全 文 ：槐耳清膏体外抑制血管生成的实验研究＊
许戈良　荚卫东　马金良　余继海
(安徽省立医院普外科 , 合肥　230001)
中国图书分类号　R 273;R 282.71;的 322.12;R 329.24;R
329.25;R 977.6
文献标识码　A　文章编号　1001-1978(2003)12-1410-03
摘要　目的　探讨槐耳清膏对血管内皮细胞体外构建新生
血管的抑制作用及其机制。方法　应用 MTT 实验 、流式细
胞仪 、Matrigel实验 , 体外研究槐耳清膏对血管内皮生长因
子(VEGF)诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)增殖和分化
成血管能力的影响。结果　在浓度为 0.1 ～ 10 g·L -1时 , 槐
耳清膏明显抑制 VEGF 诱导的内皮细胞增殖 ,呈量效关系;
流式细胞仪检测表明 , 槐耳清膏阻止内皮细胞由 S 期进入
G 2/M 期;槐耳清膏浓度为 1 g·L-1时 ,可以抑制内皮细胞体
外分化成管样结构 , 浓度为 10 g·L -1时 , 则完全阻断内皮细
胞体外分化成管样结构的能力。结论　槐耳清膏对血管内
皮细胞体外构建新生血管具有抑制作用 ,其机制可能与 S 期
阻滞有关。
关键词　槐耳清膏;内皮细胞;血管生成;细胞周期
　　槐耳清膏(ex tract of fungi of huaier , EFH)是药
用真菌槐耳(Trameyes robiniphila Murr)的提取
物 ,其主要的活性成分是多糖蛋白 ,含多种氨基酸和
微量元素[ 1 , 2] ,已广泛应用于临床肿瘤治疗[ 2 ～ 5] 。
2003 07 16收稿 , 2003 09 08修回
＊安徽省自然科学基金安科医药专项资助课题 , No 01043708
作者简介:许戈良 ,男 , 46岁 ,教授 ,硕士生导师。 Tel:0551-2283916 ,
E-mail:xugelian@mail.hf.ah.cn
为进一步探讨其抗癌机制 ,我们研究了槐耳清膏对
血管内皮细胞体外构建新生血管的影响。
1　材料和方法
1.1　药品与试剂　槐耳清膏由江苏启东盖天力制
药有限公司提供;MTT(四氮甲基四唑蓝)购自 Sig-
ma 公司;VEGF (Pepro tech , 英国)用无血清
DMEM 培养液配制成 10μg·L-1 ,置于-20℃保存
待用;Matrigel(生长因子减少型)为 Becton Dickin-
son公司产品。
1.2　仪器　BB5060 型 CO2 培养箱(美国 Heraeus
公司);Biocell ht1型全自动酶标仪(奥地利);CK型
倒置显微镜(日本 Olympus公司);流式细胞仪(美
国 Coulter公司)。
1.3　HUVECs培养及鉴定　无菌收集 30 cm 长新
鲜的新生儿脐带 ,参考 Jaffe 等[ 6]的方法 ,常规培养
HUVECs。待细胞长成单层后 ,经消化 、传代培养 5
～ 10 d 后 , HUVECs融合在一起 ,倒置显微镜下观
察见培养的 HUVECs 呈铺路石状镶嵌单层排列。
内皮细胞经流式细胞仪检测 vWF 和 CD31 因子检
测证实 。实验中取 3 ～ 5代内皮细胞进行 。
1.4　MTT实验　取对数生长期 HUVECs ,以 1×
10
8·L-1细胞接种于 96孔板 , 100 μl· well-1 ,每组
设 5个平行孔。在含 10%FBS 、VEGF(10 μg·L-1)
的 DMEM 的培养液中培养 24 h 后(5% CO2 、
37℃),加入含不同浓度槐耳清膏(0 、0.01 、0.1 、1.0
rats hind paw s were induced by dimethylbenzene and
carrageenan respectively . The biosynthesis of
leukot riene and β-glucuronidase release in the cells
w ere measured by HPLC and fluorescence spec-
trophotometer respectively. RESULTS 　 To tal
flavonoids isolated f rom Platychadus orientalis re-
markably inhibi ted the ear edema induced by
dimethylbenzene in mice at the dose of 12.5 ～ 50.0
mg·kg -1 and the swelling of rats hind paw s induced
by carrageenan at the dose of 25.0 ～ 50.0 mg·kg-1.
Total flavonoids at final concentration of 5.0 ～ 125.0
mg·L-1 inhibited 5-HETE and LTB4 synthesis by
30.5%～ 87.3% and 27.8%～ 84.3% respectively.
