全 文 ：2014 第十六卷 第五期 ★Vol.16 No.5
〔World Science and Technology/Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica〕
收稿日期：2014-04-29
修回日期：2014-05-19
＊ 科学技术部国家国际科技合作项目（2010DFB33260）：中医药干预胰岛素抵抗创新中药研究，负责人：徐暾海。
＊＊ 通讯作者：徐暾海，教授，博士生导师，主要研究方向：中药活性成分及质量控制研究研究。
HPLC法同时测定蒺藜茎叶中3个
黄酮醇苷的含量＊
桂海水，刘铜华，秦灵灵，李朋收，李春娜，刘洋洋，徐暾海＊＊
（北京中医药大学中药学院 北京 100102）
摘 要：目的：建立 HPLC法同时测定蒺藜茎叶中含量较高的 3个黄酮醇苷类化合物的含量。方法：色谱
柱：Thermo Syncronis C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：水（A）-乙腈（B），梯度洗脱，0~30 min，8%~27% B；
检测波长：254 nm；柱温：40℃；流速：1.0 mL·min-1；进样量：20 μL。结果：异鼠李素-3-O-β-D-龙胆双糖基-7-
O-β-D-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-β-D-龙胆双糖苷、异鼠李素-3-O-β-D-龙胆双糖苷分别在 0.011 2~0.280 0
μg（r=0.999 6）、0.064 8~2.592 0 μg（r=0.999 8）、0.018 4~0.460 0 μg（r=0.999 8）范围内线性关系良好；平均加
样回收率（n=9）分别为 100.15%（RSD=1.32%）、100.02%（RSD=1.14%）、99.77%（RSD=1.16%）。结论：该方法简
便、快速、准确、灵敏，为蒺藜或其制剂的质量控制和综合评价提供参考。
关键词：蒺藜茎叶 黄酮醇苷 HPLC 含量测定
doi: 10.11842/wst.2014.05.019 中图分类号：R284.1 文献标识码：A
蒺藜（Tribulus terrestris L.）为蒺藜科（Zygophy－
laceae）蒺藜属（Tribulus）植物。蒺藜茎叶又名蒺藜
苗，始载于《本草纲目》，具有祛风、消肿作用，主治
痈肿，疥癣，风痒，鼻塞等。蒺藜主要含有皂苷、黄
酮、生物碱和多糖类等化合物。现代药理研究表明，
甾体皂苷和黄酮类成分为其主要活性成分，具有改
善心脑血管、降血糖、增强性功能、抗衰老、抗肿癌
等药理活性[1~3]。
目前，对于蒺藜的研究主要集中在甾体皂苷类
成分，而其黄酮类成分研究甚少。国内学者研究发
现，蒺藜主要黄酮类成分的含量是主要皂苷类成分
的 1.5 倍 [4]，且在心脑血管方面同样具有良好的作
用 [5~8]。蒺藜已被广泛用于临床制剂中，但有关其含
量测定，尤其是黄酮类研究甚少。经查阅文献发现，
在目前发表的有关蒺藜黄酮类成分含量测定的文
献中 [4,5, 9~11]，除 1 篇以芦丁作为对照品外，其他均以
3 种主要的黄酮水解苷元——槲皮素、山奈酚和异
鼠李素为测定指标，而未见以从蒺藜中提取的黄酮
类单体化合物作为指标进行测定。临床及其药理研究
表明，蒺藜总黄酮具有耐缺氧、增加冠脉血流量 [7]，抑
制血小板聚集和黏附作用 [6]。因此，进一步研究蒺藜
主要黄酮类有效成分的含量测定，对其质量控制及
其药理研究具有重要意义。本研究以自蒺藜茎叶中
分离到的 3 个含量较高且具有代表性的黄酮醇苷，
即异鼠李素-3-O-β-D-龙胆双糖基-7-O-β-D-葡
萄糖苷、槲皮素-3-O-β-D-龙胆双糖苷及异鼠李
素-3-O-β-D-龙胆双糖苷，建立 HPLC 法同时测定
上述 3 种黄酮醇苷含量的方法，为蒺藜或其制剂的
质量控制提供参考。
1 仪器与试药
岛津 LC-15C 高效液相色谱仪配备四元泵、恒
温柱箱、DAD 检测器、LC solution 工作站（日本岛津
公司），FW177 型中药粉碎机（天津市泰斯特仪器有
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限公司），Millipore-Q 超纯水制备仪（法国密理博公
司），电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限
公司），KQ-400KDB 型高功率数控超声波清洗器
（昆山市超声仪器有限公司），ZF-8 型四用紫外分
析仪（上海嘉鹏科技有限公司），JH3102 型电子天平
（上海精密科学仪器有限公司），赛多利斯 R200D 电
子天平（德国赛多利斯公司）。
