全 文 ：第 2卷 第 4鹅 生 物 物 理 学 报
A C TA BIO P HY SA I CI S NI CA
、 ro 】 . 2 No 。 4
x9 8 6年 : 2忆 : De e .1 9 8
竹红菌甲素对红细胞膜光敏
作用机理的研究
郑 建 华 程 尤 生
飞从科学院生物物理研究 厂厂
摘 要
;二文彭`究 一户 ; }东 仃红细胞膜的光敏化子日月 , 证实己` {一泣无敏 i飞: 川是需要讯分子参加的 。 还 r三_
用单重态氧 ,伍碎灭刊 N a N 3 初 D A B C O , ; ’ 之及 O丁超城阴离子自山基碎灭刘 S O D酶 , :术研究甲索
只J一红细胞悦蛋亡 奋 〕粗迄类脂光软 f匕过程的反应机理 . 结果表明 , N : 从 . D A B C O和 S O D 酶分别对
哄蛋 { 旧H 华和悦类 n污的光城化 ; ’之有明显的影明 , 仅 N ` N 3对膜蛋白光敏交联有部分抑制作用 。 下
玉性光敬 {iJ 刊左 D : 。 }飞也未见明皿加剧。 说明甲素对红细胞膜的光狡化机理可能涉及 , 0 2或 o 了.
, 、 ! 也有其 `己的 ` i乃i发态氧 ” 了 匕作川 。
在光生物学的研究 中 , 有关光敏作用原初反应机理的研究是一个 一 }一分 重要的课题 , 多
年来在这方面己进行了大量的工作 。 现已 发现多数光敏化反应需要 0 2分子参加 。 这些光敏
剂是属于光动力型敏化剂 ` ’ 〕 。 `已们 一与 0 2的作用方式主要有两种 l卫 ’ : 一是在光的作用下 , 敏
化剂分子吸收 一r 光子能量成为三重态敏化剂 , 可以通过能量传递过程 , 将 能 量 传给氧分
子 , 使氧分 一子处于激发单重态氧 ` O : , 然后 ’ O : 与底物分子作用。 此种反应称 为 第 l 类光
动力反应 。 另一种是光敏化剂与 0 2之间通过电 一 r 转移 , 将敏化剂的电子传给氧分 子而形成
超氧阴离子 自由 基 o了 , 此活性 自由基再与底物进行反应 。 这种反应称为第 I 类光动力反
应 。
新型光敏化剂竹红菌甲素 ( 以下简称 甲素 H ` ) 是一种十分有效的光疗药物 , 日前已应
用于临床 。 关于它的光敏反应机理 已进行了一些研究 。 张曼华等 人 l “ , ` ’ 曾对甲素在有 0 : 存
在下的光化学光物理特性进行了研究 。 发现甲素光照后有较高的 ` 0 2量子产率 。 其动 o2 量子
产率为。 . 2 一 1 , 与常用的亚甲兰光敏剂差不多 。 但是在甲素的 自敏光氧化反应中 , 甲素的光
氧化并不是通过 ’ 0 : , 也不是通过激基缔合物或激 发复合物 , 而是通过激发 态 甲素与基态
a o : 直接作用而生成 甲素过氧化物 。
汪汉卿等 (未发表的资料 ) 用电子 自旋共振方法观察到甲素光照 时 能 产 生 自由基信
号 , 表明甲素也可能通过自由基机理进行反应 。
至于甲素对红细胞膜光敏作用的机理尚不清楚 。
本文 J I的是通过使川多种 `q 和 「1山慕拌灭剂 , 进一步研究甲素对 人 红 细胞膜蛋自和
类脂光氧化过程的反应机理 ;
生 物 物 理 学 报 l今 8 6年
材料与方法
一 、 成剂
甲素 由云南微生物研究所提供 。 使用时用二甲基亚讽配 成 2 x1 0一 3M 甲素溶液备用 。
5 , 5 ` 一二硫代双〔 2 一硝 基苯甲酸 〕 , 即 5 、 5 ` 一 (l i t zl i o b i s〔 2 一 n i t r 。 b e n z o i c a 。 i d 〕
简称 D T N B , 德国 C a r l R o t h厂的产品 。
叠氮钠和 s 0 D酶 (超氧化物歧化酶 ) 系 s i g m a公 司产品 。
1 , 4 偶氮 2 , 2 , 2 双环辛烷 ( D A B C o ) 是德国 F L I一 K 人公 ,魂产占J: 。
D : O系北京化工厂产 品 , 含量 9 . 8 % 。
丙烯酸胺系M e r c k公司产品 。 S D S重结晶后使用 , 其余听有药 品均为分析纯 。
二 、 红细胞膜的制备及膜蛋白的测定方法见前文 !三 :
三 、 光照条件 、 膜蛋白硫氢纂 测定 、 类脂过氧化物的测定及 S D S 聚丙烯酞 胺凝胶电泳
方法均见前文 “` 。
