全 文 ：菌 物 学 报 23（1）：63~65, 2004
Mycosystema
双孢蘑菇部分 cDNA文库的构建及筛选
王泽生 1* 陈美元 1 廖剑华 1 卢政辉 1 郭仲杰 1 李洪荣 1 M.P.Wach2
(1福建省轻工业研究所 福州 350005；2美国 Sylvan食品集团公司)
摘 要： 构建了双孢蘑菇Agaricus bisporus菌株AA和A41的部分cDNA文库，其滴度分别为1.0×105
pfu/ml和 6.0×104pfu/ml。用地高辛标记的丛生差异片段探针对文库进行筛选，分别获得 5个和 3
个阳性克隆。
关键词：双孢蘑菇，丛生变异，阳性克隆，二氢硫辛酰胺脱氢酶
中图分类号：Q939.96 文献标识码：A 文章编号：1672-6472（2004）01-0063-0065
cDNA文库是将某一特定类型细胞表达的mRNA经反转录酶催化形成与之互补的 cDNA，再以
cDNA为模板合成第二链，得到双链DNA，体外重组克隆后得到的一类重组DNA分子群体。cDNA
文库反映了来源细胞当时基因组表达出的基因序列信息，从中筛选到的目的基因可直接用于表达研
究，所以它是研究工作中最常使用到的基因文库(沈倍奋，2001；卢圣栋，1999)。丛生是双孢蘑菇
的一种异常生长形态，导致产生大量的畸形菇。前期研究表明丛生是双孢蘑菇的基因组发表变异后
引起的，我所应用RAPD技术已找到一个与丛生变异可能相关的 735bp DNA片段，并证明它可能
是双孢蘑菇二氢硫辛酰胺脱氢酶(DLDH)基因的一部分(王泽生等，2001)。为了获取丛生变异可能相
关的基因进行进一步的研究，我们构建了双孢蘑菇的部分 cDNA文库，并且用地高辛标记的丛生差
异片段探针对文库进行筛选。
1 材料与方法
1.1 菌株
双孢蘑菇正常菌株 AA及其丛生变异菌株 A41由美国 Sylvan公司提供，现保存于福建省蘑菇
菌种研究推广站。
1.2 试剂
mRNA提取试剂盒、cDNA合成试剂盒、噬菌体包装试剂盒购自美国 Promega公司，Lambda gt10
载体购自上海华美生物工程公司，地高辛标记与检测试剂盒、尼龙膜购自德国Boehringer Mannheim
公司，Trizol 试剂、内切酶及其它试剂均购自上海生工生物工程技术服务有限公司。丛生差异片段
是本所从双孢蘑菇丛生变异菌株 A41中克隆得到的一条 RAPD差异条带，其地高辛标记探针由本
所制备。
1.3 cDNA文库的构建
按照各试剂或试剂盒产品说明书进行。包括以下步骤：(1)总 RNA 提取；(2)mRNA 提取；(3)
双链 cDNA合成；(4)与 EcoRI Adaptor连接并磷酸化；(5)与经 EcoRI酶切并去磷酸化的 Lambda gt10
连接；(6)与包装提取物进行体外包装；(7)包装产物梯度稀释后侵染感受态 E.coli C600hfl；(8)铺平
板培养进行文库的滴度测定。

福建省自然科学基金资助
*通讯作者。E-mail: mushroom@public.fz.fj.cn
收原稿日期：2003-03-29，收修改稿日期：2003-06-13
DOI:10.13346/j.mycosystema.2004.01.013
64 菌 物 学 报 23卷
1.4 cDNA文库的扩增
按《分子克隆实验指南》的方法进行(J.萨姆布鲁克等，1992)。
1.5 cDNA文库的筛选
文库噬菌体稀释培养、噬菌斑影印到尼龙膜以及随后的变性及固定处理按照噬菌体包装试剂盒
说明书进行。尼龙膜与地高辛标记探针的杂交及显色按照地高辛标记与检测试剂盒说明书进行。
1.6 可疑阳性克隆的点杂交鉴定
挑取平板上与尼龙膜单个阳性杂交斑对应位置上的数个噬斑，置于 1mL SM缓冲液中捣碎；用
噬菌体缓冲液作 20000倍稀释，每个阳性斑对应的噬斑铺一个平板，37℃培养过夜；每个平板各随
机挑取 6个独立的噬斑于 20ìL噬菌体缓冲液中压碎，旋涡振荡并稍加离心；剪一小块尼龙膜，用
铅笔在光面画上方格并作标记。各取上清 1ìL点样于方格内；尼龙膜处理、杂交及显色按照地高辛
标记与检测试剂盒说明书进行。
1.7 噬菌体 DNA的提取
按《分子克隆实验指南》的方法进行(J.萨姆布鲁克等，1992)。
2结果与分析
2.1 cDNA文库的构建
提取双孢蘑菇正常菌株 AA和丛生变异菌株 A41子实体的总 RNA，甲醛变性凝胶电泳可见到
明显的 28S和 18S条带(结果未显示)。经 mRNA分离、双链 cDNA合成、加 EcoRI衔接头后，与
经 EcoRI消化并去磷酸化的 ëgt10载体连接，体外包装后用E.coli C600hfl作受体菌进行滴度测定。
结果获得 AA和 A41的部分 cDNA文库，其滴度分别为 1.0×105pfu/mL和 6.0×104pfu/mL。对两个
文库进行扩增，扩增后的滴度均达到 108pfu/mL。
2.2 cDNA文库的筛选
将 1万倍稀释的平板上的噬菌体转移到尼龙膜，用 DIG标记的 735bp 丛生差异片段探针进行
杂交，结果 AA获得 6个可疑阳性克隆，A41获得 3个可疑阳性克隆。进一步点杂交鉴定后，AA
和 A41部分 cDNA文库分别筛选到 5个和 3个阳性克隆(图 1)。
2.3 插入片段的鉴定
提取上述 8个阳性克隆的重组噬菌体 DNA，用根据 735bp丛生差异片段两端序列合成的 20mer
特异引物进行 PCR扩增，结果得到整齐条带，大小约 735bp (图 2)。
3 讨论
由于受一些实验室条件的限制，我们只构建了两个菌株的部分 cDNA文库。之所以称之为部分
