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采用同核体单孢杂交育种技术选育双孢蘑菇



全 文 :食用菌学报?2011.18(3):17~21
收稿日期:2011-06-21原稿;2011-08-20修改稿
基金项目:江苏省农业三项工程项目[编号:sx(2009)133]、连云港市农业科技成果示范计划项目(编号:SF0902)的
部分研究内容
作者简介:李冠喜(1970-),男,南京林业大学森林资源与环境学院在读博士研究生,副研究员,主要从事真菌学研
究。 E-mail:guanxili@163.com
文章编号:1005-9873(2011)03-0017-05
采用同核体单孢杂交育种技术选育双孢蘑菇
李冠喜1,2,华国栋2,王多明2,魏良志3
(1连云港市农业科学院,江苏连云港222006;2南京林业大学森林资源与环境学院,江苏南京210037;
3连云港市海州区新坝镇农业技术推广中心,江苏连云港222001)
摘 要:采用同核体单孢杂交育种技术,以低温高产的双1菌株和高温低产的双5菌株为亲本,选育双
孢蘑菇优良新品种。通过担孢子分离和同核体的鉴别,获得同核体菌株共20个,同核体间配对杂交组合
99个,获得10个杂交异核体菌株;经过菇房、出菇地棚栽培和出菇大棚生产性试验,筛选出高产优质杂
交菌株Z1。
关键词:双孢蘑菇;单孢杂交育种;杂交
  双孢蘑菇(Agaricus bisporus),又称双孢菇,
在分类学上隶属于真菌门(Eumycota)、担子菌纲
(Basidiomycetes)、伞菌目(Agaricales)、蘑菇科
(Agaricaceae)、蘑菇属(Agaricus),是世界广泛
栽培的食用菌[1,2],属于二极性次级同宗结合交
配型系统[3]。双孢蘑菇菌种选育技术经历了由
自然采种、纯培养、组织分离到多孢子分离和单
孢子杂交的过程[4,5],每种技术都曾经为其商业
性栽培选育了许多重要菌株。随着对双孢蘑菇
遗传规律的深入了解和生物技术的不断进步,同
核体不育单孢配对杂交已成为选育双孢蘑菇较
广泛的方法,1989年,福建省轻工业研究所王泽
生等通过杂交手段育成高产优质耐热的优良杂
交品种As2796系列菌株[6];2005年,四川农业大
学谢芝芳等[7]用同核体杂交技术育成了新品种
Ag25623菌株。但随着双孢蘑菇品种使用年限
的增加,原有的优良性状在逐步丧失,因此,迫切
需要进行品种更新。笔者以低温高产菌株双1
和耐高温菌株双5为亲本,采用同核体单孢杂交
育种技术选育新品种。
1 材料与方法
1.1 菌株
  双孢蘑菇(A.bisporus)双1为低温高产菌
株,双5为耐高温菌株,由华中农业大学菌种实
验中心引进,由连云港市农业科学院食用菌课
题组保存;对照 As2796为较耐高温菌株,国内
主栽品种,由江苏省高邮市科学食用菌研究所
引进。
1.2 培养基质
  加富PDA培养基(g/L):200马铃薯,50麸
皮,20葡萄糖,20琼脂,pH自然。
麦粒种培养基(%):88麦粒,10稻草粉,2石
膏,pH 7.5~8.0。
栽培培养料(kg/m2):20稻草,8.5干牛粪,
1.5油菜籽饼,0.3尿素,0.3磷酸二铵复合肥,
0.3过磷酸钙,0.5石灰,0.5石膏。
1.3 方法
1.3.1 孢子萌发与同核体菌株分离
  采集亲本菌株双1和双5的子实体,收集孢
子印,制作孢子悬浮液,梯度稀释,血球计数板测
各个梯度的浓度,选择合适浓度的悬浮液在平板
培养基上涂布,同时将培养皿反转,取适量生长
旺盛的双孢蘑菇菌丝体置于培养皿盖内,刺激孢
子萌发。
待孢子萌发形成微小星芒状单菌落时,挑取
单个菌落培养,观察菌落形态,淘汰生长速度快、
气生型、白色的菌株和生长速度特别慢,几乎不
生长的菌株,选择菌丝体生长速度慢、生长势弱,
紧贴培养基表面生长,菌丝体褐色的菌株,即为
食 用 菌 学 报 第18卷
初步鉴定的同核体[8]。
1.3.2 酯酶同工酶鉴定
  采用酯酶同工酶电泳对初步鉴定为同核体
的菌株进行鉴定。将菌株接种于PDA斜面,在
25℃恒温箱中培养14d,刮取表层菌丝体加适
量石英沙和等量研磨液(稀释4倍的 Tris-HCl
缓冲 液)置 于 -20 ℃ 冰 箱 中 预 冷 后 研 磨,
4500 g,4℃离心15min,取上清液于4℃冰箱
静置过夜。参照胡能书等[9]的方法采用垂直板
不连续聚丙烯酰胺凝胶进行电泳,分离胶浓度
