全 文 ：菌 物 系 统 8 1 ( 1) :5 5一 60, 19 9 9
场 ,e o sy s et m a
双抱蘑菇及大肥菇的种内及种间多态性 R A P D 分析
曾 伟 ’ , 2
( 1 厦门大学生物学系
宋思扬 ` 王泽生 2 苏文金 `
厦门 3 6 10 0 5 ; 2 福建省轻工 业研究所 福州 3 50 0 0 5 )
摘要 应用以 P D 方法分析双抱蘑菇 (gA a r i e u s 方isP o r u s )及大肥菇 (七 a r ie u s b iot r叮u is )的种
内及种间多态性 , 进一步证实由于双饱蘑菇的遗传保守性 , 多数饱子为 自体可育的异核抱子 ,
从而导致种内相似性很高 ; 而依赖天然杂交具四抱特性的大肥菇种 内相似程度较低 。 研究还
分析评价了蘑菇属中的这两个不同种之间的亲缘关系 , 为种间杂交选材提供了理论依据 。
关键词 双抱蘑菇 , 大肥菇 , RA P D , 种内多态性 , 种间多态性
中图分类号 : 0 9 39 . 5 3 文献标识码 : A 文章编号 : 10 0 7一 35 1 5 ( 19 9 9 ) 0 1书 0 5 5一60
双抱蘑菇 gA ar i。 、 b lsP 口ur 、 (L an ge ) Im b ac h . 是世界上消费最大 , 栽培范围最广的食
用菌 , 但由于物种 自身保守的次级同宗配合遗传方式以及长期野生种质的匾乏 , 导致在商
业 “ 近乎纯种栽培 ” 1[] 。 因此 , 在积极倡导在 自然界中寻求新 的种质资源的同时 , 更应加强
运用 现代 生物 技术实施 种 内及种 间杂交 来培育新 品种 。 双环蘑 菇 gA ar icu 、 ib ot qr u is
(Q ue .l) S ac
c
.
(俗称大肥菇 )在分类上亦属蘑菇属 , 在外观形态上与双抱蘑菇很相似 , 但其
种性与双抱蘑菇相 比 , 大肥菇具有耐高温 、 抗双抱蘑菇病毒的优 良生产性状 。 如能通过种
间杂交将这些优 良种性结合到双抱蘑菇上 , 将增强双抱蘑菇 的抗逆性 , 扩大其栽培范围 。
为选择合适的杂交亲本 , 应首先调查双抱蘑菇及大肥菇的生产用种及保存菌种间的
亲缘关系 , 收集必要 的基础生物学数据 。 C as let 等人曾以 R FL P 为标记进行双抱蘑菇及大
肥 菇 的 种 内 和 种 间 多 态 性 研 究 l2[ 。 本 文 报 道 应 用 RA P D 技 术 ( R a n d o m A m lP if ed
oP ly m
o rp 址 c D N A , 随机引物扩增多态性 D N A )分析双抱蘑菇及大肥菇的种 内及种间多态
性的研究结果 。
1 材料和方法
L l 材料
菌株 : 双抱蘑菇菌株 6 株 , 菌号分别为 sF 3 、 0 93 、 02 、 2 7 9 6 、 闽一号 、 82 1 1 ; 大肥菇菌株 3 株 , 菌号分别为
17
、 台高温 、 JW 80 0 2 。 以上菌株均为福建省轻工业研究所蘑菇菌种研究推广站提供 。 菌株培养应用常规
P D A 培养基 。
1
.
2 方法
1
.
2
.
1 总 l ) N A 提取 : 将参考文献3[] 介绍的方法加以改进 。 用接种铲将生长于斜面的菌丝刮下 , 置于瓷制
研钵 , 浇人液氮冷冻后 , 将菌体砸至粉末状 。 然后用提取缓冲液 (T isr 一 0 10 mm ol / L , E D可A 40 ~ ol / L,
* 福建省 自然科学基金资助项目 (9C 6 0 6 5) 。
黄延梅 , 翁育伟同学参加了本文的部分工作 , 特此致谢
19 9 7一 10 一 7收到原稿 , 19 98 刁 5一 18 收到修改稿 。
DOI : 10. 13346 /j . mycosystema . 1999. 01. 010
56菌 物 系 统 18卷
pHs
.
o )将粉碎的菌体洗至s ml离心管 , 加 l / 10 体积 10% SDS , 60℃水浴 30 分钟 , 10 o o o r / m in 离心 15 分
钟 , 弃沉淀 , 上清加人 1 / 3 体积 3m ol / L N ` A c (PH 5 2) , 混匀后冰浴 30 分钟 , 12 , 0 00r / 而 n 离心 巧 分钟 ,
弃沉淀 , 上清加人等体积异丙醇 , 混匀 , 置 4℃ 30 分钟 , 12 O00r / m in 离心 15 分钟 , 得到的 D N A 沉淀加无
菌双蒸水溶解 。 D N A 溶解液用 O 2D 60 nm 测含量
。
1
.
