全 文 ：0 引言
冬樱花（Prunus majestic Koehne）又名冬海棠、高
盆樱，是蔷薇科（Rosaceae）樱属(Prunus)植物。云南为
主要分布区。冬樱花盛开之时花朵繁密，艳丽夺目，花
后续长紫红色嫩叶，大大丰富了冬季园林植物的色相
变化，为少花的冬季增添绚烂的自然景观[1]，同时，其
花、果、皮可供药用，具有较高的药用价值[2]。樱花组
织培养工作开展较迟，目前尚处于初步研究和探索阶
段，当前研究的重点在于确定组织培养中控制分化、生
长、生根的主要因素[3]。已有试验分别对几种樱花的
花柄、嫩枝、腋芽进行了离体培养，且证明了以樱花花
柄为外植体时能由愈伤组织分化出绿色芽点[4]，以嫩
枝、茎段、芽心为外植体时能诱导出丛生芽[5-7]。目前，
对冬樱花的组织培养没有报导，此试验初步讨论了激
素浓度对冬樱花花梗、花托、子房、叶片、花苞等多个外
植体的出愈率的影响以及褐化抑制的措施，为冬樱花
往后的快速繁殖提供技术支持和参考依据。
1 材料与方法
1.1 试验时间、地点
该试验于2008年1月在云南农业大学园林园艺学
院组培实验室进行。
1.2 实验材料
冬樱花材料取自云南农业大学校园内。
1.3 试验方法
1.3.1 激素浓度、光照和消毒时间对外植体的影响 以
MS培养基为基本培养基，添加不同浓度的NAA和
第一作者简介：和凤美，女，1964年出生，从事植物遗传育种研究。通信地址：650201云南农业大学园林园艺学院，E-mail：hefengmei918@126.com。
收稿日期：2010-02-02，修回日期：2010-02-28。
冬樱花愈伤组织诱导和抑制褐化初探
和凤美 1，朱永平 2，杨晓红 3，李 璇 1，邵琬珊 1
（1云南农业大学园林园艺学院，昆明 650201；2云南农业大学农学与生物技术学院，昆明 650201；
3昆明学院生命科学与技术系，昆明 650031）
摘 要：以冬樱花叶片、花托、花梗、子房和苞片为外植体，在附加不同浓度的生长素NAA和细胞分裂素6-BA组合
的MS培养基上进行愈伤组织诱导并探讨愈伤组织褐化的抑制，实验结果表明：在供试的培养基中，叶片的愈伤
组织诱导率最高，花器官愈伤组织诱导时，花梗诱导率最高，其次为花托、子房，而苞片诱导率为0。缩短外植体
消毒时间、遮光及加入活性炭，可有效降低愈伤组织的褐化。
关键词：冬樱花；愈伤组织；褐变；诱导；组织培养
中图分类号：S3 文献标志码：A 论文编号：2010-0340
The Primary Investigation on Callus Induction and Browning Prevention of Cerasus Cerassoides
He Fengmei1, Zhu Yongping2, Yang Xiaohong3, Li Xuan1, Shao Wanshan1
（1College of Horticulture and Landscape, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201;
2College of Agriculture and Biotechnology, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201;
3College of life Science and Technology, Kunming University, Kunming 650031）
Abstract: In this paper, we studied induction of callus and browning prevention on MS addition with different
concentration of 6-BA and NAA using receptacle, peduncle, ovary and leaf blade of cerasus cerassoides as explants. The
results showed that the callus induction rate of leaf was the highest in all tested culture media and explants, and among
callus induction of floral organogenesis, peduncle was the best, followed by receptacle and ovary, and that of bracteolate
was the lowest. Browning of callus can be effectively decreased with shorting explants disinfection time, keeping away
from light, addition with active carbon.
