全 文 ： Journal of Pharmaceutical Analysis 药物分析杂志
·473· 药 物 分 析 杂 志 Chin J Pharm Anal 2016,36(3)
Chinese
HPLC指纹图谱技术在傣药灯台叶资源评价中的应用 *
杨妮娜 1，2，杨天梅 3，赵应红 1**，王元忠 3**
（1.西双版纳傣族自治州傣医医院，西双版纳 666100；2.云南中医学院，昆明 650500；
3.云南省农业科学院药用植物研究所，昆明 650200）
摘要　目的：建立不同产地灯台叶 HPLC指纹图谱，为灯台叶产地鉴别、质量控制和评价提供科学依据，
推动傣药现代化发展进程。方法：采用正交试验设计优化灯台叶超声提取方法，建立 HPLC指纹图谱。
色谱条件：采用 Agilent ZORBAX Eclipse XDB C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以 0.1%甲酸水（A）-
乙腈（B）为流动相，梯度洗脱（0~5 min，5%B；5~35 min，5%B→ 42%B；35~40 min，42%B→ 80%B；
40~50 min，80%B→ 95%B；50~65 min，95%B），流速 1.0 mL·min-1，柱温 30 ℃，检测波长 287 nm，进样量
5 μL。结合相似度评价及聚类分析对不同产地灯台叶指纹图谱进行比较。结果：正交实验结果表明，
70%甲醇水溶液超声 50 min，料液比 1∶10为最佳提取条件。建立了灯台叶 HPLC指纹图谱，确定了 10
个共有峰。海南中和、广西南宁北湖村、海南海口高新区等 3个产地样品相似度小于 0.8，系统聚类中被
逐一分开；海南万宁、广东广州和海南海口海府大道 3个产地样品相似度介于 0.8~0.9之间；海南文昌、广
东东莞、海南乐东、海南琼海、广西南宁六安村、西双版纳勐海、西双版纳勐腊 7个产地样品相似度均大于
0.9，系统聚类分析能聚为一类。结论：不同产地灯台叶化学组分较相似，但含量差异明显。海南文昌、广
东东莞、海南乐东、海南琼海、广西南宁六安村 5个产地样品与传统药用产地西双版纳灯台叶样品质量相
似，可以作为傣药灯台叶药材来源。
关键词：灯台叶；糖胶树；傣药；指纹图谱；相似度评价；聚类分析；药材资源评价；高效液相色谱法
中图分类号：R 917　　　文献标识码：A　　　文章编号：0254-1793（2016）03-0473-07
doi：10.16155/j.0254-1793.2016.03.013
Application of HPLC fingerprint technology in the resource
evaluation of Alstonia scholaris （L.） R.Br.*
YANG Ni-na1，2，YANG Tian-mei3，ZHAO Ying-hong1**，WANG Yuan-zhong3**
（1. Department of Pharmaceutics，Dai Hospital of Xishuangbanna Dai Autonomous Prefecture，Xishuangbanna 666100，China；
2. College of TCM，Yunnan University of TCM，Kunming 650500，China；
3. Institute of Medicinal Plants，Yunnan Academy of Agricultural Sciences，Kuming 650200，China）
Abstract　Objective：To establish the HPLC fingerprint of Alstonia scholaris （L．） R．Br．from different origins
for identification，quality control and resource evaluation，so as to promote the development of Dai medicine
　　*　 云南省自然科学基金重大项目（2013FC006）
　　**　 通信作者　赵应红　Tel：15887797260；E-mail：15887797260@163.com
　　　　　王元忠　Tel：13888829994；E-mail：boletus@126.com
第一作者　Tel：15887615937；E-mail：yangnina-2008@163.com
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·474· 药 物 分 析 杂 志 Chin J Pharm Anal 2016,36(3)