In comparision w ith controls , Total flavonoids at final
concentration of 5.0 ～ 45.0 mg·L-1 inhibi ted β-g lu-
curonidase release by 13.4%～ 32.2%.CONCLU-
SION　Total flavonoids isolated from Platychadus
orientalis has an ant i-inf lammatory ef fect w hich may
be related to inhibiting 5-HETE and LTB4 product ion
and β-glucuronidase release.
KEY WORD　f lavonoids;leukotriene B4;5-hydrox-
yeicosatetraenoic acid;β-glucuronidase
1Guangdong Laboratory for Research and Development of Natu ral
Drugs , Guangdong
·1410· 中国药理学通报　Chinese Pharmacological Bulletin　2003 Dec;19(12):1410 ～ 2
Fig 1　The effect of EFH on the inhibition of tube formation induced by VEGF(×400)
　　A:HUVECs formed a b ranching , anastomosing network of capillary like tubules with multicent ric junctions induced by VEGF;B:A re-
markable inhibit ion of tube formation w as observed in the presence of 1 g·L -1 EFH;C:Complete inhibi tion w as obtained at 10 g·L-1EFH
及 10 g·L-1)的上述培养液 100μl ,继续培养 48 h 。
加入 MTT 液 ,培养 4 h 后 ,弃上清液 ,加入 100 μl·
well-1二甲基亚砜 ,微量振荡仪振荡 5 min ,按参考
波长 492 nm 、参比波长 630 nm 应用酶标仪测定各
孔吸光度值(A值)。按下列公式计算细胞生长抑制
率(Inhibito ry Rate , IR):IR=〔(正常对照组 A 值-
用药组A 值)/ 正常对照组 A值〕×100%。
1.5　流式细胞仪测量细胞周期　HUVECs单细胞
悬液接种后 ,改用无血清 DMEM 培养液(含 0.1%
BAS 、VEGF 10 μg·L-1)培养 24 h使细胞周期同步
化。加入含槐耳清膏(1.0 g·L-1)DMEM 培养液 ,
5%CO2 、37℃环境下培养 48 h 后 ,收集细胞 ,制成
单细胞悬液 ,体积分数为 70%的冷乙醇固定 ,在经
Rnase 消化 、碘化丙碇(PI)染色 30 min ,样品经流式
细胞仪测试。
1.6　Matrigel实验　取 100 μl融化的生长因子减
少型 Matrigel ,加入 24孔板上 ,37℃孵育 1 h使 Ma-
trigel聚合成胶。以 1×108·L-1细胞接种在胶上 ,
100μl· well-1 , 加入含不同浓度槐耳清膏(0 、1.0
及10 g·L-1)的无血清 DMEM 培养液(10 μg·L-1
V EGF 、0.1% BSA), 37℃、5%CO2 培养箱孵育 48
h后 ,应用倒置显微镜 ,观察槐耳清膏对内皮细胞体
外构建血管的影响。
1.7　统计学处理　两样本均数比较用 t 检验 ,组间
比较采用方差分析处理。
2　结果
2.1　槐耳清膏对 HUVECs体外增殖的抑制作用　
在浓度为 0.1 ～ 10 g·L-1时 , 槐耳清膏明显抑制
V EGF 诱导的 HUVECs的增殖 ,随着槐耳清膏药物
浓度增加 ,内皮细胞生长抑制率增加 ,并呈量效关系
(Tab 1)。
2.2　槐耳清膏对 HUVECs细胞周期的影响　HU-
VECs经槐耳清膏(1.0 g·L-1)作用 48 h时 ,与对照
组相比 , S期细胞比例明显增多 ,G2/M 细胞比例明
显减少 ,而G0/G1 期细胞增殖不受影响(Tab 2)。流
式细胞仪检测显示 ,槐耳清膏能够阻止内皮细胞由
S期进入 G2/M 期 ,产生 S期阻滞 。
Tab 1　Inhibitory effect of EFH on prol iferation of HUVECs
stimulated by VEGF( x ±s , n = 5)
Group A IR/ %
Control 0.574±0.067 -
EFH(0.01 g·L -1) 0.510±0.043 11.3
EFH(0.1 g·L -1) 0.429±0.061＊ 25.7
EFH(1 g·L -1) 0.314±0.059＊＊ 45.3
EFH(10 g·L -1) 0.226±0.035＊＊ 60.7
　　＊P <0.05 vs cont rol group;＊＊P<0.05 vs EFH(0.1 g·L-1)
group
Tab 2　Effect of EFH on HUVECs cell cycle( x±s , n = 5)
Group G0/G 1 S G 2/M
Con trol 68.60±1.61 23.36±1.07 8.33±0.81
EFH(1 g·L -1) 68.32±1.59＊ 29.53±0.84＊＊ 2.37±1.01＊＊
