚集在靶器官, 血液中药物量比较少 , 同时影响因素比较多 ,
造成拟合偏差稍微大一些。这证明了我们所建立的多室线性
循环模型用于描述 TODDS体内过程的可行性和实用性。此
结果还提示其他形式和其他器官的主动或被动靶向给药系统
在体内的过程用多室线性循环模型来描述的可能性。
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(收稿日期:2007-01-09)
(上接第 785页)
的峰面积出现拖尾现象 ,且峰形不对称 ,因此本实验
选择 30 s为最佳进样时间 。
4　结　论
本实验在优化条件下对刺五加叶中芦丁与金丝
桃苷的含量进行了测定。结果表明 ,帽儿山地区七
月的刺五加叶中的芦丁与金丝桃苷含量均为最高 。
不同产地刺五加叶及同产地不同采集时间刺五加叶
中芦丁与金丝桃苷的含量均存在一定的差异;采用
毛细管电泳法测定刺五加叶中黄酮类成分具有简便
快速 、准确 、灵敏度高 、重复性好等特点 ,适合于刺五
加叶中芦丁与金丝桃苷分析及含量测定。
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·800· ChinPharmJ, 2008May, Vol.43 No.10　　　　　　　　　　　　　 中国药学杂志 2008年 5月第 43卷第 10期