全 文 ：食用菌学报 2009.16(2):74～ 76
收稿日期:2009-02-06原稿;2009-05-04 修改稿
基金项目:国家林业局“ 948”项目(编号:2004-4-28)的部分研究内容
作者简介:李　河(1979-), 男 , 2006年毕业于中南林业科技大学 ,硕士 , 讲师 , 主要从事真菌及森林保护方面的教
学和研究工作 ,发表主笔论文 16 篇。
文章编号:1005-9873(2009)02-0074-03
双孢蘑菇褐腐病病原菌的分离及分子鉴定
李　河 , 周国英 , 刘君昂
(中南林业科技大学生物技术开放性中心实验室 ,中南林业科技大学林学院 ,湖南长沙 410004)
摘　要:对引起双孢蘑菇(Agaricus bisporus)褐腐病的病原菌进行分离和分子鉴定。分离培养褐腐病病原菌 ,
采用 CTAB法抽提其基因组总 DNA , 利用真菌通用引物 ITS1 和 ITS4 扩增菌株 rDNA ITS区序列 ,扩增产物
纯化后克隆转化至大肠杆菌 , 挑选克隆成功的菌株进行测序。测序结果在 GenBank 中进行同源性搜索 , 并下
载部分具有代表性种的 ITS序列 , 利用软件MEGA4 构建分子系统发育树 , 通过序列分析 ,鉴定出引起双孢蘑
菇褐腐病的病原菌为 Mycogone perniciosa 。
关键词:双孢蘑菇;褐腐病;转录间隔区;分子鉴定
　　褐腐病是当前双孢蘑菇(Agaricus bisporus)
生产上危害性最大 、菇房发生最普遍的病害之
一 ,严重的年份感染面积达 60%以上 ,给双孢蘑
菇生产造成巨大的损失 。目前 ,判断褐腐病的发
生和鉴定双孢蘑菇褐腐病原菌 , 主要靠病菇的症
状和培养料中病原菌的形态特征[ 1] 。笔者从双
孢蘑菇褐腐病菇中分离病原菌 ,利用现代生物技
术手段对其进行分子鉴定 ,为准确 、快速采取措
施防治病害提供依据。
1　材料与方法
1.1 供试菌株
　　双孢蘑菇褐腐病原菌株采自湖北省钟祥市
大口林场设施栽培示范地发生的褐腐病菇体 。
双孢蘑菇(A.bisporus)菌株 Ta:由中南林
业科技大学生物技术开放性中心微生物实验室
筛选并保存。
1.2 方法
1.2.1 病原菌的分离纯化
　　将褐腐病菇体切开 ,用 75%的酒精擦拭组织
表面 ,取少量组织接种于 PDA 平板上 ,置于25 ℃
培养箱中培养;将培养得到的致病菌孢子悬液
(约 106 个/mL)2 μL 均匀涂布于 PDA 平板上
培养至孢子萌发 ,挑取尖端菌丝接种于新的 PDA
平板上 , 25 ℃恒温培养 。
1.2.2 回接感染实验
　　配制栽培料 ,经过堆制 、翻堆 ,二次发酵处理
后播种菌株 Ta 栽培种[ 2] , 发菌 , 覆土。3 d后菌
床上喷致病菌孢子悬液(约 106 个/mL)1.5 ～
2.0 kg/m2 ,做好出菇管理[ 3] 。
1.2.3 病原菌基因组 DNA抽提
　　病原菌菌丝体培养参照文献 [ 4] , 采用
CTAB方法[ 5] 用 DNA 提取试剂盒(北京天根生
化科技有限公司)提取菌丝体基因组总 DNA , 电
泳检测合格后待用 。
1.2.4 病原菌核 糖体转录间 隔区(Internal
Transcribed Spacers , I TS)扩增
　　采用上海生工生物工程技术服务有限公司
合成的 真 菌通 用 引物 , 序 列 为 I TS1:5
TCCGTAGGTGAACCTGCGG 3 ;I TS4:5
TCCTCCGCTTATTGATATGC 3 。PCR 反应
体系(25 μL):10 ×Buffer 2.5 μL , dNTP (各
2.5 mmol/L)1 μL , 正向和反向引物各 1 μL ,
Taq 酶(0.5 U)0.25 μL , 40 ng/μL 模板 DNA
1 μL , ddH 2O 18.25 μL 。PCR 反应条件为:
95 ℃预变性 5 min;95 ℃变性 30 s , 56 ℃退火
30 s , 72 ℃延伸1 min ,共 40个循环;72 ℃延伸
10 min。
1.2.5 PCR产物的检测
　　取 4 μL PCR 产物 , 0.8%琼脂糖凝胶电泳
检测。
1.2.6 PCR产物的克隆与转化
DOI :10.16488/j.cnki.1005-9873.2009.02.017
第 2 期 李　河 ,等:双孢蘑菇褐腐病病原菌的分离及分子鉴定
　　扩增样品用DNA纯化试剂盒(北京天根生化
科技有限公司)纯化。将 PCR 扩增产物纯化后克
隆至 pUM-T载体上 ,再转化至大肠杆菌感受态细
胞(两者均由上海生工生物工程有限公司提供)中 ,
在含 X-gal 、IPTG 、氨苄青霉素的 LB平板上采用
蓝白斑法筛选克隆成功的菌落。挑取白色菌落培
养做 PCR检测 ,剔除假阳性菌株 , 对克隆成功的
菌株送上海生工生物工程技术服务有限公司做正
反双向测序 ,测序试剂为 BigDye terminator v3.1 ,
利用 BioEdit软件拼接得完整序列。
1.2.7 系统发育树的构建
　　将测得的序列用 Blastn软件从 GenBank 搜
索到的相关序列 ,用 Clustal W[ 6] 软件进行比对
后进行手工校正 。系统发育树分析采用软件
MEGA 4 中的邻近相邻法进行 , 利用 bootst rap
(1 000次重复)检验各分支的置信度 。
2　结果与分析
2.1 病原菌特征及回接感染鉴定
　　分离纯化得到的致病菌 (菌株编号:
CSUFT0821)在 PDA 平板上生长 ,菌丝初期为白
色 ,随菌龄的增加逐渐转为黄色 、黄褐色;显微镜
下观察其孢子形态为:双细胞;大细胞褐色 、球形 、
表面有瘤突;小细胞无色 、半球形 、壁薄 、光滑;菌
丝有隔 ,孢子梗呈轮枝状分枝 ,顶端单生分生孢
子。对回接后出现褐腐症状的双孢蘑菇菇体再
次进行病原菌分离 ,镜检观察与第一次分离的病
