全 文 ：食用菌学报 1 5 99. 2 ( s ) :i 一 5
A e t a d Eu i ls Fu gn i
双抱蘑菇同核原生质体育种技术研究 *
1
. 同核原生质体的分离与鉴定
马爱民 贺冬梅 潘迎捷
(上悔市农业科学院食用菌研究所 ;农业部食用菌遗传育种重点实验室 , 上海 2 0 1 1 0 6)
摘 要 通过对溶壁酶组成及浓度 、 渗透压稳定剂 、 菌丝培养方法等研究 , 建立了有效的双抱
蘑菇原生质体制备与再生系统 . 采用 1 . 5 % L y w al 坟y l l l e 、 0 . 6M K cl 为渗透压稳定剂 , 25 ℃酶解4小
时 , 原生质体的产量可达到1护个 / m l ; 纯化后的原生质体在O . 6M 蔗糖为渗透压稳定剂的P D M A培
养基中 . 25℃恒温培养 5 一 7天 , 再生率达 1叫以上 。 根据原生质体再生菌落出现时间的先后顺序 , 并
以菌落形态特征 、 菌丝生长速度 、 梭甲基纤维素酶 ( C x酶 )活性及子实休形成能力上的差异为鉴定同
核体的主要标记 , 从两种形态类型 , 不同来源的 12 个双袍蘑菇菌株中均分离到同核原生质体 , 同核
率为 2 % ~ 15 % ,平均为n . 75 % 。
关键词 双袍蘑菇 ; 同核原生质体 ; 分离与鉴定
双抱蘑菇 (A g ar ic us ib sP or us )是世界上主要栽培食用菇类之一 , 具有较高的食用价值和
巨大的经济价值 〔 ” 。 由于它具有独特的性生活周期 , 造成 了双抱蘑菇品种的相对单一 , 加之病
毒感染和菌种退化 , 使有限的双抱蘑菇菌种不能满足生产日益发展的需要 . 因此 , 对双抱蘑菇
菌种的遗传改 良以及优 良栽培品种的筛选就成了菇类遗传学家与育种专家研究的核心内容 ,
围绕这一核心 , 荷 、 美 、 英 、 法和加拿大等欧美国家的科学家们采用了各种育种手段 , 主要 以多
抱选择 、 单抱选择 、 单袍杂交以及原生质体融合等技术选育双抱蘑菇 菌种 , 并获得 了一批适合
工厂化栽培的双抱蘑菇新菌种 〔 2一 ` 〕 。 我 国自八十年代初也开始了双袍蘑菇的育种研究工作 “ ’ ,
但总体技术水平同国际先进水平之间还存在一定的距离 。
本研究根据国内外食用菌育种研究的最新动向与趋势 , 旨在建立双抱蘑菇同核原生质体
杂交育种体系 。 报道的第一部分系统地研究了双抱蘑菇原生质体制备与再生 , 同核原生质体的
分离与鉴定 , 为开展双抱蘑菇同核原生质体的杂交研究奠定 了基础 。
1 材料与方法
1
.
1 供试菌株
供试的 12 个双抱蘑菇菌株 均 由本所菌种保藏中心提供 , 其 中A ,一 A 。菌落形态为气生
型 , A 了一 A l : 为甸甸型 。
L Z 培养基
1
.
2
.
1 P D A
: 马铃薯 2 0 0 9 , 葡萄糖 2 0 9 , 琼脂 2 0 9 , 蒸馏水 1 00() m l 。
收稿 日期 : 1 9 95一 0 4一 1 0初稿 : 1 995一 0 7一 28修改稿 。
*上海市科委资助项目 。
DOI : 10. 16488 /j . cnki . 1005 -9873. 1995. 03. 001
2食 用 菌 学 报 . 2卷
1
.
2
.
2PD M
: 马铃薯 20 09 , 葡萄糖 2 0 9 , 麦芽提取物 1 9 , 蒸馏水 1 0 o o m l ·
1
.
2
.
5 P D M A
: 马铃薯2 0 0 9 , 葡萄糖2 0 9 ,麦芽提取物 1 9 ,琼脂 2 0 9 ,蒸馏水 l o o om l·
1
.
2
.
4 CM C
:
CM C
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N a 5 9
,
M g S O
。
0
.