四 ,通 N : 方法 : 将待测样品放入带有橡皮塞的试管 ,于, , :于管插入两个注射针头形成气
路 。 通入 高纯 N 之 , 通气时间为 45 分钟 。 通气后的样品在密闭的试管 中用注射 器 注 入甲素
(终浓度 o . 95 X 1 0 一 ` M ) , 混匀后在冰浴条件下光照 。 然后测定 s H基或类脂过 氧化物 。
五 、 D : 0效应 : 已知 ’ 0 2在 D 之o 中寿命比在 H : 0中长约 1 0倍 ` 了’ 。 我们用 D : 0代替 H 20 , 观
察了 D 2 0对 `0 : 的影响 。 将红细胞膜悬液用超速离心 ( 3 万转 /分 ) 离心 30 分 钟 , 倒去上清
液 , 沉淀用 D 20 稀释成所需浓度 , D : o 含量 9 % 。 然后 加甲素光照 , 光照后测 定 S H基及膜
蛋白的变化 。 以 H 2 0作溶剂的对照样品同样处理 。
六 、 S O D酶 、 N a N : 、 D A B C O的碎灭作用 :
, o 之碎灭剂 N a N : 、 D A B e o 和 O百碎灭剂 s o D酶等在光照前力l}入膜样八}: L }, , 使 最 终浓度
分别为 2 . 5 火 1 0 一 z M 、 1 0一 SM和 1-0 d M 。 光照条件 、 S H堪测定和类脂过氧化物测定见前文 {”
七、 高压液相色谱 ( H P L )C 分析 :
竹红菌甲素 , 氧化竹红菌甲素均用 二甲亚 飒和氯仿配成 1 。“ “ M 溶液 。 甲素光照样品系
在通 0 2情况下光照 1小时处理的样品 。 产物分析在美国W 。 , e r s高压液相色谱仪上进行 。 测
定条件 : 一 ,了室温相同 , 为 2 4℃ , 色谱柱价 B o n d o aP k C 一 1。反相哄析往 , 流动和 : 甲醇 : 水
= 70 : 30 ( V / 、
一
)
。 流速 : Zm l/ 分 , 记录纸速 : 20 c m /小时 。
结 果
一 、 竹红菌甲案光敏作用的特性
我 们实验 了甲素在有氧和无氧条件下对人的红细饱膜的光敏作 川 , 测 定 了膜蛋白51 1
毖和类脂过氧化的变化 。 结果如 图 l 和图 2 听示 。
山图 1 可以看出 , 红细胞膜在甲素存在时通入 N : 迷毛, 光照不同时间 甲素 对膜蛋白 s H
鹉没有影响 , s H基含量基本保持不变 。 而在有氧情 i兄下 , 尤照时甲素可引起 膜 蛋白 s H基
含量下降 。 图 2 的结果也 同样表 明 , 甲素在通 N : 产训青况 一 l; 对红细胞膜类脂不起光敏氧化 { j
用 。 但在有氧时 , 甲索可使膜类脂随光照时问增加而 )lJ 剧 喊化反应 , 丙 二 醛 的 生成 也增
生 物 物 理 学 报 l今 86 年
材料与方法
一 、 成剂
甲素 由云南微生物研究所提供 。 使用时用二甲基亚讽配 成2x 1 0一 3 M甲素溶液备用 。
5, 5 ` 一二硫代双〔 2 一硝 基苯甲酸 〕 , 即 5 、 5 ` 一 (l i t zl i o b i s〔 2 一 n i t r 。 b e n z o i c a 。 i d 〕
简称 D T N B , 德国 C a r l R o t h厂的产品 。
叠氮钠和 s 0 D酶 (超氧化物歧化酶 ) 系 s i g m a公 司产品 。
1 , 4 偶氮 2 , 2 , 2 双环辛烷 ( D A B C o ) 是德国 F L I一 K 人公 ,魂产占J: 。
D : O系北京化工厂产 品 , 含量 9 . 8 % 。
丙烯酸胺系M e r c k公司产品 。 S D S重结晶后使用 , 其余听有药 品均为分析纯 。
二 、 红细胞膜的制备及膜蛋白的测定方法见前文 !三 :
三 、 光照条件 、 膜蛋白硫氢纂 测定 、 类脂过氧化物的测定及 S D S 聚丙烯酞 胺凝胶电泳
方法均见前文 “` 。
四 ,通 N : 方法 : 将待测样品放入带有橡皮塞的试管 ,于, , :于管插入两个注射针头形成气
路 。 通入 高纯 N 之 , 通气时间为 45 分钟 。 通气后的样品在密闭的试管 中用注射 器 注 入甲素
(终浓度 o . 95 X 1 0 一 ` M ) , 混匀后在冰浴条件下光照 。 然后测定 s H基或类脂过 氧化物 。
