全 文 ：高效液相色谱法测定蜈蚣草中二苯砷酸
冯仕江１，２，骆永明２，任文杰２，刘　方１，王阿楠２，马文亭２，李振高２，杨光梅３，滕　应２＊
（１．贵州大学 资源与环境工程学院，贵阳５５００２５；　２．中国科学院 土壤环境与污染修复重点实验室
（南京土壤研究所），南京２１０００８；　３．南京大学 环境学院，南京２１００２３）
摘　要：建立了高效液相色谱法测定蜈蚣草中二苯砷酸的分析方法。样品采用０．１ｍｏｌ·Ｌ－１
磷酸氢二钠溶液振荡提取４ｈ，高速离心，上清液以Ｓｈｉｍａｄｚｕ　ＶＰ－ＯＤＳ反相Ｃ１８柱为分离柱，以乙
腈－０．０２ｍｏｌ·Ｌ－１磷酸二氢钾溶液（１６＋８４）作为流动相进行洗脱，检测波长为２２０ｎｍ。二苯砷酸
的质量浓度在０．２０～２．０ｍｇ·Ｌ－１范围内与其峰面积呈线性关系，方法的检出限（３Ｓ／Ｎ）为
２．８ｍｇ·ｋｇ－１。对空白样品进行加标回收试验，加标回收率在９８．５％～９８．８％之间，测定值的相
对标准偏差（ｎ＝５）为０．９７％～４．６％。方法可应用于蜈蚣草中二苯砷酸的检测。
关键词：高效液相色谱法；二苯砷酸；蜈蚣草
中图分类号：Ｏ６５２．６３　　　文献标志码：Ａ　　　文章编号：１００１－４０２０（２０１５）０３－０３２１－０４
Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｄｉｐｈｅｎｙｌａｒｓｉｎｉｃ　Ａｃｉｄ　ｉｎ　Ｐｔｅｒｉｓ　Ｖｉｔｔａｔａ　Ｌ．ｂｙ　ＨＰＬＣ
ＦＥＮＧ　Ｓｈｉ－ｊｉａｎｇ１，２，ＬＵＯ　Ｙｏｎｇ－ｍｉｎｇ２，ＲＥＮ　Ｗｅｎ－ｊｉｅ２，ＬＩＵ　Ｆａｎｇ１，ＷＡＮＧ　Ａ－ｎａｎ２，ＭＡ　Ｗｅｎ－ｔｉｎｇ２，
ＬＩ　Ｚｈｅｎ－ｇａｏ２，ＹＡＮＧ　Ｇｕａｎｇ－ｍｅｉ　３，ＴＥＮＧ　Ｙｉｎｇ２＊
（１．Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ　ａｎｄ　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｇｕｉｚｈｏｕ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕｉｙａｎｇ５５００２５，Ｃｈｉｎａ；
２．Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｓｏｉｌ　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ　ａｎｄ　Ｐｏｌｌｕｔｉｏｎ　Ｒｅｍｅｄｉａｔｉｏｎ，Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｓｏｉｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，
Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｎａｎｊｉｎｇ２１０００８，Ｃｈｉｎａ；
３．Ｓｃｈｏｏｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ，Ｎａｎｊｉｎｇ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ２１００２３，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＨＰＬＣ　ｗａｓ　ａｐｐｌｉｅｄ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｄｉｐｈｅｎｙｌａｒｓｉｎｉｃ　ａｃｉｄ（ＤＰＡＡ）ｉｎ　Ｐｔｅｒｉｓ　ｖｉｔｔａｔａ　Ｌ．．Ｔｈｅ