5 9
,
K H
:
P O
`
2 9
, 酵母粉 2 9 , 琼脂 15 9 ,蒸馏水 1 00 o m l 。
L 3 溶壁酶及其配制
溶壁酶为广东微生物所和美国A T C C产品 , 用 .0 6 M 的渗透压稳定剂 (K CI , M g S O 。 , 蔗糖
和甘露醇 )配制 , l o 0 00r p m离心2 0分钟 , 上清液经0 . 45 # m细菌滤膜过滤备用 .
L 4 双抱蘑菇原生质体的制备
取静置培养 5一 7天的菌丝体 , 洗净后置于酶液中25 ℃酶解 4小时 (间隔摇动) , 经脱脂棉过
滤 , 渗透压稳定剂洗涤 , ZOO0r p m 离心 10 分钟 , 即得到纯化的原生质体 .
1
.
5 双抱蘑菇原生质体的再生
纯化后的双抱蘑菇原生质体用渗透压稳定剂稀释到合适浓度 , 涂布于再生培养基上 , 25 ℃
恒温培养 , 并以不加渗透压稳定剂的再生培养基做对照 。
1
.
6 双抱蘑菇同核原生质体的分离
按再生菌落出现的时间 , 将先再生出来的原生质体菌落计数并挑除 , 再挑后长出来的微小
菌落供鉴定 。
1
.
7 菌丝生长速度的测定
取直径 Zm m菌块 , 接种在定量的P D M A平板上 , 25 OC恒温培养 10 天 , 测菌落半径 . 菌丝生
长速度 (m m / d a y )二所测得的菌落半径 /菌丝生长天数 。
L S 梭甲基纤维素钠透明圈测定 “ }
取直径 Z m m 的菌 块 , 接种在 定量 的 C M C培养基上 , 25 ℃恒温培养 7天 , 以 下列方式染
色 : 0 . 2 %刚果红液逸鱼丝全丝神倾去染液、 I N N a cl 竺鱼鱼迪与倾去N a cl * I N H cl 坐鱼
竺壁塑与倾去 H cl ,然后测透明圈直径 。
1
.
9 同核体和异核体的结实试验
按常规方法进行 .
2 结果与分析
2
.
1 双抱蘑菇原生质体的制备与再生
2
.
1
.
1 双饱蘑菇原生质体的制备
试验了溶壁酶组成及浓度 、 菌丝生理状况 、 渗透压稳定剂 、 酶解时间等因素对双抱蘑菇原
生质体制备的影响 。 结果表明 , L y w al lz y m e对双抱蘑菇菌丝的脱壁效果明显优于 A T C C的溶
壁酶和两种酶的混合体系 , 在L y w al l yz m e浓度为 1 . 5 %时原生质体产量最高 . 随着酶浓度的提
高 , 原生质体产量没有呈比例增加 。 采用将菌丝磨碎后进行二次培养的方法培养 5 ~ 7天的菌
丝 , 其生理状况较为适合原生质体的制备 , 菌落形态呈气生状态的菌丝 , 培养时间相对长于甸
甸状态 的菌丝 。 在 不同类型 的渗透 压稳定剂中 , 以 无机型的 K C I脱壁效果最好 , 依次为蔗
糖 、 M g 8 O : 和甘露醇 。 25 ℃酶解 4小时的原生质体产量最高 .
2
.
1
.
2 双袍蘑菇原生质体 的再生
2
.
1
.
2
.
1 不 同渗透压稳定剂对双抱蘑菇原生质体再生的影响 研究表明 , 双抱蘑菇原生质体
在有机型的渗透压稳定剂中具有较好 的再生率 , 其中用蔗糖作为稳定剂的再生率明显优于甘
3期 马爱民等 : 双袍蘑菇同核原生质体育种技术研究 1. 同核原生质体的分离 与鉴定
露醇 , 而无机型的稳定剂不适合再生 。 制备与再生采用两种不同类型的渗透压稳定剂 , 这是双
抱蘑菇原生质体制备与再生中的一个明显特点 。
2
.
1
.
2
.