五 、 D : 0效应 : 已知 ’ 0 2在 D 之o 中寿命比在 H : 0中长约 1 0倍 ` 了’ 。 我们用 D : 0代替 H 20 , 观
察了 D 2 0对 `0 : 的影响 。 将红细胞膜悬液用超速离心 ( 3 万转 /分 ) 离心 30 分 钟 , 倒去上清
液 , 沉淀用 D 20 稀释成所需浓度 , D : o 含量 9 % 。 然后 加甲素光照 , 光照后测 定 S H基及膜
蛋白的变化 。 以 H 2 0作溶剂的对照样品同样处理 。
六 、 S O D酶 、 N a N : 、 D A B C O的碎灭作用 :
, o 之碎灭剂 N a N : 、 D A B e o 和 O百碎灭剂 s o D酶等在光照前力l}入膜样八}: L }, , 使 最 终浓度
分别为 2 . 5 火 1 0 一 z M 、 1 0一 SM和 1-0 d M 。 光照条件 、 S H堪测定和类脂过氧化物测定见前文 {”
七、 高压液相色谱 ( H P L )C 分析 :
竹红菌甲素 , 氧化竹红菌甲素均用 二甲亚 飒和氯仿配成 1 。“ “ M 溶液 。 甲素光照样品系
在通 0 2情况下光照 1小时处理的样品 。 产物分析在美国W 。 , e r s高压液相色谱仪上进行 。 测
定条件 : 一 ,了室温相同 , 为 2 4℃ , 色谱柱价 B o n d o aP k C 一 1。反相哄析往 , 流动和 : 甲醇 : 水
= 70 : 30 ( V / 、
一
)
。 流速 : Zm l/ 分 , 记录纸速 : 20 c m /小时 。
结 果
一 、 竹红菌甲案光敏作用的特性
我 们实验 了甲素在有氧和无氧条件下对人的红细饱膜的光敏作 川 , 测 定 了膜蛋白51 1
毖和类脂过氧化的变化 。 结果如 图 l 和图 2 听示 。
山图 1 可以看出 , 红细胞膜在甲素存在时通入 N : 迷毛, 光照不同时间 甲素 对膜蛋白 s H
鹉没有影响 , s H基含量基本保持不变 。 而在有氧情 i兄下 , 尤照时甲素可引起 膜 蛋白 s H基
含量下降 。 图 2 的结果也 同样表 明 , 甲素在通 N : 产训青况 一 l; 对红细胞膜类脂不起光敏氧化 { j
用 。 但在有氧时 , 甲索可使膜类脂随光照时问增加而 )lJ 剧 喊化反应 , 丙 二 醛 的 生成 也增


生 物 物 理 学 报 18 96 年
结果表明红细胞膜在 D刃中时 , 甲素对膜蛋白 s H基的影响没有加剧 (图 丁 ) 。 从图 8
中的凝胶电泳图谱可看出 , Dz o 对膜蛋 白交联也未 见 加 强 , 说明 D Z o 效应不明显 。
讨 论
目前所用的光敏剂如 血叶琳 、 亚 甲兰 、 玫瑰红 〔` 。 1等 , 一般认为它们主要是通过 ` 0 : 机
理进行光敏作用 。 而补骨脂素敏化剂主要通过 电子转移产生 自由基而起作用 。 最近的实验
表明 , 补骨脂素的光敏反应也能通过 ’仇机理进行 〔` 2 , 。
关于甲素的光敏作 用机理 已进行了一些研究 , 丛目前所得到的结果来看 , 甲素的光动
力学反应机理是比较复杂的 , 而在生物体系内的反应则更复杂 。 安静仪 : ` ;等通过研究 甲素
对反式茂光氧化反应的敏化作用 , 证明了甲素既可以通过 `0 2机理进行反应 , 也可能通过
别的途径进行反应 , 与反 应条件有关 。 虽然 甲素有较强 的产生 ` 0 2的能力 , 但 在 乙睛中甲
素对反式茂的光氧化反应 中 l {J索的荧光碎灭符合 s t o r n 一 Y 。 l m e r曲线 , 丧明 l卜素有可能通过
电子转移机理作用 。 因此安静仪等 认为在 甲素参与光敏反应中 , 是 “ 活泼态氧” 在起作
用 , 单纯地提 ’ 0 2或 o 了是不全面的 。
我们的实验也证明甲素的光敏作用是一复杂的过程 , 主要表现在 以 卜儿个方面 :
1
. 甲素引起的光敏作用是需 0 2的 , 通入 N : 可 以有效地防止膜蛋 白 s H 光 氧 化及膜类
脂的光氧化 。
2
. 在光敏反应体系 , i ,加入 ’ O : 碎灭剂 N a N 。 、 D A B C o 或 O丁碎灭剂 S O D酶 , 对 S H 基光
氧化和膜类 fJ龄光氧化速率及程度并无影响 , 显然 ` 0 : 或 0 一都不是唯一决定氧化反 应的活性
态氧种类 。
3
.
