全 文 ：食品与发酵工业 FOOD AND FEＲMENTATION INDUSTＲIES
96 2016 Vol. 42 No. 7 (Total 343)
DOI:10． 13995 / j． cnki． 11 － 1802 / ts． 201607017
绿藻硫酸鼠李聚糖酶性质研究
李国霞1，沈照鹏2，3，江晓路1，3*
1(中国海洋大学 食品科学与工程学院，山东 青岛，266003)
2(中国海洋大学 医药学院，山东 青岛，266003)3(青岛海洋生物医药研究院，山东 青岛，266071)
摘 要 以绿藻硫酸鼠李聚糖为碳源，从青岛海域中筛选到 1 株可分泌绿藻硫酸鼠李聚糖酶的菌株 SC127，通
过硫酸铵沉淀、Q-Sepharose Fast Flow离子交换层析和 Sephadex G-100 凝胶过滤层析等方法对其所产酶进行了分
离纯化，并对纯化后的硫酸鼠李聚糖酶性质作了初步研究。研究结果显示:SC127 菌株属于假交替单胞菌属
(Pseudoalteromonas)，所产硫酸鼠李聚糖酶经分离纯化后由 SDS-PAGE电泳检验呈单一条带，测得其分子质量为
110. 6 kDa，此酶最适温度为 38 ℃，最适 pH为 8，且适用于较广的温度与 pH 范围。对酶解产物分析表明:该硫
酸鼠李聚糖酶可降解硫酸鼠李聚糖得到以聚合度 4 为主的硫酸鼠李寡糖。
关键词 硫酸鼠李聚糖酶;分离纯化;酶学性质;降解产物
第一作者:硕士研究生(江晓路教授为通讯作者，E-mail:jiangxl
@ ouc． edu． cn)。
基金项目:国家自然科学基金:海洋药物与生物制品研究方向
五:海洋创新药物研究开发海洋生物制品研究(U1406402-5);
山东省科技攻关:基于海藻工具酶分子动力学的褐藻胶精深加
工关键技术(2015GSF115002)
收稿日期:2016 － 01 － 28，改回日期:2016 － 02 － 22
海藻多糖是海藻主要的组成成分也是其重要的
活性成分，占海藻干重的 50%以上［1］。绿藻作为常
见的 3 类大型海藻之一，其多糖组分和结构随着绿藻
种类的不同而不同，其中石莼、礁膜与浒苔同属石莼
目，其水溶性多糖均主要为硫酸鼠李聚糖，这 3 种大
型绿藻分布海域较广，在资源上具有一定的优势［2］。
硫酸鼠李聚糖是一种高分子量的硫酸杂多糖，主要由
鼠李糖及鼠李糖硫酸酯组成，另外还含有葡萄糖、木
糖、半乳糖、甘露糖、糖醛酸等，研究表明硫酸鼠李聚
糖具有抗肿瘤、抗病毒、抗凝血、降血糖血脂、抗氧化
等功效［2 － 3］，但因其分子质量巨大，分子质量分布从
几万到百万不等，严重影响了吸收效率;同时其具有
一定的黏性，也大大阻碍了它作为药物的应用。目前
绿藻硫酸鼠李寡糖活性的研究相对较少，WU 等［4 － 5］
研究经酶降解后绿藻寡糖的抗氧化活性时发现礁膜
寡糖具有很高的过氧化氢消除能力和还原能力;许莉
莉［6］对浒苔多糖进行了酶法降解，发现经酶解后，浒
苔寡糖对 DPPH、·OH以及 O －2 ·的清除率较未酶解
的浒苔多糖明显增加。LUV 等［7］研究发现，浒苔寡
糖与硒化浒苔寡糖对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌以及
植物病原真菌均有一定的抑制作用。目前获得寡糖
的方法通常有氧化降解、酶降解以及酸降解法等，其
中酶降解法具有条件温和、专一性高、且对多糖的活
性基团破坏小等优点［8 － 9］，是获得高活性绿藻硫酸鼠
李寡糖的最佳选择。
本研究通过底物专一性定向筛选产硫酸鼠李聚
糖酶的菌株，并对酶进行了分离纯化，研究了硫酸鼠
李聚糖酶的部分酶学性质，且研究证明利用该酶可降
解得到以聚合度 4 为主的硫酸鼠李寡糖片断，为深入
研究绿藻硫酸鼠李寡糖结构及活性提供了技术支撑，
对开发海洋活性物质和海洋食药用资源具有重要
意义。
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 原料
硫酸鼠李聚糖(来源于石莼原料)由中国海洋大
学食品科学与工程学院应用微生物学实验室提供，腐
烂海藻样品，海泥，鲍鱼内脏采于山东青岛。
1. 1. 2 培养基
初筛培养基:硫酸鼠李聚糖 0. 5%、NaCl 1%、蛋
白胨 0. 3%、酵母膏 0. 1%、MgSO4 0. 05%、K2HPO4
0. 15%、琼脂 1. 5%，pH 7。
复筛培养基与产酶培养基:硫酸鼠李聚糖
0. 5%、NaCl 1%、蛋白胨 0. 3%、酵母膏 0. 1%、MgSO4
0. 05%、K2HPO4 0. 15%，pH 7。
1. 1. 3 试剂
NaCl，KCl，MgSO4，K2HPO4，KCl 等均为分析纯;
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DNS 试剂［10］等。
1. 2 方法
1. 2. 1 菌种筛选与 16S rDNA鉴定
菌种筛选:用接种环分别挑取少量腐烂的海藻、
海泥以及鲍鱼内脏样品，在初筛平板培养基上进行划