12.5% (pH8.9),浓缩胶浓度4.4% (pH6.8),
点样量为30μL样品和蔗糖混合液,以溴酚兰
为前 沿 指 示 剂,指 示 剂 在 浓 缩 胶 中 时 电 压
180 V,进入分离胶后电压210 V,待指示剂迁
移至距胶板2 cm时停止电泳,迅速用乙酸-α萘
酯和坚牢蓝 RR盐丙酮溶液进行染色,水冲洗
后保存于7%乙酸中。
1.3.3 同核体配对杂交及杂交异核体菌株的
判定
  将两亲本同核体菌株接种在加富PDA斜面
培养基上,两两配对杂交,配对组合为双1×双5,
接种块两两间相距约2 cm,待两菌落接触后,挑
取接触处菌丝体转管培养。
观察转管培养的菌株,菌落交接处菌丝转化
为气生型或者半气生型、生长速度变快、长势强
者为杂交成功,挑取杂交成功的新生菌丝体转管
培养,以备菇房筛选之用。
1.3.4 异核体杂交菌株初筛
  栽培用培养料按参考文献[6]建堆发酵,移
入菇房内建立小区,小区面积为1 m2。播种麦粒
种,覆土,管理。以 As2796、双1和双5为对照,
每个菌株栽培3个小区,各个小区单独计算产
量,用水果硬度计/果实硬度检测仪(GY-3,浙江
托普仪器有限公司)测量子实体的平均硬度,游
标卡尺测量菌盖的平均直径和菌柄的平均长度,
并统计采收后常温(25℃)保存24 h后的开伞
率,并按1.3.2的方法对室内菇房筛选出的优良
菌株与亲本菌株进行酶带比对。
1.3.5 异核体杂交菌株复筛
  将菇房栽培选出的较优良杂交菌株,在海州
区新坝镇的出菇地棚进行栽培试验,统一条件,
统一管理。每个菌株栽培3个小区,每小区为
1 m2。以当地栽培品种 As2796为对照,观测各
菌株特征。
1.3.6 优良杂交菌株生产性试验
  选取优良杂交菌株在海州区新坝镇的出菇
大棚进行生产性试验。以 As2796为对照,每个
菌株试生产3000 m2。
2 结果与分析
2.1 同核体菌株分离、杂交及杂交异核体菌株
判定
  同核体菌株分离阶段挑取萌发的单菌落共
145个,培养,经菌落形态观察和酯酶同工酶电
泳鉴定,最后得到菌丝体生长速度较慢,紧贴培
养基表面生长的匍匐型、菌丝体红褐色的同核
体菌株共20个,其中双1的同核体11个,双5
的同核体9个。双1和双5的同核体两两配对
杂交组合共计99对,两同核体菌株的菌落相接
触后,配对组合中有26个接触处菌丝体表现为
白色、匍匐型转化为气生型或者半气生型、生长
速度变快,初步认定这26个为异核体菌丝。分
别挑取这26个菌丝体转管培养,淘汰12个生
长异常缓慢和4个死亡的菌株,最后获得10个
异核体菌株。
2.2 异核体杂交菌株初筛
  从表1可以看出,杂交菌株Z1、Z3、Z9子实
体白色,光滑无鳞片,菌盖大,菌柄很短,质地很
结实,不易开伞;Z2、Z5、Z6较不易开伞;Z4、Z7
菌盖偏小;Z8质地疏松,很容易开伞;Z10出菇前
期质地较结实,后期质地疏松、容易开伞。双孢
蘑菇杂交菌株菇房栽培的产量相差较大,Z1、Z3
和Z9菌株产量>2.5kg/m2,高出高产亲本双1;
Z2、Z5和Z6菌株产量在2.1~2.5kg/m2之间,
低于亲本双1但高于对照 As2796;有1个菌株
Z7在2.1~1.8kg/m2之间;有3个菌株低于1.5
kg,产量较低。有5个杂交菌株都比亲本双5增
产;有3个比高产亲本双1增产;有6个杂交菌株
比对照 As2796增产。综上,初步筛选出较优良
的杂交菌株为Z1、Z3、Z9。经酯酶同工酶电泳鉴
定,菌株Z1、Z3、Z9均含有不同于双亲的酶带。
2.3 异核体杂交菌株复筛
  出菇地棚栽培的子实体形态特征与菇房相
近,所有菌株子实体都是白色、光滑无鳞片,菌株
间菌盖和菌柄有差异,差异表现与菇房同。
81
第3期 李冠喜,等:采用同核体单孢杂交育种技术选育双孢蘑菇
表1 不同菌株的生物学特性
Table 1 Characteristics of fruit bodies produced by different Agaricus bisporus strains
菌株
Strain
菌盖直径
Pileus
diameter
(cm)
菌柄长度
Stipe
length(cm)
子实体颜色
Color of
fruit body
子实体有无鳞片
Presence of
scales on pileal
surface
1)硬度
1)Firmness
(kg/cm2)
2)开伞率
2)Pilei with
open veil(%)
产量
Yield
(kg/m2)
双1
Shuang 1