N a N : 加入 后可以部分地抑制甲素引起的膜蛋白光敏 交 联 , 而 D A B C O 及 s O D 酶
并不能抗光敏交联 。 说明 ’ 0 2在其 『},起一定 的作用 , 同时也有其它形式的话 性 中 问物引起
光敏交联 。
4
. 从 D : o对膜蛋白 s H氧化和膜蛋白交联的影响来看 , D ZO 效应并不明显 , 说明 ` Oz 在
反应中的作用是有限的 。
综 _ L所述 , 可知 甲素引起的红细胞膜蛋白 S H基氧化 、 类脂过氧化及膜蛋白交联反应的
机理是较复杂的 , 其中可能涉及 ` 0 2或 0万, 除此之外还可能有其它活性中间 物 在起作用 。
戎们同意安静仪等的看法 , 即甲素参与的反应中是 “ 活泼态氧” 在起作用 , 而不是简单 的
, O :或 。了的作用 。 有关甲素对生物分子光敏作用的机理仍需进行 深入 的研究 。
不又 1 ,创 干二另3国 L次口
第4 期 竹红菌甲素对红细饱膜光敏作用机理的研究 3 1 8
今 考 文 做
〔 1〕
〔 2〕
〔 3〕
〔4 〕
〔 5 1
〔6 〕
〔 7〕
〔 8〕
〔 9〕
〔 10 〕
〔 2 1〕
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:
P五o t o e五 e m . P b o t o b i o l . 3 8 , 19 8 3 , 7 4 5一 7 5 1
张曼华 、 安静仪等 : 科学通报 , 2 9卷 第招期 , : 9 84 , , , , 7一 , , 2。
安静仪 , 张曼华等 中国科学 . B辑 , 第 1 期 , 1 9 8 5 , 9 75 一98 2
程龙生 , 王家珍等 : 实验生物学报 , 第 16 卷 , 第 4期 , 1 98 3 , 4 09 一 4 17
程龙生 , 王家珍等 : 实验生物学报 , 第 18卷 , 第 l 期 , 1 985 , s9 一”
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T H E M E C H A N I S M S T U D Y O F H Y P O C R E L L I N A
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P H O T O
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S E N S I T I Z A T I O N I N E R Y T H R O C Y T E M E M B R A N E
Z h e n g J i a ” b u a , C h e n g L o n g s h e n g
( I n s t `r o t e o j B `o P h夕s i e s , A e a d e m f a S i o i e a , B e `j f ” 夕 , C h `n a )
A B S T R A C T
I n t h i s P a P e r , t h e e f f e c t s o f l, y P o c r e l l i n A o n p h o t o s e n s i t i z a t i o n o f o r y t h r o -
e y t e m e m b
r a n e s h a 、
,
e b e e n i n 、 e s t i g a t e d . I t h a s b e e n o l u e i d a t e d t h a t P h o t o s e n -
5 i t i z a t i o n t a k e s p l a e e i n t 卜e p r e s e n e e o f o x y g e n . T h e s i n g le t o x y g e n ( ’ 0 2 ) q u e n -
e h e r s : N a N 3 a n d D A B C O , a n d s u P o r o x i d e a n i o n r a d i e a l ( O二) q u e n e h e r : s u P e r -
o x i d e d i s m
u t a s e , w e r e u s e d t o e x a m i n e t h e m e e h a n i s m o f h y P o e r e l l i n A
一 s e n s i -
t i z e d e r o s s
一
l i n k i n g o f e r y t h r o c y t e 几 e m b r a n e P r o t e i n s a n d P h o t o o x i d a t i o n o f
u n , a t u r a t e d l i P i d s
.
T五e r e s u l t s s h o w t h a t N a N 。 , D A B C O a n d s u P e r o x i d e d i s m u t a s e d o n o t o a u -
s e s i g n i f i e a n t e f f e e t o n t h e P h o t o o x i d a t i o n o f S H g r o u P i n P r o t e i n a n d u n s a -
t u r a t e d I I P i d s , b u t N a N 3 e a n P a r t i a l l y i n h i b i t P h o t o , e n , i t i z e d e r o s s
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I i n k i n g o f
m e m b r a n
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一 s e n s i t i: e d P五o t o d y n a m i e e f f e e t s o n
e r y t h r o e y t e m e m b r a n e , t h e n P h o t o s e n s i t i z a t i o n w o u l d s i g n i f i e a n t l y i n e r e a s e i n t h e
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