.2 2 随机引物 P c R 扩增 : 参照文献 4[] 的方法进行 。 总体积 2 5协LP c R反应体 系中分别含 10 x P c R
b Ll f fe r 2
.
5 协L : Mg C 1
2
( 1 sm
o l / L ) 2协L : d N T p ( sm
o l / )L 0
.
7协L (美国 p or m e g a 公司产品 ) ; T叫酶 ( l u / 协L )
1
.
5协L (美国 P or m eg a 公司产品 ) ; 引物 ( 10 mP / 协)L 1卜L (购 自中国科学院遗传所 , 见表 1) ; 模板 D N A (5 一
10 ng / 协)L 4协L ; P C R 用水补足余下体积 。
表 1 本实验所用随机引物编号及核昔酸序列
T a bl e 1 C o m m e cr ial n um be
r
an d l〕 N A s e q ue nc e s o f anr d o m P ir m e sr
编 号 核昔酸序列 ( 5 ’ 一 3 ’ ) 编 号 核普酸序列 ( 5 ’ * 3 ’ )
N 山刀 be r S e qu e n e e o f P ir m e r s N u】11be r S e q u e nc e o f P ir m e sr
O P U l l A G A C C C A G A C O PU 16 C T G C G〔 T G G A
O P U 12 1
,
C A C ( 洁 (工 )C A O P U 17 A C 〔丁G G G G A G
O PU 13 C ( 〕C T G眨月, f C C O P U 1 8 C八 (〕3 T C C A C A
O P U 14 TG G G I 〔 C C r r C O P U 19 ( 〕丁〔执 C T 〔 K二( 谈3
O PU 15 A C G G G汇 C A G T O P U 20 A C A (张二C (工!C A
反应条件为 : 94 ℃预变性 , 2 分钟 ; 之后进行 42 个以下循环 : 94 ℃ 1分钟 , 36 ℃ 1分钟 , 72 ℃ 2分钟 ;最后
72 ℃继续延伸反应 10 分钟 。 每个引物均设无模板 D N A 空白对照 。
1
.
2
.
3 电泳 : 采用 T A E 缓冲系统 , 琼脂糖凝胶浓度 1 . 4% , CP R 产物加量 1 0闪 , 电压 s v/ c m , 电泳结果 由
E B 染色得到 。
2 结果
本实验用 10 种随机引物对 6 株双抱蘑菇及 3株大肥菇 的基 因组 D N A 进行扩增 , 均得
表 2 各菌株间N a b / N a +附统计数据表 ’
Tab l
e 2 S l a t l s it c al d a t日 o f N自b / N自+ N b be wt e e n s t r出 n s
N a b sF 3 0 9 3 0 2 2 7 9 6 闽一号 8 2 1 1 17 7 台高温 JW 8 0 0 2
Na + N l
〕
sF 3
\ \0 9 3 7 0 / 17 6 ,
\0 2 6 8 / 1 7 6 6 8 / 17 8 \ 、 2 79 6 6 8 / 1 7 5 7 0八 7 7 70 / 18 4
、
\闽一号 7 3八 8 1 7 4 / 1 8 3 7 2/ 18 3 7 7 / 18 2 、 \ \ 82 1 1 7 3 / 1 82 7 3 / 1 8 4 70 / 18 4 7 5 / 18 3 9 2 / 18 9 \1 7 7 2 9 / 1 62 3 3门 6 4 3 2/ 16 4 2 6 / 16 3 3 2 / 16 9 3 3 / 17 0 、 \ \ 台高温 3 0 / 1 5 8 3 2 / 1 6 1 34 / 16 1 2 9 / 16 0 3 2 / 16 6 3 1/ 16 7 30八 4 7 \ 、 \ JW 8 0 0 2 3 7 / 1 6 5 3 6门 6 7 4 1/ 16 7 3 8 / 16 6 3 8 / 17 1 3 8 / 17 2 4 0 / 15 3 3 2 / 14 5 、
、
* 其中N自b为两菌株间的相同带数 , aN 、 N b分别为它们的总带数
N a b
aN, N b
N u l l勺 be r o f ht e i d e n it c al am lPi if
e
iat
o n l co i be wt
e e n s t r a isn
N u m be r o f het am lP iif
c
iat
o n lco i o f het
s t r由 n s .