线，24 ℃培养 24 h，挑取生长良好且滴加稀碘液出现
较大透明圈的菌落，在初筛平板培养基上划线获得纯
培养，进行摇瓶复筛，筛选出硫酸鼠李聚糖酶活力高
的菌株［11］。
菌株的 16S rDNA 鉴定采用李丽妍［13］的方法，
PCＲ扩增产物通过 1%琼脂糖凝胶电泳检测其纯度。
1. 2. 2 硫酸鼠李聚糖酶活定义
在 38 ℃，pH 8. 0 的条件下每分钟降解硫酸鼠李
聚糖产生 1 μmol 还原糖(以鼠李糖计)所需要的酶
量定义为 1 个酶活力单位(U)。
1. 2. 3 硫酸鼠李聚糖降解酶的分离纯化
以上述产酶培养基为基础培养基，接种摇瓶后
24 ℃培养 48 h 后，发酵液于 4 ℃，8 000 r /min，离心
10 min，取上清液，采用硫酸铵沉淀的方法得到粗酶，
用等体积的蒸馏水将沉淀复溶，并经超滤脱盐浓缩后
得到粗酶液，进行酶的分离纯化。
将透过 0. 22 μm 微孔滤膜的浓缩粗酶液上样于
Q-Sepharose Fast Flow 离子交换柱，洗脱液为含有
NaCl(0 ～ 1 mol /L)的 20 mmol /L PBS(pH 8. 0)缓冲
液，进行梯度洗脱，流速为 1 mL /min，收集洗脱液，在
280 nm下检测蛋白峰，DNS法测定洗脱液的酶活力，
将有活性的部分合并，进行下一步纯化。
将 Q-Sepharose F. F 部分纯化后的活性蛋白浓
缩后上样于 Sephadex G-100(Φ 1 cm × 100 cm)凝胶
柱，洗脱液为的 20 mmol /L PBS(pH 8. 0)缓冲液，在
280 nm下检测蛋白峰，DNS 法测定对应蛋白峰部分
的洗脱液的酶活力，将有活性的部分合并。
用 SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)技术检验
酶分离纯化效果以及确定硫酸鼠李聚糖酶的分子量。
1. 2. 4 硫酸鼠李聚糖酶降解产物
利用分离纯化后的硫酸鼠李聚糖酶对硫酸鼠李
聚糖进行降解，产物经沉淀复溶，分离纯化后，取少量
硫酸鼠李寡糖用乙腈溶解，进行电喷雾电离质谱
(ESI-MS )分析，采用阴离子模式。
1. 2. 5 酶性质的研究
收集足够多电泳纯度的硫酸鼠李聚糖酶溶液，对
其最适温度、最适 pH、稳定性等性质进行研究。
2 结果与分析
2. 1 产硫酸鼠李聚糖酶菌株筛选及鉴定结果
通过平板初筛与摇瓶复筛，从腐烂海藻样品中得
到 1 株有产硫酸鼠李聚糖酶能力的菌株，将其命名为
SC127，确定为产硫酸鼠李聚糖酶菌株。
对 SC127 菌株进行 16S rDNA 鉴定，获得 1441
个碱基的保守序列片断，与 GenBank 数据库中已有
的基因序列进行 BLAST 比对，发现该菌株序列与假
交替单胞菌(Pseudoalteromonas)同源性达 99%，利用
软件对菌株 SC127 进行同源序列比对并绘制进化
树，结果如图 1 所示。
图1 根据16S rDNA基因序列构建的 SC127
菌株的系统发育树
Fig. 1 The evolutional tree of Pseudoalteromonas sp. SC127
and representative strains
2. 2 硫酸鼠李聚糖酶的分离纯化
2. 2. 1 Q-Sepharose Fast Flow离子交换层析
如图 2 所示，第 1 个蛋白峰为未挂柱的杂蛋白，
峰面积最大。开始洗脱后，随着盐浓度的增加，洗脱
出两个较小的蛋白峰，通过测定收集的洗脱液的酶活
力，可以确定只有 1 个峰有酶活力。因此确定酶蛋白
分布在第 2 峰对应的管里，收集第 2 个峰对应管的溶
液，作为进一步纯化的样品。
图 2 Q-Sepharose F. F离子交换色谱图
Fig. 2 Purification of degradase by Q-Sepharose
F. F column chromatography
2. 2. 2 Sephadex G-100 凝胶过滤层析
通过离子交换层析收集有活力的部分，经过超
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滤浓缩后上样于 Sephadex G-100 凝胶柱，结果如图
3 所示，共出现 2 个峰，说明离子交换层析分离效果
良好。分别测定各蛋白峰的酶活力，发现只有第 21
管至 30 管有酶活，并且酶活峰和蛋白峰吻合，说明
酶蛋白仅分布在这 10 管里，酶蛋白得到了很好的
分离。
图 3 Sephadex G-100 凝胶色谱图
Fig. 3 Purification of degradase by Sephadex G-100
column chromatography
2. 2. 3 SDS-PAGE电泳
由图 4 可知，经过分离纯化后，几乎所有的杂蛋
白已经去除，可收集得到纯度很高的硫酸鼠李聚糖酶
液，对比菌株 Pseudoalteromonas sp. SC127 所产酶蛋