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modernization process．Methods：Ultrasonic extraction method was optimized by orthogonal experiment design，and
the HPLC fingerprints were defined．Chromatographic conditions：The HPLC fingerprints were obtained by the Agilent
ZORBAX Eclipse XDB C18 （250 mm×4．6 mm，5 μm） chromatographic column with the mobile phase of water containing 0．1% formic acid（A）-acetonitrile（B） for gradient elution （0-5 min，5%B；5-35 min，5%B→ 42%B；
35-40 min，42%B→ 80%B；40-50 min，80%B→ 95%B；50-65 min，95%B） at the flow rate of 1．0 mL·min-1．
The wavelength was set at 287 nm，the column temperature was maintained at 30 ℃，and the injection volume was 5
μL．The fingerprints of Alstonia scholaris （L．） R．Br．from different regions were analyzed by similarity evaluation
and cluster analysis．Results：Ultrasonic optimum condition was 70% methyl alcohol，50 min，1∶10 （ratio of solid
to liquid）．The HPLC fingerprint of Alstonia scholaris （L.）R.Br.was established，and totally 10 common peaks were
selected．Samples from Hainan Zhonghe，Guangxi Nanning Beihu village and Hainan Haikou Gaoxinqu were separated
for the similarity less than 0.8．Sample similarity of Hainan Wanning，Guangdong Guangzhou and Hainan Haikou
Haifu road was between 0.8-0.9．Similarity of Hainan Wenchang，Guangdong Dongguan，Hainan Ledong，Hainan
Qionghai，Guangxi Nanning Liuan village was more than 0．9，similar with Xishuangbanan Menghai and Mengla．
Conclusion：Sample chemical composition from different origins is similar，but the content difference is obvious．
Sample quality of Hainan Wenchang，Guangding Dongguan，Hainan Ledong，Hainan Qionghai，and Guangxi Nanning
Liuan village is similar to those of traditional origin Xishuangbanan，which can be used in Dai clinic．
Keywords：Folium Alstoniae Scholaris；Alstonia scholaris （L．） R．Br．；Dai medicine；fingerprint
chromatography；similarity evaluation；cluster analysis；herbs resource evaluation；HPLC
民族医药是我国传统医药的瑰宝，新中国成立以
来党和国家高度重视民族医药的发展［1］。傣药作为
“四大民族药”（藏、蒙、维、傣）之一，具有 2 500多年
的历史，其种类繁多，仅云南西双版纳民间傣药就有