7.1±0.9  3.0±0.4 白
White
无No  10.8±1.0  10±3  2.51±0.02
双5
Shuang 5
3.9±0.5  6.6±0.6 灰白
Gray-white
少量Few  4.5±0.6  45±7  1.81±0.06
As2796  7.0±1.2  3.2±0.7 白 White 无No  11.2±1.2  12±4  2.09±0.02
Z1  7.2±0.5  2.9±0.3 白 White 无No  11.1±0.7  11±2  2.90±0.05
Z2  6.3±0.7  3.8±0.5
灰白
Gray-white
少量Few  10.7±0.8  16±4  2.53±0.01
Z3  7.0±0.8  3.1±0.4 白 White 无No  10.8±1.2  13±3  2.64±0.09
Z4  3.8±0.6  4.3±0.4
灰白
Gray-white
少量Few  5.4±0.5  29±5  1.69±0.09
Z5  6.0±0.9  3.7±0.6 白 White 无No  10.5±0.9  15±4  2.38±0.01
Z6  6.2±0.5  3.8±0.5
灰白
Gray-white
无No  10.2±0.7  18±4  2.19±0.02
Z7  4.0±0.6  4.5±0.5 白 White 无No  6.8±0.5  26±5  1.93±0.06
Z8  4.2±0.7  6.4±0.7 白 White 少量Few  4.4±0.5  49±7  1.20±0.11
Z9  7.0±1.0  3.1±0.6 白 White 无No  10.9±1.0  16±3  2.62±0.12
Z10  6.4±0.8  6.5±0.6
灰白
Gray-white
无No  4.0±0.4  40±6  0.92±0.08
双1、双5为亲本,A s2796为对照。1)菌盖和菌柄的平均值;2)在25℃保存24h
Shuang 1and Shuang 5:Parental strains;A s2796:Control.1)Average of cap and stipe values;2)After 24storage at 25℃
  从图1可看出,Z1菌株的产量显著地高于
其它3个菌株,Z3菌株的产量显著高于对照
As2796,但与Z9菌株的产量差异不显著,Z9菌
株的产量与对照As2796差异不显著。
综合菇房和出菇地棚2次小区的栽培筛选
结果,初步确定产量较高、质量较好的Z1为双孢
蘑菇优良杂交菌株。
图1 杂交菌株出菇地棚栽培产量
Fig.1 Yields of second-cycle hybrid strains after
cultivation in 3m2field plots
2.4 优良异核体菌株生产性试验
  从图2可以看出,菌株Z1的大棚产量显著
地高于其他 2 个菌株,较对照 As2796 增产
15.2%;Z3的产量高于对照 As2796但差异不显
著,仅增产4.2%,因此选取Z1杂交菌株为高产、
优质的新品种,Z1菌株子实体白色,紧密,菌盖圆
形、光滑,菌柄短而粗壮,不易破膜开伞,比对照
As2796菌株增产15.2%。
图2 双孢蘑菇优良菌株大棚生产性试验的产量
Fig.2 Yields of three Agaricus bisporus strains
cultivated in the greenhouse
91
食 用 菌 学 报 第18卷
3 讨论
  双孢蘑菇属于二级性次级同宗结合的单因
子交配型系统,它有两个很明显的性特征[10]:第
一,它的担子上通常只形成2个担孢子而不是4
个,偶尔出现有3孢或4孢的变种;第二,它的营
养菌丝体不形成锁状联合,一个细胞中一般不只
两个核而是多核。因此,给双孢蘑菇育种工作带
来两个很大的困难,其一,难以获得杂交所需材
料的同核体,双孢蘑菇减数分裂,产生的4个单
倍体核有非姐妹核随机进入同一个担抱子的倾
向,由此,一个孢子接收异核体的概率将是接收
同核体概率的两倍,而同核体由于缺失一部分执
行正常生命功能的基因,不易萌发,萌发后的菌
丝体生长弱、缓慢,这就导致获得同核体很困难;
其二,缺乏标记,双孢蘑菇菌丝体没有锁状联合,
无论同核体还是异核体,细胞核都呈数量不等的
多个,这就给杂交之前同核体的鉴定造成困难,
也给杂交后异核体的鉴定带来困难。利用酯酶
