全 文 ：食用菌学报 1 99 4, l (1 ) : 28一 30
A e t a E d u l i s F u n g i
双抱蘑菇醋酶标记位点同工酶
的纯化与分子量测定
王泽生 池致念 廖剑华 李福根 王贤樵
(福建省轻工业研究所 , 福州市 3 50 005 )
摘 要 采用 P A G E法分离提纯双抱蘑菇菌丝酷酶标记位点E st A与 B 的同工酶蛋白 cs t l , 2
和 e s t 3 , 4 。 S D S 一P A G E蛋白质分子量测定表明 它们的分子量分别为30 0 0() , 6 300 0和 3 0 00 0 , 4 30 0 0 。
关键词 双抱蘑菇 ;醋酶标记位点 ;同工酶 ;分子量
双抱蘑菇酷酶 同工酶 (E st )标记位点产物的电泳表型与菌株某些重要的特性相关 。 这些标
记位点在杂种子代中的分离与重组行为及在染色体上的排列顺序 已得到研究 ` ” 2 ’川 ’ ` 〕。 本文就
E s t A 与 B标记位点产物 es t l , 2和 es t 3 , 4 的分子量进行检测 , 以便为深人研究标记位点的基
因基础 , 提供有参考价值的遗传信息 。
1
. 材料与方法
1
.
1 供试菌株的培养 双抱蘑菇 G型菌株8 2 1 1 ,具 E st 标记区带 es t l , 3 夕H 型菌株 1 76 , 具 。 st
标记 区带 es t Z , 4与es t 3 0一 3 。 二菌株均接种于 P D A斜面 , 24 ℃下培养20 天后刮取菌丝制样 。
1
.
2 标记区带酶蛋白的制备与提纯 每个菌株都刮取三支斜面的菌丝 , 加人 p H 7 . 4磷酸缓
冲液 , 加石英砂研磨成匀浆 , 置离心机4 00 rp m离心20 分钟 , 取上清液 , 供 9 % 聚丙烯酞胺凝胶
电泳 ( P A G )E 用 。 浓缩胶长 Z c m , 不做样品孔 , 加样 , 电泳后在凝胶两边 与中部切取胶条做 E S t活
性染色 , 作为对照 , 剖提各标记 区带 , 并取部分区带剖胶在 9 % P A G E上电泳 , 作 E st 和水溶性蛋
白染色 ,证实每一标记区带剖胶为单一区带 。
1
.
3 标记区带酶蛋白样品的 S D S处理 区带音d胶加人 2 % S D S溶液 (十二烷墓硫酸钠 宜兴
市钮家化学试剂厂 ) , 加石英砂研磨 . 15 ℃放置过夜 , 6 00 r p m离心20 分钟 , 取上清液 , 按 1 : 1的
比例加入电泳缓 冲液 (蔗糖 I O g . T ir s o , 7 5 6 9, 2一琉基 乙醉 5m l , 加 无离子水 50 m l) , 混匀后 于
10 0 ℃水浴中加热 3分钟 , 冷却后即为 S D S处理样品 。
1
.
4 S D S 一 P A G E 对 经S D S处理 的标 记区 带样品作 S D S 一 P A G E (8 % ) 和 S D S一 P A -
G (E l0 肠) . 以低分子量标准蛋 白质作对照 。 标准蛋自质为上海生化所东风试剂厂产品 , 含5种不
同分子量的达到电泳纯的蛋白质 , 分别为磷酸化酶 B (M w 94 0 00) , 牛血清自蛋 白 (6 70 0 0) , 肌动
蛋 白 (4 3 0 00) , 碳酸醉酶 ( 3 0 0 0 0) , 烟草花叶病毒壳蛋白 ( 1 7 5 00) 。 分离胶与电泳缓冲液的S D S浓度
均为 0 . 1% , 电泳温度 15 ℃ 。 P A G E方法 同前 ￡’ ! , 以考马斯亮兰R 一 2 5 0作蛋 白质染色 。
1
.
5 蛋白质分子量的测定方法 在一 定的分子量范围内 , 蛋 白质的泳动率和分子量的对数
收稿 口期 : 1 99 4一 0 5一 0 4初稿 : 1 9 94一 07一 0 5修改稿 。
DOI : 10. 16488 /j . cnki . 1005 -9873. 1994. 01. 007
l 期 王泽生等 : 双抱蘑菇脂酶标记位点同工酶的纯化与分子量测定 92
呈直线关系 。 M w =K( 1 0山 x ) , L o g M w = L o g K 一 b x = K , 一 b x 山 = 斜率 , x = 泳动率 , k , k ,为
参数 ) 。 在实际测定时 , 先测量标准蛋白质 自分离胶起点至区带中线距离作横轴坐标 , 然后将标
准蛋白质分子量换算成对数值作纵轴坐标 , 作出标准曲线 , 然后再测定待测蛋 白质的电泳距
离 , 在曲线上查出相应的分子量对数值 , 即可算出待测蛋白质的分子量 。 测定方法参照张龙翔
等的方法 〔` ’ 。
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图 1 E st 标记区带和标准蛋 白质 S D S 一 P A G E 图 2
l( o % )的R一 25 0( 考马斯亮兰 )染色结果
F i g
.
1 S t a i n i n g r e s u l t s o f E s t m a r k e r b a n d s F i g
.