Key words: prunus majestic koehne; callus; browning; induce; tissue culture
中国农学通报 2010,26(12):130-134
Chinese Agricultural Science Bulletin
6-BA后，分装于培养瓶中，122 ℃（1.1 kg/cm2压力）灭
菌备用。取冬樱花花朵和嫩叶，洗净，在无菌工作台上
分别用75%乙醇溶液浸泡30、20 s，再用0.1%升汞浸泡
2、3、4、5 min，无菌水冲洗3~4次。将冬樱花的花梗、花
托、苞片、子房分别切取并接种于不同浓度激素的MS
培养基上，分别置室温（23~26℃）黑暗和光照培养。
1.3.2 吸附剂对外植体褐变的影响 在褐变现象最为严
重的培养基中添加活性炭（5 g/L），对外植体花梗、花
托、子房、叶片进行培养，观察褐化变化。
1.3.3 激素对愈伤组织分化的影响 将生长良好的愈伤
组织转接到含有不同浓度NAA+6-BA和KT+IBA的
MS培养基（琼脂7 g/L+蔗糖30 g/L、pH5.8）中，置于培
养室进行分化培养。
2 结果与分析
2.1 不同激素浓度、光照和消毒时间对外植体出愈率
及褐变的影响
接种 1周后，外植体边缘开始膨大。愈伤组织开
始出现于伤口处。2周后形成黄白色疏松愈伤组织。
从表 1中可以看出，3.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA对
冬樱花花梗、子房愈伤组织的诱导效果较好，诱导率分
别为 46.8%和 34.3%；0.5 mg/L6-BA+3.5 mg/L NAA对
冬樱花花托愈伤组织的诱导的效果较好，诱导率为
40.6%；1.5 mg/L 6-BA+2.5 mg/L NAA对冬樱花叶片愈
伤组织的诱导效果较好，诱导率为65.6%；苞片在各个
激素组合中的诱导率均为0。
花梗和花托外植体在 4.0 mg/L 6-BA + 0 mg/L
NAA培养基中褐变率最严重，分别为31.2%和71.8%，
子房在0.5 mg/L 6-BA+3.5 mg/L NAA培养基中褐变率
最严重，为 56.2%，叶片在 2.5 mg/L 6-BA+1.5 mg/L
NAA培养基中褐变率最严重，为37.5%，苞片在所有培
养基中，几乎全部褐变。从表 1中可知叶片褐变率最
少，花器官褐变率高。
从表 2中可见，在光照培养下，花梗、花托、子房、
叶片、苞片的褐变率分别为 8.3%、15.2%、19.4%、9.7%
6-BA+NAA /(mg/L)
花梗
花托
子房
叶片
苞片
接种数/块
出愈数/块
出愈率/%
褐变数/块
褐变率/%
接种数/块
出愈数/块
出愈率/%
褐变数/块
褐变率/%
接种数/块
出愈数/块
出愈率/%
褐变数/块
褐变率/%
接种数/块
出愈数/块
出愈率/%
褐变数/块
褐变率/%
接种数/块
出愈数/块
出愈率/%
褐变数/块
褐变率/%
0+4.0
32
9
28.1
0
0
32
0
0
9
28.1
32
0
0
16
50
32
13
40.6
0
0
12
0
0
12
100
0.5+3.5
32
12
37.5
7
21.8
32
13
40.6
11
34.3
32
3
9.3
18
56.2
32
8
25
0
0
12
0
0
12
100
1.0+3.0
32
0
0
8
25
32
12
37.5
9
28.1
32
0
0
11
34.3
32
8
25
0
0
12
0
0
10
83
1.5+2.5
32
14
43.7
7
21.8
32
7
21.8
5
15.6
32
3
9.3
0
0
32
21
65.6
0
0
12
0
0
12
100
2.0+2.0
32
10
31.2
9
28.1
32
2
6.2
7