同工酶技术鉴定同核体和异核体,或利用异核体
自身可孕而同核体自身不孕的特点为标记鉴定
同核体菌株,利用杂交亲和后形成的异核体菌株
恢复可育性为标记鉴定杂交是否成功,这在方法
上是可行的,但都存在工作量巨大,费时费力等
缺点,因此,寻找简便高效的标记方法仍然是双
菇蘑菇育种工作者不懈努力的一个方向[11]。
双孢蘑菇的孢子极不容易萌发,若以显微操
作直接挑取单个孢子培养则更不容易萌发,制作
成孢子悬浮液涂布在平板上,也不易萌发[12]。本
试验采用玻璃瓶中正生长旺盛的双孢蘑菇母种
菌丝体来刺激,效果显著,采用菌丝体刺激处理
的培养皿培养7~8d培养基表面就形成许多星
芒状菌落,而未采用菌丝体刺激的对照12d后仍
然萌发极少。至于生长的双孢蘑菇菌丝体为何
能够刺激孢子的萌发,推测可能是生长的菌丝体
能产生某种挥发性的信号分子诱导孢子萌发,但
该信号分子具体是什么以及它是如何起作用的,
还有待于进一步研究。
农民试种的过程中发现Z3菌株耐夏季高
温,应该为很有潜力的高温品种,但还需要进一
步验证。
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02
第3期 李冠喜,等:采用同核体单孢杂交育种技术选育双孢蘑菇
Agaricus bisporus Cross-breedingUsing
Monokaryotic Single-spore Isolates
LI Guanxi 1,2,HUA Guodong2,WANG Duoming2,WEI Liangzhi 3
(1 Lianyungang City Academy of Agricultural Sciences,Lianyungang,Jiangsu 222006,China;
2 Colege of Forest Resources and Environment,Nanjing Forestry University,Nanjing,Jiangsu 210037,China;
3 Xinba Town Agricultural Technology Generalization Center of Haizhou District,Lianyungang,Jiangsu 222001,China)
Abstract:Monokaryotic single-spore isolates obtained from the high yield Shuang 1strain and the low yield,
high temperature Shuang 5strain of Agaricus bisporus were used for breeding new high yielding,elevated
temperature tolerant hybrids.Ninety-nine pairings were obtained from 20monokaryotic spore isolates(11
from Shuang 1and nine from Shuang 5,identified on the basis of isozyme profiles),and ten dikaryotic
hybrids were obtained.After three cultivation cycles(carried out on a laboratory-scale,in 3m2field plots,
and in the greenhouse),two strains designated Z1and Z3were selected on the basis of increased yield and
increased yield combined with high temperature tolerance,respectively.The potential of strains Z1and Z3
was demonstrated by cultivating both hybrids on a commercial scale.
Key words:Agaricus bisporus;cross-breeding using single spore isolates;hybridization
[本文编辑] 马丹丹
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