228科，372属，1 300多种，涵盖了植物药、动物药、矿
物药和其他类药，是傣族人民几千年与疾病斗争的结
晶［2］。受南传佛教、贝叶文化、东南亚文化、中原汉文
化的影响，形成了以“四塔”、“五蕴”、“风病理论”、“解
毒理论”为核心的傣医药理论，极具民族、传统和区域
性。与藏、蒙、维、苗、壮、彝等其他民族药相比，傣药
发展水平相对滞后，主要表现在傣药材资源分布研究
匮乏，药材活性成分研究报道较少，构效关系研究相
对薄弱，质量标准水平整体偏低［1-3］。
傣药研究与开发利用应结合现代研究方法和手
段，在药效物质基础不明确，缺乏相应对照品的情况
下，构建一种从整体角度评价药材质量的方法迫在眉
睫。中药指纹图谱是指中药材经适当处理后，采用
一定分析手段得到能够标示该中药特性的化学成分
的色谱或光谱图，具有整体性、模糊性、特征性、专属
性、可量化性、有效性等特点，能够全面表征药材内在
化学成分的种类和数量，体现药材整体质量信息及不
同产地、采收期、加工方法和药用部位的差异性［4-7］。
HPLC法由于检测速度快，分离效果好，准确度高，稳
定性和重现性良好，能满足不同性质样品的测定，在
中药和其他民族药中已广泛应用［8-10］。
灯台叶为夹竹桃科鸡骨常山属糖胶树（Alstonia
scholaris （L.） R.Br.）的干燥树叶，傣语习称“摆埋丁
别”，性寒，味苦、微涩，入火、水塔，有清火解毒、消肿止
痛、止咳化痰的功效，傣医临床常用于呼吸系统疾病
和跌打损伤的治疗［11］。灯台叶富含生物碱、黄酮、萜
类等活性成分，具有解痉平喘、抗炎镇痛、抗肿瘤、抗氧
化、调节免疫、调节血糖的药理活性［12-19］。灯台叶传
统产区为云南西双版纳一带，由于长期毁林造田，导致
野生灯台叶资源日益枯竭，寻求新兴产区中质量稳定
的灯台叶纳入傣药临床应用是亟待解决的问题。
本研究以灯台叶为材料，采用 HPLC法，建立不同
产地灯台叶 HPLC指纹图谱，结合相似度评价、聚类分
析对不同产地灯台叶药材质量进行综合评价，研究结
果以期为扩大灯台叶药材来源及资源评价提供科学
依据，探讨指纹图谱技术在傣药研究中应用的可行性。
1　仪器与试药
1.1　仪器
日本岛津 LC-10 ATvp型高效液相色谱仪（包括
二极管阵列检测器、二元泵、手动进样器、CLASS-VP
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工作站）；Agilent ZORBAX Eclipse XDB C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；电子分析天平（美国奥豪斯公
司）；超声波清洗机（上海科导超声仪器有限公司）。
1.2　试剂
乙腈（色谱纯，美国 Fisher）；水（自制超纯水）；
甲醇、乙醇（分析纯，四川西陇化工有限公司）；甲酸
（分析纯，天津风船化学试剂科技有限公司）。
1.3　样品
13批供试样品分别采自广东、广西、云南、海南 4
个产区，经西双版纳傣医院傣药主任药师赵应红鉴定
为灯台叶，详细信息见表 1。样品采集后晒干，粉碎，
过 2号筛，自封袋密封，避光，阴凉干燥处保存。
表 1　灯台叶样品来源
Tab. 1　The origins of Alstonia scholaris （L.） R.Br.
样品编号
（sample No.）
产地
（origin）
采集时间
（date）
S1 海南中和（Hainan Zhonghe） 2014.12
S2 海南万宁（Hainan Wanning） 2014.12
S3 海南文昌（Hainan Wenchang） 2014.12
S4 海 南海口海府大道（Hainan Haikou Haifu
road）
2014.12
S5 海南琼海（Hainan Qionghai） 2014.11
S6 海南乐东（Hainan Ledong） 2014.11
S7 海南海口高新区（Hainan Haikou Gaoxinqu） 2014.11
S8 广东广州（Guangdong Guangzhou） 2014.12
S9 广东东莞（Guangdong Dongguan） 2014.12
S10 广 西南宁北湖村（Guangxi Nanning Beihu
village）
2014.07
S11 西双版纳勐海（Xishuangbanna Menghai） 2014.10
S12 西双版纳勐腊（Xishuangbanna Mengla） 2014.10
S13 广 西南宁六安村（Guangxi Nanning Liuan
village）
2015.01
2　方法与结果
2.1　色谱条件