对照品异鼠李素-3-O-β-D-龙胆双糖基-7-
O-β-D-葡萄糖苷（I）、槲皮素-3-O-β-D-龙胆双糖
苷（II）及异鼠李素-3-O-β-D-龙胆双糖苷（III）（自
制，通过 UV、NMR、ESI-MS 鉴定，HPLC 纯度均不低
于 99%）符合定量要求。乙腈（色谱纯，美国 Fisher
Scientific 公司），水为 Millipore-Q 制超纯水，其他试
剂均为分析纯。蒺藜茎叶药材购于陕西、吉林及内
蒙古通辽等，经北京中医药大学中药博物馆马泽新
主任鉴定为蒺藜（Tribulus terrestris L.）的干燥茎叶。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
Thermo Syncronis C18 色谱柱（250 mm×4.6 mm，
5 μm）；流动相为水（A）-乙腈（B），梯度洗脱，0~30
min，8%~27% B；检测波
长 254 nm，柱温 40℃，流
速 1.0 mL·min-1，进样量
20 μL。
2.2 对照品溶液的制备
取对照品 I、II、III 各
适量，精密称定，分别置
于 25 mL 容量瓶中，加
甲醇溶解并定容，摇匀，
制成含对照品 I、II、III 浓
度 分 别 为 56.0、324.0、
92.0 μg·mL -1 的单一成
分对照品储备液，摇匀。
再精密吸取上述对照品
溶液各 0.1 mL，置 10 mL
量瓶中，加甲醇稀释至刻
度，摇匀，作为混合对照
品溶液。
2.3 供试品溶液的制备
药材粉碎，过 60 目
筛，精密称取干燥至恒重
的样品粉末 1.0 g，置 50 mL 具塞锥形瓶中，加 30
mL 甲醇，摇匀，称重，超声处理（功率 400 W，频率
40 kHz）30 min，再称重，以甲醇补足减失的重量，摇
匀，用 0.45 μm 微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。
2.4 系统适用性试验
精密吸取对照品溶液和供试品溶液各 20 μL，
按“2.1”项下色谱条件依次进行测定，记录色谱图。
在对照品溶液和供试品溶液色谱图相应位置上，有
相同的保留时间和色谱峰，且 3 个成分与相邻峰的
分离度均大于 1.5，且无干扰。结果见图 1。
2.5 线性关系考察
分别精密量取对照品溶液 I（0.1、0.5、1.0、1.5、
2.0、2.5 mL）、II（0.1、0.8、1.5、2.0、3.0、4.0 mL）、III
（0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL）于不同 10 mL 量瓶
中，加甲醇稀释至刻度。分别精密吸取上述稀释液
各 20 μL，注入液相色谱仪，按“2.1”项下色谱条件
依次进行测定，记录峰面积。以峰面积值（Y）对质量
浓度（X，μg·mL-1）进行线性回归分析，结果见表 1。
2.6 精密度试验
精密吸取对照品混合溶液 20 μL，按“2.1”项下
色谱条件，重复进样 6 次，记录峰面积。结果显示，
图 1 对照品（A）和样品（B）的 HPLC 图
注：I. 异鼠李素-3-O-β-D-龙胆双糖-7-O-β-D-葡萄糖苷，II. 槲皮素-3-O-β-D-龙胆双糖苷，
III. 异鼠李素-3-O-β-D-龙胆双糖苷。
0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5
0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5
A
B
Ⅰ
Ⅱ
Ⅲ
Ⅰ
Ⅱ
Ⅲ
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对照品 I~III 峰面积的 RSD 分别为 1.09%、1.69%、
0.98%，表明仪器精密度良好。
2.7 稳定性试验
精密吸取同一供试品溶液，室温下放置，分别
于 0、2、4、8、12、24 h，按“2.1”项下色谱条件下进行
分析。测得异鼠李素-3-O-β-D-龙胆双糖基-7-O-
β-D-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-
β-D-龙胆双糖苷及异鼠李素-
3-O-β-D-龙胆双糖苷的峰面
积 RSD 分别为 1.48%、1.60%、
1.98%，表明供试品溶液在 24
h 内稳定性良好。
2.8 重复性试验
精密称取同一批蒺藜茎叶
样品 6 份，按“2.3”项下方法制
备供试品溶液，按“2.1”项下色
谱条件进行分析，记录峰面积，
计算含量。结果显示，异鼠李
素-3-O-β-D-龙胆双糖 -7 -
O-β-D-葡萄糖苷、槲皮素-3-
O-β-D-龙胆双糖苷及异鼠李