　　＊P >0.05 , ＊＊P<0.01 vs con trol group
2.3　槐耳清膏对 VEGF诱导的 HUVECs分化的影
响　HUVECs在 20 ～ 24 h内粘附于 Matrigel表面;
在 VEGF 诱导下 , HUVECs在 24 ～ 48 h 内分化成
分枝状毛细血管样结构(Fig 1A)。槐耳清膏浓度为
1 g·L-1可以抑制VEGF 诱导的 HUVECs分化成管
样结构(Fig 1B);浓度为 10 g·L-1时 ,则完全阻断
HUVECs体外分化成管样结构的能力(Fig 1C)。
3　讨论
肿瘤的生长和转移依赖于血管生成。肿瘤血管
生成是由血管内皮细胞 、肿瘤细胞与其微环境相互
·1411·中国药理学通报　Chinese Pharmacological Bulletin　2003 Dec;19(12)
影响的结果 ,其中血管内皮细胞的增殖 、侵袭 、迁移
和分化是新生血管形成过程中的关键环节 ,并且受
到 VEGF 的调控 ,直接抑制血管内皮细胞的增殖 、
侵袭 、迁移和分化 , 是抗血管生成最有效的靶
点[ 5 ,6] 。槐耳清膏是药用真菌槐耳的提取物 ,其主
要的活性成分是多糖蛋白 ,含多种氨基酸和微量元
素 ,广泛应用于临床肿瘤治疗 ,但其确切的机制尚未
完全清楚 。
本实验应用槐耳清膏对 VEGF 诱导的 HU-
VECs的增殖和分化作用进行了体外研究。当槐耳
清膏的浓度为 0.1 ～ 10 g·L-1时 , VEGF 诱导的内
皮细胞增殖受到明显的抑制 ,并呈量效关系。Ma-
trigel实验显示 ,槐耳清膏浓度为 1 g·L-1可以抑制
V EGF 诱导的 HUVECs分化成管样结构;浓度为
10 g·L-1时 ,则完全阻断 HUVECs体外分化成管样
结构的能力 。上述结果初步表明 ,VEGF 诱导血管
生成过程中的关键环节不同程度受到槐耳清膏的抑
制 ,提示槐耳清膏可能通过影响 VEGF 诱导血管内
皮细胞的增殖和分化而具有潜在的抗血管生成作
用。为进一步探讨槐耳清膏的作用机制 ,我们应用
流式细胞仪检测了槐耳清膏对 HUVECs细胞周期
的影响 ,结果发现槐耳清膏特异性阻止内皮细胞由
S期进入 G2/M 期 ,产生 S 期阻滞。由于细胞处于
被抑制状态 ,槐耳清膏组 S 期的细胞比例增高 ,而
G2/M 期细胞比例下降。有关槐耳清膏对内皮细胞
周期的调控机制有待深入研究。
本实验结果初步表明 ,槐耳清膏对血管内皮细
胞体外构建新生血管具有抑制作用 ,为进一步探索
槐耳清膏抗肿瘤机制提供了新的思路 。鉴于离体实
验存在一定的局限性 ,实验结果可能受药物本身的
pH 值 、离子浓度和渗透压等因素的影响 。因此 ,尚
有待进一步采用血管生成体内模型证实。
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Experimental study of extract of fungi of huaier on angiogenesis in vitro
XU Ge-Liang , JIA Wei-Dong , MA Jin-Liang , YU Ji-Hai
(Dept of General Surgery , Anhui Provincial Hospital , Hefei　230001)
ABSTRACT　AIM　To investigate the inhibitory ef-
fect of ext ract of fungi of huaier(EFH)on neovascu-
larization formed by human umbilical vein endothelial
cells(HUVECs)in v itro.METHODS　Using M TT
assay , flow cy tometry and Matrigel assay , the ef fect
of EFH on the proliferation and differentiation of
HUVECs stimulated by vascular endothelial g row th
factor (VEGF)were evaluated in vit ro.RESULTS
　EFH inhibited proliferation of HUVECs stimulated
by VEGF at the concentration of 0.1 to 10 g·L-1.
The antiproliferat itive ef fect occurred in a dose-depen-
dent manner.Flow cy tometry analy ses revealed that
EFH treatment delayed S-phase progression.A re-
markable inhibi tion of tube fo rmation w as observed in
the presence of 1 g·L-1 EFH and complete inhibit ion
w as obtained at 10 g· L-1 EFH.CONCLUSION　
EFH is able to inhibit neovascularization formed by
HUVECs.Its mechanism might be related to S-phase
progression.
KEY WORDS　ex tract of fungi of huaier;endotheli-
um ;angiogenesis;cell cycle
·1412· 中国药理学通报　Chinese Pharmacological Bulletin　2003 Dec;19(12)