ｓａｍｐｌｅ　ｗａｓ　ｅｘｔｒａｃｔｅｄ　ｂｙ　ｏｓｃｉｌａｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｎａ２ＨＰＯ４ｓｏｌｕｔｉｏｎ　ｏｆ　０．０２ｍｏｌ·Ｌ－１　ｆｏｒ　４ｈ．Ａｆｔｅｒ　ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ，ｔｈｅ
ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ　ｗａｓ　ｓｅｐａｒａｔｅｄ　ｏｎ　ａ　Ｓｈｉｍａｄｚｕ　ＶＰ－ＯＤＳ　ｒｅｓｅｒｖｅｄ－ｐｈａｓｅ　Ｃ１８ｃｏｌｕｍｎ　ｗｉｔｈ　ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ－ＫＨ２ＰＯ４ｓｏｌｕｔｉｏｎ　ｏｆ
０．０２ｍｏｌ·Ｌ－１　ａｓ　ｔｈｅ　ｍｏｂｉｌｅ　ｐｈａｓｅ　ｆｏｒ　ｇｒａｄｉｅｎｔ　ｅｌｕｔｉｏｎ．ＵＶ－ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｗａｓ　ｍａｄｅ　ａｔ　２２０ｎｍ．Ｔｈｅ　ｌｉｎｅａｒ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ
ｗａｓ　ｆｏｕｎｄ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｔｈｅ　ｐｅａｋ　ａｒｅａ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｍａｓｓ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＤＰＡＡ　ｗａｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｒａｎｇｅ　ｏｆ　０．２０－２．０ｍｇ·Ｌ－１，
ｗｉｔｈ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｌｉｍｉｔ　ｏｆ　２．８ｍｇ·ｋｇ－１．Ｒｅｃｏｖｅｒｙ　ｒａｔｅｓ　ｍｅａｓｕｒｅｄ　ｂｙ　ｓｔａｎｄａｒｄ　ａｄｄｉｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ｗｅｒｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｒａｎｇｅ　ｏｆ
９８．５％－９８．８％，ｗｉｔｈ　ＲＳＤ（ｎ＝５）ｉｎ　ｔｈｅ　ｒａｎｇｅ　ｏｆ　０．９７％－４．６％．Ｔｈｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ　ＤＰＡＡ　ｉｎ
Ｐｔｅｒｉｓ　ｖｉｔｔａｔａ　Ｌ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ＨＰＬＣ；Ｄｉｐｈｅｎｙｌａｒｓｉｎｉｃ　ａｃｉｄ；Ｐｔｅｒｉｓ　ｖｉｔｔａｔａ　Ｌ．
　　二苯氯胂和二苯氰胂是二战中日本大量制造使
用的刺激性毒剂。二苯氯胂和二苯氰胂在环境中外
泄后极不稳定，容易发生水解和氧化，生成稳定的
收稿日期：２０１４－０８－１９
基金项目：国家自然科学基金重点项目（４１２３０８５８）
作者简介：冯仕江（１９８７－），男，广西合浦人，硕士研究生，研究
　方向为有机污染土壤生物修复。
＊ 联系人。Ｅ－ｍａｉｌ：ｙｔｅｎｇ＠ｉｓｓａｓ．ａｃ．ｃｎ
二苯砷酸（ＤＰＡＡ）［１］。二苯砷酸具有较强的基因毒
性和神经毒性［２］，能导致中枢神经系统疾病［３］，症状
表现为小脑和脑干功能障碍［４］。我国是第二次世界
大战期间化学武器的最大受害者。据不完全统计，
日军遗留化学武器约２００万枚，遍布１９个省市，其
中大部分集中在东北地区［５－７］，这些区域的土壤中均
出现不同程度的砷污染现象，主要以二苯砷酸为
主［８］。已有研究表明：二苯砷酸可以从污染水体和
·１２３·
冯仕江等：高效液相色谱法测定蜈蚣草中二苯砷酸
土壤中转移至水稻体内［９－１０］，进而通过食物链影响