2 不同类型菌丝的原生质体再生所需时间及再生率 从表 1可以看出 , 不同菌丝形态的
双抱蘑菇菌株在再生率和再生时间上有较大的差异 , 再生率分布在 0 . 9 %一 8 . 1%范围内 , 而再
生时间则以 6一 10 天不等 . 主要特点有 : 再生率与再生时间无明显相关性 ; 同一菌丝形态的菌株
间也存在不同的表现 ; 菌丝形态类型对再生率和再生时间无明显影响 ; 双抱蘑菇原生质体的再
生率明显低于其它食用菌的再生率 。 以上结果表明 , 双抱蘑菇原生质体的再生是一个比原生质
体制备更为复杂的过程 , 由于细胞壁的再生是一个基本相似的代谢合成过程 , 不同菌株在再生
率与再生时间上表现出来的差异可能与菌株 自身的遗传特性和菌丝的形态及生理类型有关 。
表 1 双抱蘑菇原生质体再生及同核原生质体的分离
T a b l e 1 P r o t o p l a s t r e g e n e r a t i o n a n d h o m o k a
r y o t i e p r o t o p l a s t i s o l a t i o n o f A
.
b is P o
r u s
菌株编号
S t
r a i n
再生率 ( 洲)
R e g e n e r a t io n
再生时间 (天 )
R e g e n e r a t i o n
同核率 (% )
H o m o k a r y o t iz a t i o n
r a t e (% ) t im
e ( d a y )
再生原生质体数
N u m b e r o f
r e g e n e r a t e d
P r o t o P la s t
同核原生质体数
N u m b e r o f
h o m o k a r y o t i e
P r o t o P la s t
r a t e (% )
1502539427n1058513246娜3986979430622718A 1
A 2
A 3
A 4
A 5
A 6
A 7
A 8
A 9
A 1 0
A l l
A 1 2
6
8
6 ~ 7
1 0
6
8
7
9 ~ 1 0
8
9
6 ~ 7
7~ 8
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.
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2
.
2 双抱蘑菇同核原生质体的分离与鉴定
2
.
2
.
1 双抱蘑菇同核原生质体的分离
表 1表明 , 供试的 12 个菌株均能分离到同核原生质体 , 比例由2师一 15 % 不等 , 其中平均同
核率为 1 1 . 75 % (表 2) , 这一结果表明 , 同核原生质体是双抱蘑菇原生质体制备过程中出现的一
个普遍现象 .
表2 双抱蘑菇同核原生质体的平均同核率
T a b l e 2 A v e
r a g e h o m o k a r y o t i z a t i o n
r a t e o f h o m o k a
r y o t i e p r o t o p l a s t o f A
.
b isP
o r u s
再生原生质体总数 同核原生质体数 平均同核率(% )
T o t a l n u m b
e r o f N u m b e r o f A
v e r a g e h o m o k a r y o t iz a t i o n
r e g e n e r a t e d p r o t o p la s t h o m o k a r y o t i e p or ot p l a s t r a t e (% )
27 2 3 3 20 1 1
.
7 5
4 食 用 菌 学 报 2卷
在分离同核原生质体的再生菌丝时发现 , 由于异核原生质体具有较高的萌发率和较快的
生长速度 , 再生培养基上首先出现的基本上都是异核体菌丝 , 其菌丝生长 比较旺盛 ; 2 一 3天后 ,
才陆续出现一些菌丝纤细的微小菌落 , 只有这些菌丝才有可能是同核体 . 因此在分离双抱蘑菇
同核原生质体时 . 应特别注意再生过程 中菌落出现时间和形态差异 .
同时还发现 , 在基本相同的试验条件下 . 不同菌株分离出的同核体比例有所不同 。 有的菌
株 (如A ,和 A 7 )较易获得 , 有的菌株 (如A , )则较困难 . 不同的菌丝形态对分离同核原生质体的影
响也不明显 . 如 A , 和 A : 分别属于气生型和甸甸型两种不同的菌丝形态类型 , 但均能得到较高
比例的同核原生质体 。 据此推测 , 同核体的再生和出现的 比例可能与菌株 自身的特性有关 .
2
.
2
.
2 双袍蘑菇回核原生质体的鉴定
2
.
2
. 乳 1 菌落形态上的差异 部分同核原生质体在 P D M A 培养基上菌丝体纤细 , 长势缓慢 ,
且只是有限的生长气有的同核体再生菌丝贴生 , 基内菌丝较多 , 菌落颜色往往呈暗褐色或淡黄
色 ; 有一的同核体再生菌丝呈绒毛气生状 , 菌丝颜色为粉红色 。 而它们的异核原生质体再生菌丝
长势一般都较强 , 有绒毛状气生 . 也有贴生甸甸状 , 基内菌丝一般都较深 , 菌落颜色较白 , 两种
类型韵原生质体再生菌落在形态上表现出明显的差异 。
不同菌丝形态的菌株 , 往往会出现相同形态的同核体再生菌丝 , 而同一菌株的同核体再生
菌株之问也会出现一些菌落形态上的差异 ,但这种差异相对较小 。
2
.