素-3-O-β-D-龙胆双糖苷的
平均含量分别为 67.94、720.73、
150.74 μg·g -1；RSD 分 别 为
1.38%、1.60%、2.03%，表明该
方法重复性良好。
2.9 回收率试验
取已知含量的蒺藜茎叶粉
末 9 份，每份约 1 g，精密称
定，分 3 组，分别加入对照品 I
溶液 1.46、1.21、0.97 mL，对照
品 II 溶液 2.67、2.23、1.78 mL
及对照品 III 溶液 1.97、1.64、
1.31 mL，分别按“2.3”项下方
法制备供试品溶液，按“2.1”项
下色谱条件进行分析，结果见
表 2 。
2.10 含量测定
分别取不同产地的蒺藜茎
叶样品粉末 1.0 g，分别按
“2.3”项下方法制备供试品溶
液，按“2.1”项下色谱条件进行
分析。以峰面积按外标法计算不同产地蒺藜茎叶
药材中对照品 I~III 的含量，结果见表 3。
3 讨论
3.1 流动相的选择
本实验首先考察了不同梯度的甲醇-水系统，
表 1 对照品 I~III 线性关系及线性范围（n=6）
对照品 回归方程 r 线性范围/μg·mL-1
I Y=21 388X-2 087.8 0.999 6 0.56~14.00
II Y=34 596X-37 335 0.999 8 3.24~129.60
III Y=50 667X+10 439 0.999 8 0.92~23.00
表 2 蒺藜茎叶中 3 个黄酮醇苷的加样回收率试验（n=6）
成分 称样量/g 样品中量/μg 加入量/μg 测得量/μg 回收率/% 平均回收率/% RSD/%
I 1.001 5 68.04 81.76 152.07 101.52 100.15 1.32
1.001 8 68.06 81.76 147.63 98.54
1.001 1 68.01 81.76 150.50 100.48
1.001 4 68.04 67.76 136.82 100.76
1.002 1 68.08 67.76 133.54 98.31
1.001 6 68.05 67.76 137.78 101.45
1.001 3 68.03 54.32 123.44 100.89
1.001 9 68.07 54.32 123.55 100.95
1.002 2 68.09 54.32 120.56 98.49
II 1.001 5 721.81 865.08 1 604.13 101.09 100.02 1.14
1.001 8 722.03 865.08 1 575.01 99.24
1.001 1 721.52 865.08 1 591.04 100.28
1.001 4 721.74 722.52 1 463.94 101.36
1.002 1 722.24 722.52 1 450.42 100.39
1.001 6 721.88 722.52 1 414.45 97.93
1.001 3 721.67 576.72 1 311.89 101.04
1.001 9 722.10 576.72 1 298.40 99.97
1.002 2 722.32 576.72 1 284.87 98.91
III 1.001 5 150.97 181.24 331.19 99.69 99.77 1.16
1.001 8 151.01 181.24 336.16 101.18
1.001 1 150.91 181.24 330.64 99.55
1.001 4 150.95 150.88 297.23 98.48
1.002 1 151.06 150.88 297.23 98.44
1.001 6 150.98 150.88 300.17 99.44
1.001 3 150.94 120.52 268.76 99.01
1.001 9 151.03 120.52 272.36 100.30
1.002 2 151.07 120.52 276.57 101.83
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结果发现，0~30 min，20%甲醇线性变为 60%甲醇
对样品中的组分实现较好分离。为改善基线飘移，
进一步提高分离效果，本实验将有机相甲醇换成
乙腈，0~30 min，10%乙腈线性变为 30%乙腈，结
果样品出峰时间变短，但分离度及峰形无明显变
化。进一步调整色谱条件，0~30 min，8%乙腈线性
变为 27%乙腈，出峰时间变短，且峰形对称、尖
锐，柱效提高，各组分之间完全达到基线分离。在
此基础上加酸或缓冲盐，峰形无明显变化。因此，
最终选择色谱条件为 0~30 min，8%乙腈线性变为
27%乙腈。
3.2 提取方法的选择
实验中采取超声波提取制备样品，在提取溶