cDNA文库，主要是从滴度上推测。虽然文库的滴度会因物种、生长阶段、取样部位等的不同而不
同，但一般来说，完整 cDNA文库的滴度值应在百万以上。使用双孢蘑菇的丛生差异片段探针，我
们从这两个部分文库中获得了多个目标克隆，说明所建文库还是有效的。由于所要筛选的目的基因
比较明确，我们没有检测文库中重组克隆子的比例及插入片段平均大小，也没有去尝试构建更完整
的 cDNA文库。
前期研究表明该丛生差异片段可能是二氢硫辛酰胺脱氢酶(DLDH)基因的部分序列，而 DLDH
在线粒体呼吸中起着非常重要的作用，因此它可能与双孢蘑菇的丛生变异有关(王泽生等，2001)。
分别从正常菌株AA和丛生菌株 A41的部分 cDNA文库中获得的 5个和 3个阳性克隆，在进一步的
PCR鉴定中均扩增到特异片段，我们希望这些克隆中已经包含了双孢蘑菇 DLDH基因的全长 cDNA
序列。
1期 王泽生等：双孢蘑菇部分 cDNA文库的构建及筛选 65
在下一步的研究中，我们将测定这些阳性克隆所包含的 cDNA 序列，查明正常与丛生菌株的
DLDH基因是否存在差异，以确证它与丛生变异的相关性。

[REFERENCES]
Wang ZS, Chen MY, Liao JH, Lu ZH, Guo ZJ and Li HR, 2001. A preliminary study on the molecular mechanism of clustering variation of
Agaricus bisporus. Edible fungi, 23(Suppl.): 82～83 (in Chinese)
Lu SD, 1999. Current Protocols for Molecular Biology (2nd ed). Beijing: China Xiehe Medical University Press. 1～813 (in Chinese )
Shen BF, 2001. Molecular Library. Beijing: Science Press. 1～190 (in Chinese)
Sambrook J, Fritsch EF and Maniatis T, 1992. A Laboratory Manual for Molecular Cloning. Beijing: Science Press. 1～1062 (in Chinese )
[附中文参考文献]
王泽生, 陈美元, 廖剑华, 卢政辉，郭仲杰，李洪荣, 2001. 双孢蘑菇丛生变异分子机理的初步研究. 食用菌, 23 (增刊): 82～83
卢圣栋, 1999. 现代分子生物学实验技术.第二版. 北京:中国协和医科大学出版社. 1～813
沈倍奋, 2001.分子文库. 北京:科学出版社. 1～190
J.萨姆布鲁克, E.F.弗里奇, T.曼尼阿蒂斯,1992. 分子克隆实验指南.第二版. 北京:科学出版社. 1～1062
CONSTRUCTION AND SCREENING OF PARTIAL CDNA LIBRARIES OF
AGARICUS BISPORUS
WANG Ze-Sheng1 CHEN Mei-Yuan1 LIAO Jian-Hua1 LU Zheng-Hui1 GUO Zhong-Jie1
LI Hong-Rong1 M.P.Wach2
(1Fujian Research Institute of Light Industry, Fuzhou, 350005; 2 Sylvan Food Holdings, Inc., U.S.A)
ABSTRACT: The partial cDNA libraries of Agaricus bisporus AA and A41 were constructed with titer of 1.0×
105pfu/ml and 6.0×104pfu/ml respectively. Five and three positive clones were separated respectively by screening the
two libraries with Dig-labeled cluster special probe.
KEY WORDS: Agaricus bisporus, clustering variation, positive clone, DLDH
图 1 丛生差异片段探针与 cDNA文库可疑阳
性克隆的点杂交图谱
1~6: AA 可疑克隆; 7~9: A41 可疑克隆; A~F: 一个可
疑克隆的不同噬斑
Fig.1 Dot hybridization pattern of the dubious clones of
cDNA libraries with the cluster special probe
1~6: AA dubious clones; 7~9: A41 dubious clones;
A~F: Different plaques of a dubious clone
图 2 cDNA文库阳性克隆DNA的 PCR
扩增图谱
M: ëDNA/EcoRI+HindIII Markers; 1~5: AA 阳性克隆;
6~8: A41 阳性克隆
Fig.2 PCR patterns of the positive clones derived from
cDNA libraries
M: ëDNA/EcoRI+HindIII Markers; 1~5: AA positive
clones; 6~8: A41 positive clones