.2 2
.
2 菌牲生长速度 上的差异 研究结果表明 , 同核原生质体再生菌丝的生长速度明显慢
于异核原生质体 , 其中有少数同核原生质体再生菌丝生长速度极为缓慢 , 只相当于异核体再生
菌丝的 1;’6 左右 。 在气生型和甸甸型两种类型的菌株中都有相同的表现趋势 .
冬2 . .2 3 梭 甲基纤维素酶 (C x 酶 )相对活性的差异 两种菌丝形态的菌株中 , 异核体出发菌丝
以及异核原生质体再生菌丝的 C x 酶透明圈直径均大于同核原生质体再生菌丝 , 在同一菌株的
同核原尘听休再生菌丝群体中 , 透明圈直径也存在差异 , 这一趋势与菌丝生长量的差异是一致
的。 ’
2
.
2
.
2
,
4 结实能力上的差异 试验表明 , 经测试的同核原生质体都不能形成原基或子实体 , 而
异核体则 」!: 常出菇 , 证 明这些同核原生质体失去了育性 · 具有双抱蘑菇不育网核体的正常表
现 。
3 讨论
3
.
1 不育同核体是开展 双抱蘑菇杂交育种的基本材料 . 传统方法是从抱子群体中分离和筛
选 ,但同孩单抱在抱子群体中的比例较低 ,又 由于其萌发率较低 , 因此长期以来 , 不能大量稳定
地获得同核单抱是限制双抱蘑菇杂交育种工作开展的一个重要 因素 。 应用原生质体技术可以
较方便地在实验室条件下制备出大量的同核原生质体 , 大大缩短了获得不育同核体的时间 (同
核单抱需栽培 3 一 4个月才能得到 , 而 同核原生质体只需在实验室操作 1个月就可获得) 。 同时 ,
同核原生质体的主要遗传标记— 不育性明确且稳定 , 这为开展双抱蘑菇同核原生质体杂交创造 了有 利条件 。 另外 , 同 核原生质体是直接从菌 丝体获取的无性世代 , 不 同于 同核单
抱— 经过减数分裂后形成的有性世代 .这一特点在双抱蘑菇的育种中具有重要作用 .由于同核原生质体具有以上特点 , 国际上从 1 9 8 8年开始对这一材料进行了研究 〔 ” 。 我们从
九十年代初对这一技术进行跟踪 `使之更加深人 、 系统和完善 。
3期 马爱民等 :双袍蘑菇同核原生质体育种技术研究 1. 同核原生质体的分离与鉴定 5
3
.
2双抱蘑菇同核原生质体是在原生质体制备和再生过程中产生的 , 其原因可能与菌丝的生
理状况以及溶壁酶作用位点的不同有关 。 它与异核原生质体的一个重要差异是在核相上 ,前者
只有一种交配型的核 , 而后者具有两种交配型的核 。 这种核相上的差异 与育性有直接的关系 ,
并导致了两种类型的原生质体再生菌丝在菌落形态 、 生长速度 、 竣甲基纤维素酶活性上的明显
差异 。 在本研究中则利用这些差异作为鉴定同核体的主要标记 。
参 考 文 献
1 C h a n g S
.
T
. ,
M i le s P
.
G
.
E d i b l e m u s h r o o m s a n d t h e ir e u l t i v a t i o n
.
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R a t i o n
,
1 98 7
.
20() ~ 3 6 3
.
2 A n d e r s o n J
.
B
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D
,
M
.
P e t s e h e
,
F
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B
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H e r r e t a l
.
B r e e d i n g r e l a t i o n s h i p s a l 、 l o n g s c v e r a l s p e e i 。吕 o f
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.
C a n
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J
.
B o t
. ,
1 9 84
.
62 : 1 88 4 一 1 88 9 ,
3 E l li o t t T
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J
.
B r e e d in g s t r a t o g i e s i n A g a r i e u s b即 o r u s . M u s h r o o m s e i e n e e X (P a r t l ) , 1 97 8 .
7 3~ 8 1
.