到人体健康和生态安全，因此急需开展二苯砷酸污
染土壤的修复工作。
蜈蚣草具有很强的砷污染耐受性和吸收转运能
力，是一种广泛用于砷污染土壤修复的超富集植物，
其生物富集系数可达１　４５０［１１－１３］。前期研究表明，蜈
蚣草对二苯砷酸污染土壤也具有一定的修复能
力［１４］。目前对植物体内二苯砷酸提取和检测方法
的研究相当缺乏，仅发现文献［９］采用高效液相色
谱－电感耦合等离子体质谱法（ＨＰＬＣ－ＩＣＰ－ＭＳ）测定
水稻中的二苯砷酸等有机砷化合物，此方法具有灵
敏度高、可同时进行多种形态砷的测定等优点，然而
这个方法所需设备昂贵，运行成本高，不便于普及利
用，极大地限制了植物修复二苯砷酸污染土壤的相
关研究。因此，建立植物体内，特别是蜈蚣草体内二
苯砷酸的分析方法具有紧迫性和必要性。
本工作建立了高效液相色谱法测定蜈蚣草体内
二苯砷酸的分析方法，优化了提取方法和色谱条件，
达到快速、准确检测少量蜈蚣草样品中二苯砷酸含
量的目的，为二苯砷酸在蜈蚣草中的富集迁移和蜈
蚣草修复二苯砷酸污染土壤等研究提供技术支撑。
１　试验部分
１．１　仪器与试剂
Ｓｈｉｍａｄｚｕ型高效液相色谱仪，配ＳＩＬ－２０Ａ自动
进样器；ＬＣ－２０ＡＴ二元泵和ＳＰＤ－Ｍ　２０Ａ检测器；
Ｍｉｌｉｐｏｒｅ型超纯水设备；ＺＱＺＹ－Ｂ型全温度振荡培
养箱；ＫＱ－６００ＶＤＥ型三频数控超声清洗器；ＬＡＮ－
ＣＯＮＣＯ型冷冻干燥机。
二苯砷酸标准储备溶液：２００ｍｇ·Ｌ－１，称取纯
度为９７％的二苯砷酸标准品２００ｍｇ，用水溶解并定
容至１Ｌ。使用时用水稀释至所需质量浓度。
乙腈为色谱纯，磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、硝酸
和甲醇为优级纯，其他试剂均为分析纯，试验用水为
超纯水，电阻率为１８．２ＭΩ·ｃｍ。
１．２　仪器工作条件
Ｓｈｉｍａｄｚｕ　ＶＰ－ＯＤＳ　Ｃ１８ 色 谱 柱 （１５０ ｍｍ×
４．６ｍｍ，５μｍ），检测波长２２０ｎｍ，柱温３０℃。流
动相：乙腈－０．０２ｍｏｌ·Ｌ－１磷酸二氢钾（１６＋８４）溶
液（用磷酸调节至 ｐＨ　２．７），流量为１．０ｍＬ·
ｍｉｎ－１，进样体积为１０μＬ。
１．３　试验方法
称取经冷冻干燥，研磨混匀的蜈蚣草试样
０．１００　０ｇ于５０ｍＬ玻璃离心管中，加入２００ｍｇ·
Ｌ－１二苯砷酸标准溶液５０μＬ，摇匀，静置２４ｈ，制成
加标蜈蚣草样品。同时设置无污染蜈蚣草为对照样
品。向离心管中加１ｍｏｌ·Ｌ－１磷酸氢二钠溶液
２０ｍＬ，于２５℃振荡提取４ｈ，以１３　０００ｒ·ｍｉｎ－１转
速离心１０ｍｉｎ，取上清液，过０．２２μｍ滤膜，在仪器
工作条件下进行测定。
２　结果与讨论
２．１　色谱行为
本方法的色谱条件基于本实验室前期建立的土
壤中二苯砷酸的测定方法［１５］，在此色谱条件上，调
节流动相中乙腈－磷酸二氢钾（１６＋８４）溶液，其它条
件不变，测定二苯砷酸标准溶液时，出峰保留时间为
１７ｍｉｎ，见图１（ａ）。对含二苯砷酸蜈蚣草测定时，
目标峰能与前后杂峰有效分离，见图１（ｂ）。对未污
染二苯砷酸蜈蚣草的对照样品进行提取测定，在相
应保留时间未出峰，见图１（ｃ）。
图１　色谱图
Ｆｉｇ．１　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍｓ
２．２　样品前处理方法的选择
２．２．１　提取剂
植物样品中砷形态的提取剂常选用水、甲醇－
水、硝酸溶液等［１６－２１］；采用乙腈作为提取剂测定土壤
等固体样品中的二苯砷酸［２１］；磷酸盐缓冲溶液是一
·２２３·
冯仕江等：高效液相色谱法测定蜈蚣草中二苯砷酸
种常用于提取生物样品中洛克沙胂的提取剂［２２］。
试验考察了水、甲醇－水 （１＋５）、硝酸、乙腈和
０．１ｍｏｌ·Ｌ－１磷酸氢二钠溶液等提取剂的提取效
果。结果表明：当乙腈作为提取剂时，二苯砷酸在色
谱图上未出峰，而硝酸提取液中色素较多，在目标峰