原菌菌丝和孢子形态一致 ,可确定分离菌株就是
双孢蘑菇褐腐病病原菌 。
2.2 菌株的 rDNA ITS区 PCR扩增
　　菌株的 rDNA ITS 区(含5.8S 区)PCR扩增
产物的电泳结果(图 1)显示的条带单一 , 约为
600 bp ,双蒸水为 PCR 反应模板进行的对照
(CK)无条带 。
图 1　病原菌核糖体 ITS区 PCR扩增电泳图
Fig.1　Electrophoresis of rDNA ITS region
图 2　基于 ITS序列构建的分子系统发育树
Fig.2　Phyogenetic tree based on ITS sequences and constructed using the Neighbor-Joining method
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食　用　菌　学　报 第 16 卷
2.3 菌株 rDNA ITS 测序及序列 Blastn 搜索
　　CSUFT0821 菌株所测 ITS 区总长度为
598 bp。将序列在 GenBank 数据库中进行
Blastn搜索 ,得到一系列具有一定相似性的 ITS
序列 ,其中与登录号为 EU380317 的 Mycogone
perniciosa ITS 序列只有 1 个碱基的差异 ,相似
性高达 99%以上 。RENSKE 等[ 7] 认为真菌通过
ITS 区域比对 ,序列相似性大于 99%,鉴别为相
同种;序列相似性大于 95%且小于 99%,鉴别为
相同属;序列相似性小于 95%,鉴别为同科 。因
此 ,结合菌株的形态特征 ,可初步确定试验分离
的双孢蘑菇褐腐病原菌为M.perniciosa。
2.4 菌株分子系统发育树的构建
　　下载 GenBank等数据库中同源性的 ITS序列
与本实验所测的 CSUFT0821菌株 ITS 序列对位
排列后 ,利用MEGA4软件的邻近相邻法构建系统
发育树 ,见图 2。从系统发育树中可以看出 ,
CSUFT0821 菌 株 与 EU380317 的 Mycogone
perniciosa 以 100%的置信度聚在一支上 , 亲缘关
系最近。结合它们之间的同源性大于 99%,可确
定分离的双孢蘑菇褐腐病原菌为M.perniciosa。
3　讨论
　　目前国内关于双孢蘑菇褐腐病病原菌鉴定
的报道较少 ,只有杨涛等[ 1] 从四川崇州双孢蘑菇
疣孢霉受灾严重地区分离到一株致病菌 ,通过其
纯培养特征 、微观形态特征及回接感染验证 ,确
定该致病菌为疣孢霉(Mycogone sp .),但并未鉴
定出种名 。
用于未知菌分类鉴定的核酸序列分析最常
选用的目的片段是 rDNA 。其中 ITS 在种间存在
着丰富的变异 , 而在种内不同菌株间却高度保
守 ,这些可以为真菌的系统发育和分类鉴定提供
丰富的遗传信息。本研究首次利用 rDNA ITS
序列鉴定双孢蘑菇褐腐病原菌 ,将测得的病原菌
rDNA ITS 序列在 GenBank 中进行 BLAS T 分
析 ,结果表明测得的序列与 M.perniciosa同源
性高于 99%,这从分子水平证明了引起湖北地区
双孢蘑菇褐腐病的病原菌为 M.perniciosa 。
参考文献
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[本文编辑] 　王瑞霞
Isolation and Molecular Ident ificat ion of a Pathogen
Causing Brown Rot in Agaricus bisporus
LI He , ZHOU Guoying , LIU Junang
(Biotechnology Core Facilities , Centr al South University of Forestry &Technology , Changsha , Hunan 410004 , China;
College of Forestry , Central South University of Forestr y&Technology , Changsha , Hunan 410004 , China)
Abstract:Strain CSUFT0821 , a pathogen causing brown rot of Agaricus bisporus , has been identified by
determining the sequence of a r ibosomal DNA internal tr anscribed spacer(ITS)and comparing with corresponding
sequences deposited in GenBank.Homology was highest(99%)with an ITS sequence from Mycogone perniciosa
(EU380317).A phylogenetic tree constructed on the basis of ITS sequences revealed very close proximity between
EU380317 and the ITS sequence from str ain CSUFT0821 , and confirmed that the latter was M.perniciosa.
Key words:Agaricus bisporus ;brown rot;internal transcribed space rs(ITS);molecular identif ica tion
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