2
a n d s t a n d a r d p r o t e i n S D S
一
p A G E ( 10 % )
w i t h C o o m a s s i e B r i l l i a n t B l u e R 2 50
标准蛋白质分子量对数的标准曲线
T h e s t a n d a
r
d e u vr e o f t h e m o l e e u l a r
w e i g h t l o g a r i t h m o f s t a n d a r d p r o t e i n s
2
. 结果与讨论
E st 标记区带的分子量 , 以 S D S 一 P A G (E 8 % )和S D S 一 P A G (E l0 % )检测双抱蘑菇菌丝的酚
酶 同工酶 es t l , 2 , 3与4标记区带 。 显示 出的蛋白质 区带数相同 , 带型相似表明这二种浓度均适
于E st 标记区带分子量的测定 〔 ” 。 图 1示 S D S 一P A G E (10 % )的考马斯亮兰染色结果 。 E st l , 2 , 3
和 4均呈现单条区带 , 表明它们均为单体或 同聚体酶 , 证实了我们早先对它们所作 的遗传分
析 ` ” 〕。 图2示标准蛋白质的分子量对数的标准曲线 。 分析计算表明 E st 同工酶标准区带es t l , 2 ,
3和4的酶蛋白分子量分别为 : 3 0 0 0 0 , 6 3 0 0 0 , 3 0 0 0 0和 4 3 0 0 0 。 酶蛋白分子量测定结果表明 , G型菌
株与H型菌株的标记区带分子量大小存在明显差异 。 G型标记区带 es t l , 3均为小分子量蛋白 ,
分子量都在 3 0 0 0 0左右 , 而 H型标 记区带 es t Z , 4的分子量明显大于 G 型的 , 分别达6 3 0 0 0与
4 3 0 0
。 这进一步证明了这两类菌株存在遗传差异 〔 ` 〕。 从另一方面看 , es t l , 3的分子量相近 , 但
在 P A G E中川的电泳迁移率 (R m 值)却相差较大 , 若不考虑酶蛋白分子形状 因素的影响 , 可以推
定es t l与3各自所带电荷存在差异 , es t l带负电荷数显然大于 es t 3 。 同样 , es t Z的分子量明显
大于es t 4的 , 但在 P A G E中es t Z的 R m值却明显大于 es t 4 , 这也提示我们 , es t Z所带的负电荷
明显大于 e s t 4 ·
另一组 E S t标记区带 es t 30 一 3 的泳动率较接近 , 在本试验中分离提纯的效果不够理想 ,
有待于进一步测定 。
3 0 食 用 菌 学 报 l 卷
我们曾对标记 区带 e st l , 2和 3 , 4的遗传背景作了探索 , 认为它们分别是醋酶位点 A 和 B的
等位基 因E st A , 与 A : , E st B l 和 B Z 的产物 “ 」。 进一步对 E st 标记区带酶蛋白作序列分析 ,
对于探索 es t l , 2和 3 , 4的基 因基础将是十分有意义的 。
参 考 文 献
2
3
4
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H
.
C
.
W
a n g
,
2
.
5
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W
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.
T h e p
r e d i e t io n o f s t r a i n e h a r a e t e r i s t ie s o f A g a r i e u s b即 o r u 吕 b y t h e
a p p li e a t i o n o f i s o z y m e e l e e t r o p h o r e s i s
.
M u s h
r o o m S e i e n e e
,
1 9 89
.
1 2 ( 1 )
: 8 7一 1 0 0 .
2
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5
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W
a n g
,
H
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C
.
W a n g
.
S t u d y o n t h e g e n e t i e v a r i a t i o n o f A g a r ie u o b is P o r u s
,
P
r e e e e d i n g s o f
t h e I n t e r n a t i o n a l S y m p o s i u m o n M u s h
r o o m B io t e e h n o l o g y
.
N a n j i
n g
,
C h i n a : 1 98 9
.
3 2 9一 3 38 .
Z
,
5
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W
a n g
,
J
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F
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L i a o
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S t u d y o n t h e e r o s s b r c e d i n g t e e h n i q u e o f A g a r ie u s b i印o r u s . M i e o l
N e o tr o P A p l
,
1 9 9()
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(3 )
: 1一 1 2 .
2
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5 W
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,
H
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C
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W a n g
.
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.
M i e o l N e o t r o p A p l
,
1 9 9()
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(3 )
: 1 9一 2 9 .
2
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5
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W
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,
J
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F
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F
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.
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.
S t u d y o n g c n e t i e b a s i s o f e s t e r a s e is o z y m e l o e i e s t A
,
B
a n d C i n A g a r ie u s b i印 o r u s . M u s h r o o m S e z e n e o , 19 9 1 . 1 3 ( 1 ) : 3一 9 .张龙翔 , 张庭芳 , 李令媛主编 . 生化实验方法和技术 . 北京 : 高等教育出版社 , 1 98 1 , 112 一 1 1 90
B
.
D
.
H a m e 多 . D . R ic k w o o d
. 刘敏 秀等译 . 蛋 白质的凝胶 电泳实践方法 . 北京 : 科学 出版
社 , 1 9 86 . 1 8一 36 。
ǎ匕勺.
T h e P u r i if e a t i o n o f I s o z y m e i n E s t e r a s e L o e i
o f A g a r i e u s b i SP o r u s a n d t h e D e t e r m i n a t i o n
o f i t s m o l e e u l a r W
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a n g Z e s h e n g C h i Z h i n i a n L i a o J i a n h u a L i F u g e n W a n g X i
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4
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2 a n d e s t 3
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《 国外食用菌 》 19 9 4年停刊 , 创办 《 食用菌学报 》 , 94 年出版二期 , 全年 10元 。
凡 《 国外食用菌 》 19 9 4年订户未来信要求退款者 , 本刊作转订 《 食用菌学报 》 处
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