全 文 ：食用菌学报 1 98 9. 5( 3): l一 5
A t c
a 及才 uls i厂、碑刀君诬
双抱蘑菇原生质体同核体
及杂交异核体的 R A P D分析 `
马爱民
(华中农业大学应用真菌研究所 , 武汉
潘迎捷
(上海市农业科学院食用菌研究所 , 上海
关海山
、
(香港中文大学生物系 , 香港 )
4 3 00 7 0 )
20 1 1 0 6 )
摘 要 本研究以双袍蘑菇原生质体同核体及 杂交异核体为材料 , 用 5 对随机双引物进行
R A P D 分析 。 结果表明 , R A PI ) 反应扩增出的特异 D N A 谱带能够将原生质体同核体与异核体出发
菌株以及杂交异核体与同核体亲本明显区别开来 。 因此 , R A P D 分析是一种快速有效的手段 , 能够
在双袍蘑菇的遗传研究和菌种改良中发挥重 要作用 。
关键词 双泡蘑菇 ; 原生质体同核体 ; 杂交异核体 ; R A P D
双抱蘑菇 (月 、 a ir 。 : ib咖、 , )是一种在世界各地广为栽培并深受人 们喜爱的食用菌 , 其总产量已占全球食用菌总产量的 40 % 〔`〕 。 为了解决当今双抱蘑菇优质菌种奇缺与商业化生产
迅猛发展之间的矛盾 , 我们开展了双抱蘑菇原生质体同核体杂交育种技术研究 。
由于双抱蘑菇属于二极性次级同宗结合 ( S ec on d ar y ho m ot ha il sm )类型 , 具有独特的性生
活周期 , 加之菌丝体呈多核状态且缺乏锁状联合 , 因此 , 在双抱蘑菇的育种实践中 , 对同核体与
异核体的鉴别要比异宗结合担子菌的单核体与双核体的鉴别困难得多图 。 曾经使用过的遗
传标记有三种 , 即营养缺陷型标记 (3J 、 同工酶标记川和 RF L P 标记 (5J , 但是这些标记都有不尽
人意之处 , 如营养缺陷型标记很难获得 ;同工酶标记易受生理因素和环境条件的影响 , 稳定性
较差 ;而 R F L P 标记则需要制备探针和 oS ut h er n 杂交 , 比较麻烦且费时 。 由于缺乏有效的遗
传标记 , 使得双抱蘑菇菌种的遗传改 良进程十分缓慢 。
19 9 0 年 , 由 w i ll i a m s 等 〔6〕建立的随机扩增 多态性 D N A ( R a n d o m A m p l if i“ p o l ym o r p h i e
D N A
,
R” D )技术 , 其作用与 R F L P 相似 , 但比 R F L P 更具优越性 , 因此在各种生物中得到广
泛应用 。 在食用菌方面 , 应用这一技术进行种质资源的评估和原生质体融合子的鉴定已有不
少报道 〔7 一 ` 0] 。 本研究应用该技术对双抱蘑菇原生质体同核体及杂交异核体进行分析 , 试图为
双抱蘑菇的遗传研究与菌种改 良提供有效的遗传标记 。
1 材料与方法
收稿日期 : 19 9 8一 0 7 一 2 8 初稿 ; 1 99 8 一 0 8 一 10 修改稿 。
, 上海市科委资助项 目。
DOI : 10. 16488 /j . cnki . 1005 -9873. 1998. 03. 001
2 食 用 菌 学 报 5卷
1
.
1 供试菌株
本试验所用菌株均 由上海市农业科学院食用菌研究所菌种保藏中心提供 , 其中 A S 为异
核体出发菌株 , 5A 一 5 、 5A 一 1() 、 5A 一 1 3 、 5A 一 3 4 、 5A 一 3 8 、 5A 一 4 5 、 5A 一 4 6 、 A S 一 5 4 、 A S 一 5 5 、
A S 一 6 0 、 A S 一 61 为来自 5A 菌株的原生质体同核体 , A S 二 45 只 A n 一 18 、 3A 一 8 x 2A 6 一 14 、 7A
一 10 火 A 10 一 2 2 为杂交异核体菌株 , 5A 一 4 5 、 A l l 一 1 8 、 3A 一 8 、 2A 6 一 14 、 7A 一 1 0 、 A 1 0 一 2 2 为
杂交异核体的同核体亲本 。
1
.
2 基因组 D N A 的提取
参考 L e e 等 〔’ `〕的方法 (稍有改动 ) , 收集经 P D M (马铃薯 2 0 0 9 , 葡萄糖 20 9 , 麦芽糖 1 9 , 水
I O0 m )L 培养 4 周的菌丝 , 液氮冷冻后迅速研成粉末 , 加入 2 倍体积的裂解缓冲液 〔50 m m ol / L
T r i s 一 H e l , p H 7
.
2
,
s o m m o l / L E D T A
,
p H 7
.