21.8
32
2
6.2
17
53.1
32
2
6.2
5
15.6
12
0
0
10
83
2.5+1.5
32
5
15.6
0
0
32
8
25
5
15.6
32
3
9.3
7
21.8
32
18
56.2
12
37.5
12
0
0
12
100
3.0+1.0
32
0
0
0
0
32
1
3.1
4
12.5
32
0
0
5
15.6
32
2
6.2
0
0
12
0
0
11
91.6
3.5+0.5
32
15
46.8
0
0
32
8
25
0
0
32
11
34.3
0
0
32
4
12.5
9
28.1
12
0
0
12
100
4.0+0
32
11
34.3
10
31.2
32
0
0
23
71.8
32
3
9.3
9
28.1
32
0
0
4
12.5
12
0
0
9
75
表1 激素浓度(6-BA+NAA)对冬樱花愈伤组织形成及褐变的影响
和凤美等：冬樱花愈伤组织诱导和抑制褐化初探 ·· 131
中国农学通报 http://www.casb.org.cn
和 33.3%，外植体的褐变数较高；在黑暗培养下，外植
体褐变率都有所降低，分别降低了2.4%、8.7%、10.1%、
9.6%和3.7%。
从表 3中可以看出，所有外植体在 75%酒精处理
20 s后，随着在升汞中处理时间越长，褐变率越高。所
有外植体中，子房的褐变率最高，其次是花托和花梗，
叶片的褐变率最少。在75%酒精处理30 s后再在升汞
中处理 5 min，所有外植体褐变率变高，这就说明消毒
时间越长，褐变率越高。
2.2 吸附剂对外植体褐变的影响
活性炭是一种吸附性较强的无机吸附剂，可以吸
附 培 养 基 中 的 有 害 物 质 。 笔 者 在 MS ＋
0.56-BA + 3.5NAA、MS ＋ 2.06-BA + 2.0NAA、
MS＋4.06-BA+0NAA 3个培养基中添加了活性炭。从
表4中可看出，加了活性炭的培养基中，外植体褐变的
现象明显减少，说明活性炭能够抑制褐变的产生。其
中对花梗的褐变抑制最为明显，在 MS + 0.5 mg/
L6-BA + 3.5 mg/LNAA 培养基中抑制褐变效率达
100%,在MS+2.0 mg/L6-BA+2.0 mg/LNAA培养基中
可达到88.9%。
2.3 激素对愈伤组织分化的影响
将长出的愈伤组织转接到分化培养基中，分化培
养1周后，多数愈伤组织上出现了紫红色小斑点；分化
培养 2周后，除子房愈伤组织和少数花梗愈伤组织未
发生褐变，其余均发生褐变；分化培养 3周后，所有外
植体形成的愈伤组织全部褐变，未分化出芽点或苗。
从表 5中可以看出，愈伤组织转接一周后，NAA
浓度不变，随着 6-BA浓度减少，愈伤组织分化时褐变
率变高。在花梗愈伤组织分化培养基中，当NAA浓度
为 0.5 mg/L，6-BA浓度为 6 mg/L，5 mg/L时褐变率最
低，为 40%，而 6-BA浓度为 2.5，2 mg/L时，褐变率最
高，为 80%，说明花梗愈伤组织不适宜在 6-BA浓度低
中生长；同样的，在花托、子房、叶片愈伤组织分化培养
基中，6-BA浓度为2.5、2 mg/L时，褐变率最高。同时，
子房的褐变率最低，花托的褐变率最高。从表 6中可
以看出，在激素为KT+IBA的培养基中，子房没有发生
褐变，其余外植体均有褐变现象发生，且花托和叶片的
褐变率较高，为33.3%。
外植体
接种数/块
光照下褐变数/块
光照下褐变率/%
暗培养褐变数/块
暗培养褐变率/%
褐变率降低/%
叶片
288
26
9.7
4
0.1
9.6
花梗
288
24
8.3
17
5.9
2.4%
花托
288
44
15.2
29
6.5
8.7%
子房
288
56
19.4
27
9.3
10.1%
苞片
108
36
33.3
32