色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：0.1%甲酸水（A）-乙腈（B），
洗 脱 梯 度（0~5 min，5%B；5~35 min，5%B→ 42%B；
35~40 min，42%B→ 80%B；40~50 min，80%B→ 95%B；
50~65 min，95%B）；流速：1.0 mL·min-1；柱温：30 ℃；
检测波长：287 nm；进样量：5 μL。
2.2　供试品溶液的制备
精密称取灯台叶粉末 0.5 g于洁净试管中，加
70%甲醇 5 mL，密封试管口，超声（500 W，53 kHz）
50 min，取出，静置 10 min，取上清液，0.22 μm微孔
滤膜过滤，续滤液即为供试品溶液。
2.3　样品测定
分别精密吸取各批次供试品溶液 5 μL，注入高
效液相色谱仪中，按“2.1”项色谱条件进行测定，记
录色谱图。
2.4　方法学考察
2.4.1　精密度试验　取 S11号灯台叶样品，按“2.2”
项方法制备供试品溶液，按“2.1”项色谱条件连续进
样 6次，考察各共有峰相对保留时间和相对峰面积。
结果相对保留时间的 RSD＜ 0.32%，相对峰面积的
RSD＜ 4.42%，表明仪器精密度良好。
2.4.2　重复性试验　取 S11号灯台叶样品 6份，按
“2.2”项方法制备供试品溶液，依次进样，考察各共有
峰相对保留时间和相对峰面积。结果相对保留时间
的 RSD＜ 0.72%，相对峰面积的 RSD＜ 3.96%，表明
方法重复性良好。
2.4.3　稳定性试验　取 S11号灯台叶样品，按“2.2”
方法制备供试品溶液，分别于 0、2、4、8、12、24 h进
样分析，记录色谱图，考察各共有峰相对保留时间和
相对峰面积。结果相对保留时间的 RSD＜ 0.27%，
相对峰面积的 RSD＜ 4.32%，表明供试品溶液在
24 h内稳定性良好。
2.5　正交试验
单因素实验结果表明以 70%甲醇水溶液为提取
溶剂，料液比 1∶15，超声 40 min时总峰面积较大，峰
数目较多，分布均匀，分离度，峰形较好。综合单因素
实验结果，以甲醇浓度、提取时间、料液比为考察因
素，分别取 3个水平，选择 L9（33）正交表进行正交试
验，结果见表 2。
从表 2看出较优水平组合为 A2B3C1，从极差 R
的大小可以看出对峰面积影响的程度顺序为 C＞
B＞ A，即料液比＞超声时间＞甲醇浓度。因此，
最佳提取条件为 70%甲醇水溶液超声 50 min，料液
比 1∶10。
2.6　不同产地灯台叶指纹图谱的建立
取不同产地 13批样品，按“2.2”项下方法制备
供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样，记录色谱
图，将 13批样品色谱图数据导入“中药色谱指纹图
谱相似度评价系统（2004A版）”，以西双版纳产样品
S12为参考图谱，时间窗宽度 0.50 s，得到 13批样品
指纹图谱叠加图，见图 1、2，色谱峰匹配得到 10个共
有峰，共有峰面积见表 3。
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表 2　正交试验结果与分析
Tab. 2　The result and analysis of orthogonal test
试验号
（No.）
因素（factor） 总峰面积
（total peak area）A B C
1 1 1 1 18 734 772
2 1 2 2 13 197 857
3 1 3 3 7 146 611
4 2 1 2 15 202 495
5 2 2 3 5 439 811
6 2 3 1 24 353 971
7 3 1 3 7 443 235
8 3 2 1 21 576 464
9 3 3 2 14 643 130
K1 39 079 240 41 380 502 64 665 207K2 44 996 277 40 214 132 43 043 482K3 43 662 829 46 143 712 20 029 657k1 13 026 413 13 793 500 21 555 069k2 14 998 759 13 404 710 14 347 827k3 14 554 276 15 381 237 6 676 552
极差（range）R 1 972 346 1 976 527 14 878 517
主次顺序（sequence） C＞ B＞ A
优水平（optimal level） A2 B3 C1
优组合（optimal combination） A2B3C1
图 1　灯台叶参照指纹图谱
Fig. 1　Reference fingerprint of Alstonia scholaris （L.） R.Br.