2
,
3 % SD s
,
l % 启一 琉基 乙醇 ( p一 m e r e a p t oe t h a n o l )〕 ,
6 5℃ 温浴 l h , 然后分别用苯酚 、 苯酚 /氯仿 ( V / V = 1 / 1) 以及氯仿抽提 , 上清液用异丙醇沉淀 ,
沉淀经 70 % 乙醇洗涤 , 真空干燥 , 最后溶于适量的 T E ( 10 m m ol / L T ir s 一 H CI , l mmo l/ L E D -
T A
,
p SH
.
0) 中 , 4℃保存 , 同时通过紫外比色和 0 . 7 % 琼脂糖凝胶电泳对所提 D N A 的纯度和浓
度进行测定与验证 。
R A P D 反应
随机引物 本试验所用引物为美 国 O eP or n T ce hno lgo ie s 公司生产的 iK t A 试剂盒中
门j内、à
的 10 个随 机 引物 , 其 编号 依次 从 O P 0A 5 一 ( ) P A 14 , 相 应 的核 普酸 序列 ( 5 ’ ~ 3 ’ )分 别为
A G G G G T C T T G
、
G G T C C C T G A C
、
G A A A C G (
了
G T G
、
G T G A C G T A G G
、
G G G T A A C G (二G 、 G T -
G A T CG CA G
、
C A A T C G C C G T
、
T CG G C G A T A G
、
C A G C A C C C A C
、
T C T G T G C T G G
o
1
.
3
.
2 反应条件及产物检浏 基本上按 w i il a m s 等闹 的方法 , 反应物总体积为 25 川 , 其中包
括 s o m m o l / L K e l , l o mmo l / L T r i s 一 H C I , p H g
.
0
,
2
.
s m m o l / L M g e l Z
,
0
.
0 0 1% 明胶 , o 一 mmo l / L
4 种 D N PT s ( P or m e g a ) , 0
.
Z mmo U L 双 引 物 , 2 5 n g 基 因 组 D N A , l u T叫 D N A 聚 合酶
( P or m e g a )
。 扩增反应在 P T C 一 1 0 0 一 9 6 ( M . J . R e s e a r e h l n C ) P C R 扩增仪上进行 , 共进行 4 0 次
循环 , 每次循 环 94 ℃变性 l m in , 35 ℃ 退火 l im n , 72 ℃ 延伸 Zm in , 最后一次循环在 72 ℃ 补平
10 im
n , 终止温度为 4℃ 。 扩增产物经 1 . 8 %琼脂糖 ( N us ive e3 : 1 , FM )C 凝胶 电泳分离 , 澳化乙
锭 ( E )B 染色 , 紫外光下观察结果并拍照 。
2 结果与分析
2
.
1 原生质体同核体的 R A P D 扩增结果
本研究所选用 的 O p e ot n K i t A 中的 1 0 个共 5 对随机双 引物 ( O P 0A 5 / 0 6 、 O P0A 7 / 0 8 、
O P 0A 9 / 1 0
、
O P A I 1/ 12
、
O P A 1 3 / 14) 对供试的 5A 菌株及其原生质体同核体都能进行扩增 , 扩
增产物最少的为 2 条谱带 , 最多的为 13 条谱带 , 分子量最小的谱带为 60 b p , 最大的谱带为
82 b0 p
。 其中 O P 0A 7/ 08 、 o P A l l / 1 2 、 O PA 13 / 14 三对引物扩增效果及重复性较好 , 原生质体同核体与异核体出发菌株相比 , 扩增的谱带一般要少些 , 前者缺失了后者中的一些主要谱带 (图
1 )
。
2
.
2 杂交异核体的 R A P D 扩增结果
应用筛选出来的上述 3 对引物对杂交异核体进行扩增 , 结果表明 , 3 对引物都能得到扩增
产物 , 其中引物 O P A 13 / 14 效果最佳 , 能同时将 3 个杂交异核体及其同核体亲本进行有效的扩

4 食 用 菌 学 报 5 卷
有效的扩增 , 产生特异的谱带 , 而这些特异的谱带 , 能够将原生质体同核体与异核体出发菌株 、
杂交异核体与同核体亲本明显地分别开来 。 这说 明 R A P D 分析的确是一种十分有效 、 快速 、
简便的方法 , 在今后的双抱蘑菇遗传理论研究和菌种改良实践中一定能够发挥重要的作用 。
3
.
2 本研究中 , R A P D 反应采用的是随机双引物 , 这样就增加了引物与模板的结合位点 , 从理
论上讲能够比单引物得到更多的扩增产物 , 试验结果表明其效果并不十分明显 , 但是扩增产物
的最大长度却比单引物扩增的最大长度小了许多 (另见报道 ) , 这一结果同我们以前在香菇 中
报道 的结果是一致的 lt2 〕 。 -
参 考 文 献
C h a n g S T
.
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,
1 9 9 6
.
1 一 1 0 .
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6 53 1 一 6 5 3 5 .
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, in a as r e v e a le d b y th e op ly m
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.
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.
3 期 马爱民等 :双抱蘑菇原生质体同核体及杂交异核体的 R A P D分析
R A P D A nal y si o sf Pr o to Pl a s t edH o mo kar yo s na nd
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K e y w o r ds A即 r ic u s b is 加 r u ` ; P r o t o p l韶 t e d hom o k a r y o n ; H y b r id h e t e or k a r y o n : R A P D
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