29.6
3.7%
消毒方法
75%酒精20s+升汞2 min
75%酒精20s+升汞3 min
75%酒精20s+升汞4 min
75%酒精20s+升汞5min
75%酒精30s+升汞5 min
叶片褐变率/%
6.7
10.0
23.3
36.6
39.3
花梗褐变率/%
13.3
14.3
30.0
36.6
43.3
花托褐变率/%
32.5
40.0
66.6
68.5
86.6
子房褐变率/%
43.3
63.3
83.3
70.0
90
表2 光照对外植体褐变的影响
表3 消毒时间对外植体褐变的影响
6-BA+NAA浓度/(mg/L)
叶片
接种块数/块
褐变数/块
褐变率/%
未加活性炭时褐变率
抑制褐变效率/%
0.5+3.5
32
0
0
0
0
2.0+2.0
32
1
3.1
15.6
80.1
4.0+0
32
0
0
0
0
表4 活性炭对外植体褐变影响
·· 132
3 讨论
该试验中愈伤组织的形成与激素种类、激素浓度、
外植体消毒时间和光照有关。不同外植体，适应于不
同的激素浓度，单一激素的诱导效果没有 2种激素共
同诱导的效果好，不同外植体，出愈率有差异，花梗和
叶片的出愈数最多，其次是花托，子房，苞片为最差外
植体。外植体的不同部位对激素浓度有一定的适应范
围，过高和过低都不利于愈伤组织的诱导，而光照强
6-BA+NAA浓度/(mg/L)
花梗
花托
子房
接种块数/块
褐变数/块
褐变率/%
未加活性炭时褐变率
抑制褐变效率/%
接种块数/块
褐变数/块
褐变率/%
未加活性炭时褐变率
抑制褐变效率/%
接种块数/块
褐变数/块
褐变率/%
未加活性炭时褐变率
抑制褐变效率/%
0.5+3.5
32
0
0
21.8
100
32
3
9.3
34.3
72.8
32
8
25
56.2
55.5
2.0+2.0
32
1
3.1
28.1
88.9
32
5
15.6
21.8
28.4
32
9
28.1
53.8
47.7
4.0+0
32
3
9.3
31.2
70.2
32
4
12.5
71.8
82.5
32
6
18.7
28.1
33.4
续表4
表5 激素浓度（6-BA+NAA）对愈伤组织褐变的影响
6-BA+NAA浓度/（mg/L）
花梗
花托
子房
叶片
转接数/块
褐变数/块
褐变率/%
转接数/块
褐变数/块
褐变率/%
转接数/块
褐变数/块
褐变率/%
转接数/块
褐变数/块
褐变率/%
6.0+0.5
10
5
50
10
6
60
10
5
50
10
6
60
5.0+0.5
10
4
40
10
6
60
10
5
50
10
6
60
4.0+0.5
10
4
40
10
7
70
10
4
40
10
5
50
3.5+0.5
10
5
50
10
8
80
10
4
40
10
6
60
3.0+0.5
10
6
60
10
10
100
10
5
50
10
3
30
2.5+.05
10
8
80
10
10
100
10
7
70
10
7
70
2.0+0.5
10
8
80
10
10
100
10
6
60
10
8
80
愈伤组织
花梗愈伤组织
花托愈伤组织
子房愈伤组织
叶片愈伤组织
KT/(mg/L)
0.5
0.5
0.5
0.5
IBA/(mg/L)
0.5
0.5
0.5
0.5
转接数/块
6
6
6
6
褐变数/块
1
2
0
2
褐变率/%
16.6
33.3
0
33.3
表6 KT和 IBA浓度对愈伤组织褐变的影响
和凤美等：冬樱花愈伤组织诱导和抑制褐化初探 ·· 133
中国农学通报 http://www.casb.org.cn
度、消毒时间长短对愈伤组织的形成也有一定影响。
在愈伤组织形成的过程中，外植体的褐变现象经
常发生。造成外植体褐变的原因有很多。首先，冬樱