白的相对迁移距离与已知相对分子质量标准蛋白
(Marker)的相对迁移距离可计算出此酶分子质量约
为 110. 6 kDa。
图 4 SDS-PAGE结果
Fig. 4 Ｒesult of SDS-PAGE
2. 3 硫酸鼠李聚糖酶降解产物
如图 5 所示，在绿藻硫酸鼠李聚糖酶的作用下，
大分子的硫酸鼠李聚糖降解生成了小分子的硫酸鼠
李寡糖。经阴离子电喷雾电离质谱测得酶解所得硫
酸鼠李寡糖的分子质量分布基本 ＜ 1 000 Da，且以聚
合度 4 为主。
图 5 硫酸鼠李寡糖的 ESI-MS谱图
Fig. 5 ESI-MS spectrum of oligosaccharide
2. 4 酶性质的研究
2. 4. 1 硫酸鼠李聚糖酶的最适温度及其对温度的稳
定性
在 25 ～ 38 ℃范围内，硫酸鼠李聚糖酶的酶活力
随着温度的升高而升高，当温度超过 40 ℃，酶活力明
显下降，当温度升到 55 ℃ 时，相对酶活力仅有
28. 3%(图 6)。酶的最适温度为 38 ℃。该酶的温度
稳定性试验结果表明，在 30 ～ 38 ℃，保温 60 min 后
酶活仍能保持在 80% 以上，其中 30 ℃保温 300 min
后，酶活可以保持在 95%以上，42 ℃下保存，该酶失
活较快，60 min 后已基本失活(图 7)。
2. 4. 2 酶的最适 pH及其对 pH的稳定性
由图 8 可知，在 pH5 ～ 10 的条件下，SC127 所
产硫酸鼠李聚糖酶均有一定酶活，且在弱碱性环境
下酶活较高，其中 pH 为 8 时，酶活达到最高。当
pH为 10 时，硫酸鼠李聚糖酶的相对酶活仅为
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图 6 硫酸鼠李聚糖酶的最适反应温度
Fig. 6 The effect of temperature on degradase
图 7 硫酸鼠李聚糖酶对温度的稳定性
Fig. 7 The effect of temperature on degradase stability
40. 9%。该酶对 pH 具有良好的稳定性，由图 9 可
看出，在 pH 7 ～ 9 条件下，硫酸鼠李聚糖酶在 24 h
内，酶活无明显降低，仍可达到 90%以上。但在 pH
分别为 6 和 10 的环境中，酶活会随着时间的增加
而明显降低，24 h后，残留酶活均只有 20%左右。
图 8 pH对硫酸鼠李聚糖酶的影响
Fig. 8 The effect of pH on degradase
图 9 硫酸鼠李聚糖酶对 pH的稳定性
Fig. 9 The effect of pH on degradase stability
2. 4. 3 金属离子对酶活性的影响
为研究溶液中金属离子对硫酸鼠李聚糖酶活性
的影响，对同一浓度下 8 种常见金属离子对酶活性影
响做了初步探究，结果如表 1 所示。一价金属离子中
的 K +对硫酸鼠李聚糖酶活力有轻微的促进作用，
Na +与 Li +对酶没有明显的促进或抑制作用;二价金
属离子中，Mg2 +和 Ca2 + 对酶有轻微的抑制作用，而
Zn2 +与 Cu2 +对酶的抑制作用明显，其中 Cu2 +使酶分
子基本丧失活性，Zn2 + 存在时酶的残留酶活仅有
10%左右;三价的 Fe3 +对酶也表现出了较强的抑制
作用，残留酶活为 35%。
表 1 金属离子对酶活性的影响
Table 1 The effect on the enzyme activity by different metalion
金属离子 浓度 /(mmol·L －1) 相对酶活 /%
对照 50 100. 4 ± 0. 7
NaCl 50 103. 6 ± 0. 4
KCl 50 111 ± 1. 5
LiSO4 50 98. 8 ± 0. 2
MgSO4 50 89. 2 ± 0. 5
CaCl2 50 88. 4 ± 0. 9
CuSO4 50 0. 6 ± 0. 3
ZnSO4 50 10. 4 ± 1. 1
FeCl3 50 35. 3 ± 0. 8
3 结论与讨论
(1)本文利用硫酸鼠李聚糖为碳源的筛选培养
基从我国青岛沿岸腐烂海藻中筛选到 1 株可分泌硫
酸鼠李聚糖酶的菌株 SC127。经过 16S rDNA测序鉴
定 SC127 菌株为假交替单胞菌属，命名为 Pseud-
oalteromonas sp. SC127，目前该菌种保存在中国典型
微生物保藏中心。
(2)对该菌株所产硫酸鼠李聚糖酶进行了分离
纯化，得到了电泳纯度的硫酸鼠李聚糖酶，其分子质
量为 110. 6 kDa，不同于目前已报道的硫酸鼠李聚糖
酶:如由 Catenovulum sp. LP214 菌株生产的浒苔多糖
裂解酶，其酶分子质量为 75. 5 kDa［12］;来源于交替单
胞菌属的 Alteromonas sp. A321 菌株生产的浒苔多糖
降解酶，其酶 L1 的分子质量约为 76. 4 kDa，酶 L2 的