1 期 曾伟等 :双抱蘑菇及大肥菇的种内及种间多态性RA P I叉珍析
到阳性结果 , 扩增条带分布从 5 0 bP 至 k3 b 不等 , 平均每个引物约可扩增出 8一 9 个条带 ,
将得到的所有 电泳 图谱进行统计得到以下结果 :
聚类分析各菌株 间的遗传相似值 , 根据公式 5[] : 相似值 s 二 ZN a b / Na + Nb 将表 2 中的
数据换算得到表 3 , 从表中数据计算 出 , 双抱蘑菇菌株间的平均遗传相似值为 0 . 80 4 , 而大
肥菇菌株 间的平均遗传相 似值为 0 . 429 , 可见双抱蘑菇的种 内相似程度 明显高于大肥菇 ,
二者之间的种间相似值为 0 . 4 0 5 。
表3 各菌株间遗传相似值
T ab l
e 3 V al ue s o f g e n e it e si im liar yt be wt
e e n s tr ia n s
S值 ( x 10 0 ) sF 3 0 9 3 0 2 2 79 6 闽一号 82 1 1 17 7 台高温 JWS O0 2
v al u e s o f s
sF 3 \ \ 0 9 3 7 9石 \ \ 0 2 7 7 3 7 6
.
4 \ \ 2 7 9 6 7 7 7 7 9
.
1 7 6
.
1 \ \ 闽一号 80 . 7 8 0乡 7 8 . 7 84 . 6 \ 8 2 1 1 80
,
2 7 9
.
4 7 6 1 8 0
.
2 9 7
一
4 \ \ 17 7 3 5
.
8 4 0
.
2 3 9
.
0 3 1
,
9 3 7乡 3 8 . 8
\ \台高温 3 8 . 0 3 9 .8 4 2 . 2 3 6 3 3 8石 3 7 . 1 4 0 . 8
\ JW 8 0 0 2 4 4
.
9 4 3
.
1 4 9
.
1 4 5 `8 4 4
一
4 4 4
.
2 5 2 3 4 4
.
1 \ \ 我们根据表 3 中的数据绘制包括所有供试菌株的遗传相似程度系统树 (图 l)
台高温
」丫V8 0 0 2
1 7 7
0 2
0 9 3
F S 3
2 7 9 6
8 2 1 1
闽一号
l } { } I { ! I
0
一
9 0 0
图 l
0 名 0 0 0 7 0 0 0 . 6 0 0 0乃0 0 0 A 0 0 0 3 0 0
双饱蘑菇及大肥菇各菌株间的遗传相似性系统树
1 l l e ter e o f g e n e it c 5 1而 lair it e s am o ll g ht e s t r a 皿sn o f 凡 b lsP o r u s a n d 注 b i ot r q u is
5 8 菌 物 系 统8 1卷
3 讨论
R A PD 技术是在 PCR 基础上发展而来的 。 199 0 年由 W l i ia ms 发现 , 主要原理是利用
10 碱基 随机引物 , 对物种 的基因组 D N A 进行 P C R 扩增 , 扩增产物的电泳图谱在物种及个
体间可呈现差异性 、 多态性 6[] 。 应用 R A P D 技术可在对物种没有任何分子生物学研究的情
况下进行 D N A 分子水平的多态性分析 。 相对 R F L P 技术而言 , 有操作简单易行 , 所需仪器
设备少的优点 , 此项技术 已广泛应用于个体鉴定 、 家系分析 、 种群遗传 、 基 因定位 、 连锁 图
构建等许多方面 。
本实验选用的双袍蘑菇菌株 sF 3 为野生种 、 093 为棕色蘑菇 、 02 、 2 7 9 6 、 闽一号及 82 1
为近年生产用种 , 其中 02 为高产型菌株 , 但子实体质量欠佳 , 而闽 1 号 , 8 2 1 为优质型菌
株 , 但产量较低 , 2 7 9 6 为 02 与另一优质菌株杂交子代 ,兼具双亲优点 , 产质量均较好 , 是近
年福建省主要栽培用种 。 尽管研究选用的双抱蘑菇的菌株来源各异 , 性状也不尽一致 ,但
从 R A P D 分析得到的结果来看 , 各菌株之 间的遗传相似程度很高 , 均达 0 . 75 以上 。 早先应
用 R F LP 、 同工酶标记分析双抱蘑菇 的种内多态性也得到类似结果 l[, 7〕。 说明目前生产上所
用的商业菌株及许多研究用种可能源 自为数不多的先祖 。 双抱蘑菇 自身十分保守的遗传
机制是产生种 内个体在遗传上高程度相似 的主要 内因 , 双抱蘑菇担子 中减数分裂产生四
个单倍体核 , 平均分配至产生的两个饱子中 , 其中的非姐妹核有进人同一个抱子的非随机
倾向 , 致使多数抱子为 自体可育的异核饱子 , 这一机制最大程度地在子代 中保持了亲本的
遗传特性 。 我们观察到菌株 82 n 与其单抱分离子代闽一号之间的遗传相似值高达 0 . 97 4 ,