花属于木本植物，而木本植物的褐变现象最为严重，一
般认为这是由于外植体伤口处分泌的酶类化合物所引
起的。于守超等认为，引起褐变的酶主要是多酚氧化
酶（PPO），PPO将酚类物质氧化成醌，从而导致了组织
细胞的坏死，影响植物材料的正常生长，严重时可以导
致培养物的死亡[8]；其次，是外部因素造成的。初期培
养时，在光照下，培养基褐变率极高，而进行遮光培养
后，褐变率明显降低。高温和光照会提高 PPO活性，
促进多酚类物质的氧化，从而加速氧化过程，使植物材
料的褐变更为严重[9]；此试验中，选用了 5种不同的外
植体，其中除苞片全部褐变外，子房的褐变率最高，花
梗和叶的褐变率最低。子房褐变率高的原因，是由于
子房内的PPO活性比花梗强，所以子房的褐变率比花
梗的褐变率高；另外，外植体的消毒时间也与褐变的形
成有关，子房的组织细胞比花梗的组织细胞幼嫩，不能
承受较长的消毒时间。消毒时间过长，会导致子房组
织细胞死亡。所以，应当尽量缩短消毒时间。活性炭
是一种吸附性较强的无机吸附剂，能吸附各种微量物
质和微小颗粒，在培养基内加入活性炭后，褐变率显著
降低，但没有诱导出愈伤组织，这可能是因为活性炭在
吸附培养基中有害物质的同时，也吸附培养基中的营
养成分[10-11]，从而使外植体保持常绿状态而无法正常生
长形成愈伤组织。
在对愈伤组织的分化培养过程中，也出现了褐变
现象。在分化培养基中，子房产生的愈伤组织褐变数
较少，而花托产生的愈伤组织褐变数较多，并且，分化
培养 2周后，除子房和少数花梗愈伤组织没有褐变死
亡外，其他均发生褐变。该实验中冬樱花愈伤组织的
分化末成功，其原因除了培养基的筛选有关外，还可能
与愈伤组织的疏松程度有关。花托和叶片产生的愈伤
组织疏松易散，转接后散成颗粒状则难以继续生长，而
子房和花梗产生的愈伤组织结构紧密，尤其是子房愈
伤组织，多为致密的块状，转接后仍可继续生长。在分
化培养基中，愈伤组织曾出现了紫红色或紫红色斑点，
可能是由于冬樱花中含有花色苷的原因。卢其能等认
为，高浓度的6-BA能促进红色愈伤组织中花色苷的积
累，但需消耗大量的物质和能量，不利于愈伤组织的生
长[12]。
参考文献
[1] 段晓梅.冬樱花扦插繁殖研究 [J].西南林学院学报,2003,23(1):
43-45.
[2] 李丽,范眸天,杨德.昆明地区冬樱花开花生物学习性的初步研究
[J].云南农业大学学报,2005,20(3):448.
[3] 邹娜,曹光球,林思祖.观赏樱花繁殖技术研究进展[J].西南林学院
学报,2007,27(6):42-46.
[4] 王文房,李修岭.樱花花柄的组织培养[J].安徽农业科学,2006,34
(22):5839-5841.
[5] 孟月娥,李艳敏,赵秀山.日本晚樱组培快繁技术研究[J].中国农学
通报,2006,22(10):264-266.
[6] 黄守印,池井存,苏淑欣.雾灵山地区野生樱花的组织培养与快速
繁殖[J].植物生理学通讯,2003,39(3):228.
[7] 王光萍,黄敏仁.福建山樱花的组织培养及植株再生[J].南京林业
大学学报,2002,26(2):73-75.
[8] 于守超,赵兰勇,王芬.植物组织培养过程中外植体褐变机理研究
进展[J].山东林业科技,2004,154(5):61-63.
[9] 邱璐.桑树组织培养中褐化问题的研究[J].云南大学学报,2000,22
(1):76-78.
[10] 刘用生,李有勇.植物组织培养中活性炭的使用[J].植物生理学通
讯,1994,30(3):214-217.
[11] 王东霞,力场杰.如何对抗植物组织中的组织褐变[J].中国花卉盆
景,2002,12:29-30.
[12] 卢其能,杨清.激素等外源物质对马铃薯愈伤组织花色苷积累的影
响[J].西北植物学报,2007,27(11):2233-2239.
·· 134