剂的考察中，结合文献 [ 4，9~11]及预实验初步选择了
甲醇及 95%乙醇，结果发现 95%乙醇的提取率不
及甲醇。同时考察了甲醇用量（30 mL、50 mL），结
果 30 mL 即可提取完全，50 mL 亦可以提取完全，
但样品进样浓度太低。随后又考查了甲醇与石油
醚脱脂后再甲醇提取，结果表明两者无显著性变
化。超声时间考查了 30 min、1 h、1.5 h，结果发现
1 h 提取率比 30 min 提取率稍高，1 h 与 1.5 h 无
明显变化。综上，并考虑到提取方法的简便、快速
及准确前提下，最终选择 30 mL 甲醇超声提取 30
min，1 次。
3.3 样品的测定
实验结果表明不同产地
蒺藜茎叶中 3 个黄酮醇苷含
量均差别很大，内蒙古药材中
化合物 II 的含量明显高于其
它地区的含量。对于 3个黄酮
醇苷，可以看出虽然产地不同，
但化合物 II含量均明显高于其
它两种黄酮醇苷类化合物，且与文献[5]报道的一致，即
蒺藜中以槲皮素为母核的黄酮类成分含量最高。
参考文献
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表 3 不同产地蒺藜茎叶 I~III 的含量（n=2）
样品 I/μg·g-1 II/μg·g-1 III/μg·g-1
陕西 1 15.85 326.22 79.32
陕西 2 60.93 711.62 159.72
吉 林 86.17 866.11 234.45
内蒙古 61.47 3 342.54 242.70
Simultaneous Determination of Three Flavonol Glycosides in the Stems and Leaves of
Tribulus terrestris L. by HPLC
Gui Haishui, Liu Tonghua, Qin Lingling, Li Pengshou, Li Chunna, Liu Yangyang, Xu Tunhai
(School of Chinese Pharmacy Beijing university of Chinese Medicine, Beijing 100102, China)
Abstract: In this paper, three higher content of flavonol glycosides from the stems and leaves of Tribulus terrestris
L. were determined by reversed phase HPLC. The results showed that there was good liner relationship between the
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（责任编辑：李沙沙 张志华，责任译审：龚 宇）
peak areas and the sample concentration at the ranges of 0.011 2~0.280 0 μg (r=0.999 6), 0.064 8~2.592 0 μg (r=
0.999 8) and 0.018 4~0.460 0 μg (r=0.999 8) for isorhamnetin-3-O-β-D-gentiobioside-7-O-β-D-glucoside,
quercetin-3-O-β-D-gentiobioside and isorhamnetin-3-O-β-D-gentiobioside respectively. The verage recovery rates
(n=9) of three flavonol glycosides compounds were 100.15% (RSD=1.32%), 100.02% (RSD=1.14%), 99.77% (RSD=
1.16%), respectively. This method is considered to be simple, accurate, stable, good precision and reproducibility,
which is available for the quality control and evaluation of T. terrestris L.
Keywords: Tribulus terrestris L., stems and leaves, flavonoids, HPLC, content determination
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