分子质量约为 100 kDa左右［11］。
(3)该酶可降解绿藻硫酸鼠李聚糖产生以聚合
度 4 为主的硫酸鼠李寡糖，其最适反应温度为 38 ℃，
最适反应 pH 为 8，在 pH 7 ～ 9 内有良好的稳定性;
K +有轻微的促进作用，Mg2 +和 Ca2 +对酶有轻微的抑
制作用，而 Zn2 +、Cu2 + 与 Fe3 + 对其抑制作用较强，
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Na +与 Li +对该酶基本无影响。此酶的酶学性质显
示，其具有较好的温度与 pH 稳定性，可为开发硫酸
鼠李聚糖酶制剂提供一定的理论基础。
目前已有许多关于海藻多糖酶及其产物应用的
报道，其中以褐藻与红藻居多，如利用褐藻胶降解酶
生产的褐藻低聚糖已作为原料开发药物，有国家级新
药 PSS、甘糖酯、海力特和新型抗艾滋病药物 911
等［13］;琼胶酶在分子生物学、遗传工程以及糖化学等
方向也已有了较为广泛的应用，如用于分子生物学领
域琼脂糖凝胶电泳后 DNA 的回收，目前该技术已非
常成熟［14］。与褐藻和红藻相比，绿藻多糖降解酶的
研究起步相对较晚。本研究所得硫酸鼠李聚糖降解
酶具有温度稳定性高，pH适应范围更广，产物聚合度
较为集中等优点，具有较高的应用价值，为研究硫酸
鼠李寡糖结构及活性提供了工具，在开发海洋食药用
硫酸寡糖方面具有重要意义。
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Degradase for rhamnan sulfate from green algae and its enzyme characterization
LI Guo-xia1，SHEN Zhao-peng2，3，JIANG Xiao-lu1，3*
1(College of Food Science and Engineering of Ocean University of China，Qingdao 266003，China)2(School of Medicine and Pharmacy
of Ocean University of China，Qingdao 266003，China)3(Marine BiomedicalＲesearch Institute of Qingdao，Qingdao 266071，China)
ABSTＲACT A degradase-producing marine bacterial strain using rhamnan sulfate in green algae as carbon source，
named SC127，was isolated from samples of sea area of Qingdao． Degradase at electrophoretic purity grade was
obtained from the fermentation broth by ammonium sulfate precipitation，Q-sepharose fast flow ion exchange chroma-
tography and Sephadex G-100 gel filtration chromatography and the characteristics of degradase for rhamnan sulfate
were researched． The results showed that the strain was identified as Pseudoalteromonas sp． according to 16S rDNA
sequence analysis． The purified degradase for rhamnan sulfate exhibited a single band on SDS-PAGE with a molecular
mass of 110． 6 kDa and had the maximum activity at 38 ℃ and pH 8． It could be used in wide ranges of pH and tem-
perature． Analysis on products obtained by the enzymatic reaction showed that the degradase could degrade rhamnan
sulfate to obtain sulfated oligosaccharides in which the main degree of polymerization was four．
Key words degradase for rhamnan sulfate;purification;characterization;degradation products