从图 2中可以看出，灯台叶化学成分主要集中
在 a、b、c 3个区域，a区域与 1号共有峰对应，b区
域与 2、3、4、5号共有峰对应，c区域与 7、8号共有
峰对应。结合表 3中 1号共有峰面积可以看出 a区
域中 S1、S6、S7号样品与对照图谱相应共有峰面积
差距较大，且 1号共有峰面积的 RSD为 98.99%，
在 10个共有峰中最大，说明不同产地 13批灯台
叶中 1号共有峰含量差异最大。b区域对应的 2、
3、4、5号共有峰面积的 RSD在 52.08%~67.33%之
间，仅次于 1号共有峰，表明不同产地 13批灯台叶
中 2、3、4、5号共有峰峰面积差异相对较大。c区
域中峰面积变化幅度较小，相对稳定。综上可知，
不同产地灯台叶化学组分基本相似，但含量差异
较大。
2.7　不同产地灯台叶相似度评价
将 13批样品色谱图原始数据导入“中药色谱
指纹图谱相似度评价系统（2004A版）”，以药用产地
S12样品为参考图谱，时间窗宽度 0.50 s，生成对照指
纹图谱，将 13批样品色谱图与对照指纹图谱进行比
较，结果 S1~S13 号样品的相似度分别为 0.707、
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图 2　不同产地灯台叶指纹图谱
Fig. 2　HPLC fingerprint of Alstonia scholaris （L.） R.Br.from different regions
表 3　不同产地灯台叶共有峰面积
Tab. 3　Areas of common peaks for thirteen batches of Alstonia scholaris （L.） R.Br.from different regions
样品编号
（sample No.） 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
S1 47 494 196 668 238 147 386 204 354 449 416 561 123 724 61 065 60 226 34 585
S2 249 239 1 571 592 336 214 2 679 947 759 742 477 139 117 098 45 872 68 591 37 640
S3 256 970 888 607 375 337 988 346 866 225 392 449 188 212 87 792 140 259 144 951
S4 145 158 544 702 228 721 557 732 555 670 460 891 113 155 46 027 61 228 63 505
S5 259 563 1 678 610 407 778 1 033 438 1 098 969 433 379 246 231 91 741 112 025 149 505
S6 96 026 1 369 976 564 342 1 539 259 753 741 261 989 129 381 59 380 62 034 148 674
S7 88 054 625 690 94 411 328 506 241 105 564 338 95 033 56 313 71 042 84 915
S8 1 387 016 2 296 729 460 123 373 221 2 325 082 706 521 213 223 131 004 248 743 361 202
S9 867 881 3 504 697 291 657 1 445 331 1 548 935 760 994 96 424 48 085 92 185 116 545
S10 2 090 532 761 178 701 658 820 038 2 915 698 661 210 210 989 103 401 217 640 85 593
S11 899 278 3 371 815 832 227 1 294 030 2 410 095 502 738 157 658 63 658 172 467 82 769
S12 1 053 823 2 211 570 481 095 2 128 862 1 514 410 396 267 176 916 79 526 105 674 112 970
S13 682 616 2 766 354 195 632 2 685 644 913 425 870 781 170 948 78 248 171 782 181 999
SR 624 896 1 676 014 400 565 1 250 812 1 250 580 531 174 156 845 73 239 121 838 123 450
RSD/% 98.99 64.94 52.08 65.87 67.33 32.53 31.07 34.6 52.11 68.3
0.879、0.929、0.827、0.954、0.913、0.755、0.821、
0.946、0.777、0.934、0.955和 0.921，表明不同产地 13
批样品相似度不尽相同，大致可以分为Ⅲ类：第Ⅰ类，
S1、S7、S10相似度小于 0.8；第Ⅱ类，S2、S4、S8相似
度在 0.8~0.9之间；第Ⅲ类，S3、S5、S6、S9、S11、S12、
S13相似度大于 0.9，说明其与药用产地灯台叶质量
相似。
2.8　不同产地灯台叶聚类分析
为反映不同产地灯台叶的整体质量，本实验选用
13批样品所有峰面积的原始数据进行聚类分析，研
究不同产地样品之间的关系。将 13批样品峰面积原
始数据导入 SPSS 16.0进行系统聚类，采用组间连接
法，以相关系数作为样品相似度的距离公式，聚类结
果见图 3。
从图 3可以看出，不同产地 13批样品在距离
为 25时都聚为 1类。在距离为 20时，聚为 3类，
与相似度评价结果相近。当距离从 15到 10的过
程中样品 S10、S8、S4、S7、S1依次被分开，单聚为
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一类，表明该 5个产地样品与其他产地样品距离较
远。相似度大于 0.9的样品 S9、S11、S12、S5、S3、
S2、S6、S13始终聚为一类，表明该 8个产地样品距离
较近。
图 3　13批灯台叶聚类分析树状图
Fig. 3　Cluster analysis dendrogram of thirteen batches of Alstonia
scholaris （L.） R.Br.