4 F
r
i t s e h e F
.
B r e e d i n g A g a
:
i e u s b i印 o r u s a t t h e M u s h r o o m E x p e r im e n t a l S t a t i o n , H o r o t , T 卜。
M u s h r o o m J o u
r n a l
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1 98 3
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1 2 2 : 4 9一 5 3 .
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6 T e a t h e r R
.
M
.
U s e o f C o n g o r e d一 P o l y s a e e h a r i d e i n t e r a e t i o n s i n e n u m e r a t i o n a n d e h a r a e t o r i 2 `
t i o n o f e e l l u lo y t i e b a e t e r i a fr o m t h e b o v i n e ru m e n
.
A p P I
.
E n v i r
.
M i r e r o b io l
. ,
1 98 2
.
43 (4 )
.
7 77 ~ 7 80
.
7 S o n n e n b e r g A
.
S
. ,
J
.
G
.
W
e s s e l s & L
.
J
.
V a n G r r e n s v e n
.
A n e m e i e n t P r o t o p l a s t ing /
r e g e n e r a t i o n
s y s t e m fo
r A g a r i e u s b i s P o r u s a n d A g a r ie u s b i to r q u i s
.
C u r r
.
M i e r o b i o l
. ,
1 98 8
.
1 7 : 2 8 5 ~ 2 9 1
.
S t u d y o n H o m o k a
r y o t i e P r o t o p l a s t B r e e d i n g
T e e h n i q u e i n A g a r i e u s b i胡 o r u s
1
.
I s o l a t i o n a n d I d e n t i if e a t i o n o f H o m o k a r y o t i e
P r o t o P l a s t i n A g a r i e u s b i SP o r u s
M a A im i n H e D
o n g nr e i P a n Y i n gj i e
(L
a b o r a t o理 of G e n e t i e s a n d B er e d i n g of M u s h r o o m , A g r ie u l t u r a l M i n is `理 of C h i n a ,. E d i b l e F u鳍云
nI s t i t u t e
,
S h a gn h
a i A e a d e卿 of A g r ie u l t u r a l S e ie n e e s , S h a n g h a i 2 0 1 1 0 6 )
A b s t r a c t B a s c d o n t e s t i n g o f d i fe
r e n t e o m b i n a t i o n s a n d e o n e e n t r a t i o n o f l y s o z y m e s
, o s m o t i e
s t a b i l i z e r s a n d d i fo
r e n t m e t h o d s o f m y e e l iu m in e u b a t i o n
, a n e if e i e n t s y s t e m o f p
r o t o p l a s t
p r e P a r a t i o n a n d r e g e n e r a t i o n i n A g a r ie u s b乙名P o r u s w a s e s t a b l i s h e d i n p r e s e n t p a p e r . I t w a s P r o v e d
t h a t
a ft e r t h e m y e e l iu m b e i n g d i g e s t e d w i t h l
,
5% l y w a l lz y m e i n 0
.
6M K C I fo
r 4 h a t 2 5 ℃ , t h e
p r o t o p l a s t y i e l d r e a e h e d 1 0 , / m l
, a n d t h a t a f t c r t h e p u r i if e d p r o t o p l a s t s b e i n g i n e u b a t e d i n P D M A
m e d i u m w i t h 0 6 M s u e r o s e a s o s m o t i e s t a b i l i z e r fo
r
s一 7 d a y s a t 25 oC , t h e r e g e n e r a t io n r a t e w a s
o v e r i %
.
B a s e d o n d ife
r e n t r e g e n o r a t i o n t im e
, u s i n g t h e d ife
r e n e e o f e o lo n i a l m o r p h o l o g y
,
a e t i v i t y o f C x e n z y m e a n d fr u i t i n g a b i l i t y a s m a i n m a r k e r s fo
r id c n t i if e a t i o n o f h o m o k a r y o t i e
P r o t o p la s t
,
t h e h o m o k a yr
o t i e p
r o t o p l a s t s w e r e i s o l a t e d fr o m p r o t o p l a s t s o f 1 2 s t r a i n s w i t h a r a t e o f
2% t o 1 5%
, a v e r a g in g o u t a t 1 1
.
7 5%
.
K e y w o r d s A g a r i e u s b isP
o r u s ,. H o m o k a r y o t i e p r o t o p l a s t : I s o la t i o n a n d i d e n t i if e a t i o n