前后有较多杂峰，且目标峰未能与杂峰分开。另外
３种提取剂提取效果均较好，磷酸氢二钠溶液、水、
甲醇－水（１＋５）溶液的提取率分别为 ９７．３％，
１０１％，１０６％，这可能与二苯砷酸的强水溶性有关。
在２０ ℃ 时，二苯砷酸在水中的溶解度能达到
４９８ｍｇ·Ｌ－１［２］。
采用磷酸氢二钠、水、甲醇－水等３种提取剂对
吸收二苯砷酸的蜈蚣草地上部分进行提取，结果表
明：磷酸氢二钠溶液的提取结果与采用文献［９］测得
的结果基本一致，且标准偏差较小。综上所述，试验
选用０．１ｍｏｌ·Ｌ－１磷酸氢二钠溶液为提取剂，用量
为２０ｍＬ。
２．２．２　提取方法
试验考察了超声和振荡两种方法和提取时间对
蜈蚣草体内二苯砷酸提取率的影响，结果表明：采用
超声提取法时，在９０ｍｉｎ内，其提取率随时间的增
加而提高；９０ ｍｉｎ 后提取率基本达到稳定，为
９６．７％；采用转速为２００ｒ·ｍｉｎ－１振荡提取法时，在
４ｈ内，提取率随时间的增加而提高，４ｈ后基本达
到稳定，此时提取率为９８．１％。综合考虑提取时间
和提取效率，试验采用振荡提取法，提取时间为
４ｈ。　
２．３　标准曲线及检出限
按试验方法对质量浓度为０．２０，０．６０，１．０，
１．５，２．０ｍｇ·Ｌ－１的二苯砷酸标准溶液进行测定，
结果表明：二苯砷酸的质量浓度在０．２０～２．０ｍｇ·
Ｌ－１范围内与峰面积呈线性关系，线性回归方程为
ｙ＝３．１７９×１０４　ｘ－２．５５２×１０３，相 关 系 数 为
０．９９９　４。以３倍信噪比计算得方法的检出限（３Ｓ／
Ｎ）为５２μｇ·Ｌ
－１。按称样量计算得方法的检出限
为２．８ｍｇ·ｋｇ－１。
２．４　回收试验
在没有被污染蜈蚣草中添加一定质量浓度的二
苯砷酸标准溶液，按试验方法做加标回收试验，结果
见表１。
由表１可知：二苯砷酸的回收率在９８．５％～
９８．８％之间，相对标准偏差在０．９７％～４．６％之间。
表１　回收试验结果（ｎ＝５）
Ｔａｂ．１　Ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆ　ｔｅｓｔ　ｆｏｒ　ｒｅｃｏｖｅｒｙ
加标量
ｗ／（ｍｇ·ｋｇ－１）
测定值
ｗ／（ｍｇ·ｋｇ－１）
回收率
／％
ＲＳＤ
／％
２０　 １９．８３，１９．９５，１９．６１，１９．５３，１９．５７　 ９８．５　 ４．６
１００　 ９７．６１，９９．９５，９８．７９，９９．５３，９８．１２　 ９８．８　 ０．９７
２．５　样品分析
将蜈蚣草在含５ｍｇ·Ｌ－１二苯砷酸的 Ｈｏａｇ－
ｌａｎｄ′ｓ营养液中通气培养两周。蜈蚣草采集后用蒸
馏水清洗３～４遍，根、叶分开冷冻干燥，研磨混匀，
称取试样０．１００　０ｇ，按试验方法分别测定叶、根部
分二苯砷酸的含量，每个样品平行测定５次，结果见
表２。
表２　水培试验中蜈蚣草叶和根中二苯砷酸的含量（ｎ＝５）
Ｔａｂ．２　ＤＰＡＡ　ｃｏｎｔｅｎｔ　ｉｎ　ｌｅａｖｅｓ　ａｎｄ　ｒｏｏｔｓ　ｏｆ　Ｐ．ｖｉｔｔａｔａ
ｇｒｏｗｉｎｇ　ｉｎ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ　ｃｕｌｔｕｒｅ
样品
测定值
ｗ／（ｍｇ·ｋｇ－１）
平均值
ｗ／（ｍｇ·ｋｇ－１）
叶 ７２２．９７，６９０．７３，６６５．３８，７２７．３５，７１５．７０　７０４．４３±２６．０２
根 ２７１．７９，２６５．７６，２６９．２５，２７８．８８，２７８．８１　２７２．９０±５．８４
由表２可知：蜈蚣草能有效地吸收转移至水体
中的二苯砷酸，且其在生长两周后叶子部分生物富
集系数达１４０，生物转移系数为２．６。
本工作建立了蜈蚣草体内二苯砷酸的高效液相
色谱测定方法，优化了提取方法和测定条件。该方
法稳定可靠，操作简便，不用脱色，成本低，检出限
低，为采用蜈蚣草修复二苯砷酸污染土壤提供了方
法基础。
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