3　讨论
3.1　色谱条件的优化
研究分别对水 -甲醇、水 -乙腈、甲酸水 -甲
醇、甲酸水 -乙腈、磷酸水 -乙腈、三乙胺水 -乙
腈等不同溶剂系统的不同比例进行了梯度试验，并
对 Agilent ZORBAX Eclipse XDB C18 （250 mm×4.6 mm，5 μm）、Agilent ZORBAX SB C18 （250 mm×4.6 mm，5 μm）、Agilent ZORBAX Extend C18 （250 mm×4.6 mm，5 μm）等色谱柱进行了比较，结果表
明以 0.1%甲酸水（A）-乙腈（B）为流动相，流速
1.0 mL·min-1，柱温 30 ℃，检测波长 287 nm，进样量
5 μL时，各色谱峰分离度和峰形较好，峰数目较多，
分布均匀，基线平稳。
3.2　不同产地灯台叶指纹图谱差异性
药用植物有效成分多为植物次生代谢产物，而次
生产物的合成、积累与外界光照、温度、土壤等生态环
境因子密切相关，是药用植物在特定环境下长期生存
选择的结果，外界环境的变化直接或间接影响代谢产
物的类型和数量［20-22］。相关研究表明，灯台树在不同
光照、坡度、温度等种植条件下，植株光合作用、抗氧
化酶、生物总量变化较大，对灯台叶质量产生影响［23］。
指纹图谱、相似度评价及聚类分析结果表明，不同产
地灯台叶化学成分相似，但含量不同。以上差异可能
与灯台叶产地气温、光照、降雨量等因素有关，有待进
一步深入研究。
3.3　HPLC指纹图与传统鉴别方法分析
《云南省中药材标准》（2005年版）第七册中关
于灯台叶药材鉴别主要以性状鉴别和以薄层鉴别为
主。近年，有学者采用单指标成分鸭脚树叶碱含量
对灯台叶药材进行定量评价［24］。但以上方法均难以
反映药材质量的整体变化，本研究建立灯台叶药材
HPLC指纹图谱，结合相似度评价和聚类分析对不同
产地灯台叶质量进行评价，结果表明该方法可体现不
同产地灯台叶质量的整体信息及变化。
3.4　相似度评价与聚类分析
相似度和聚类分析的结果显示，采自广西南宁六
安村、海南文昌、海南琼海、海南乐东、广东东莞等 5
个产地样品与西双版纳样品相似度均大于 0.913，聚
为一类，以上 5个新兴产区灯台叶与传统药用产地灯
台叶质量接近，可以作为傣药灯台叶的药材来源，以
扩大药用资源。广西南宁北湖村、海南海口高新区、
海南中和 3个产地样品相似度小于 0.8，不用于傣医
临床。
4　结论
本实验建立的灯台叶 HPLC指纹图谱方法精密
度、稳定性、重复性良好。将指纹图谱数据与相似度
评价、聚类分析相结合可反映不同产地灯台叶质量的
整体变化。研究结果为灯台叶药材来源及资源评价
提供科学依据。
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（本文于 2015年 4月 27日收到）
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