而菌株 2 7 9 6 与其杂交亲本之一 02 的遗传相 似值却为 0 . 7 6 1 。 可见 , 在育种实践 中 , 由于双
抱蘑菇进化保守 , 产生变异能力差 , 因此传统采用的单抱与多抱筛 选方法不是 获得新种的
好办法 , 只有实行人工杂交才能打破双袍蘑菇天然生殖体系的局限 , 育出集中各种优 良种
性的新菌株 。
在三株大肥菇 17 、 台高温 、 JW 8 0 0 2 中 , 种 内的遗传相似程度明显低于双抱蘑菇 , 最高
也仅达 0 . 5 23 ( 17 与 JW SO0 2) 。 大肥菇是一种四袍蘑菇 , 担子产生四个单倍体抱子 , 单倍
体抱子萌发的菌丝必须与性 因子相异的单倍体菌丝进行杂交后才可恢复育性 。 异宗配合
的生活方式使得大肥菇 的种 内多态性明显多于双抱蘑菇 。 大肥菇的线粒体 D N A 的种内
多态性也多于双抱蘑 菇 , 在双抱蘑菇中 , 发现的线粒体基因型仅为三种 8[] 。 大肥菇依赖天
然杂交的四袍特性使得它在子代 中产生变异的机率高于双抱蘑菇 , 这是大肥菇抗逆 、 抗病
等优 良种性的进化来源 。 在许多植物的类似研究 中也发现 自交不育的物种的种 内多态性
多于 自交可育的物种 9[] 。
与种 内杂交相反 , 种间杂交 由于存在种间不亲和 障碍 , 初期的杂交实验应选择具较大
遗传相似的两个亲本 。 分析双抱蘑菇与大肥菇 的种间多态性发现 , 二者之 间的亲缘关系
并不象以往预计的那么近 l2] , 平均遗传相似值为 0 . 405 , 尽管二者在许多外观形态上很相
象 。 三株大肥菇 中 , JW 8 0 O Z 与各双抱蘑菇 菌株有 比其它两株大肥菇稍 高些 的遗传相似
值 。 而 6 株双袍蘑菇 中 , 0 2 菌株 与各大肥菇菌株的遗传距离较近 , 其中与 」W 8 0 0 2 的遗传
相似值最大 , 为 0 . 49 1 。 02 菌株为典型的高产菌株 , 同工酶酶谱被划归为 H 型 , 是较好的杂
交材料 l[ 0] 。 因此 , 综合考评结果表明 , 选择双袍蘑菇 02 与大肥菇菌株 JW 8 0 0 2 可能较易实
1 期 曾伟等: 双抱蘑菇及大肥菇的种内及种间多态性 RA I P)分析
施种间杂交 。19 1 年 , 王泽生等初步确定 了双抱蘑菇与大肥菇原生质体制备与再生条件 ,
为克服双抱蘑菇 与大肥菇 的种 间不亲和 障碍 , 运用种间原生质体融合的方法培育耐温抗
病的蘑菇新品种作了实验性的探索 1 ’ , ` 2] 。
我们还注意到大肥菇 JW 8 0 0 2 与双抱蘑菇菌株 的遗传相似值有时甚至高出与 17 以
及台高温之间的遗传相似值 。 部分原 因可能是 , 在对随机引物扩增产物的电泳图谱进行
聚类统计分析时 ,分子量相 同的片段被归人相似项 ,但分子量相 同的片段有可能有不尽相
同的内部序列 , 尤其在不 同的物种 间 , 发生这种 现象的可能性更大 , 由此可能导致一定的
实验误差 。 因此如能在研究中将 R A P D 、 R F L尸 这两类遗传标记联合 、 配套使用 , 将可获得
更精确 、 更完善的实验数据 。
参 考 文 献
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【12] 王泽生 , 廖剑华 , 王贤樵 。 双抱蘑菇与大肥菇原生质体再生条件研究 。 食用菌 , 19 90 , 12 ( 6) : 16 一 1 7 。
60 菌 物 系 统 卷6 U1 8
R A PD AN L A Y SI SON FT EI R SE PC I F I C
N N T I R A D A SE PC I F I C PO L Y入4 O R PH I S MO F
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e e et d ot an al y
s i s ht e i r i n et sr pe
e i if c an d i
n t r a s pe e i if e
po l y m
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S at ti s it c al d a ta s h o w ht at ht e er aer ih g h
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Po l y m o pr h i s m
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