全 文 ：基金项目：国家自然科学基金 （８１２６０４９０）；新疆维吾尔自治区自然科学基金 （２０１５２１１Ｃ０３３）；新疆维吾尔自治区高校科研计划项目
（ＸＪＥＤＵ２０１４Ｓ０２８）
作者简介：古再努尔·买买提（１９８９－），女（维吾尔族），在读硕士，研究方向：动脉粥样硬化。
通信作者：艾尼瓦尔·吾买尔，男（维吾尔族），教授，博士生导师，研究方向：心血管药理学，Ｅ－ｍａｉｌ：ａｎｗａｒ．ｕｍａｒ＠１２６．ｃｏｍ。
·基础医学研究·
榅桲总黄酮对过氧化氢诱导人脐静脉血管内皮细胞
氧化损伤的保护作用研究
古再努尔·买买提１，阿尔孜古丽·吐尔逊２，阿迪力·阿不都热合曼１，周文婷１，
邬利娅·伊明１，艾尼瓦尔·吾买尔１
（新疆医科大学１基础医学院药理教研室，乌鲁木齐　８３００１１；２第一附属医院科研中心，乌鲁木齐　８３００５４）
摘要：目的　研究榅桲总黄酮 （ＴＦＣＯＭ）对过氧化氢（Ｈ２Ｏ２）诱导人脐静脉内皮细胞（ＨＵＶＥＣ）氧化损伤
和凋亡的保护作用及机制。方法　体外培养ＨＵＶＥＣ，分为正常对照组、Ｈ２Ｏ２ 模型组（１０μｍｏｌ／Ｌ）和ＴＦＣＯＭ低
浓度 （１０μｇ／ｍＬ）、中浓度 （２０μｇ／ｍＬ）、高浓度 （４０μｇ／ｍＬ）干预组。在建立 Ｈ２Ｏ２ 氧化损伤模型的基础上，采用
ＭＴＴ法检测 ＨＵＶＥＣ活力，流式细胞仪和 Ｈｏｃｈｅｓｔ３３２５８荧光染色法检测细胞凋亡率，观察 ＨＵＶＥＣ的周期变化。
结果　榅桲总黄酮干预组细胞形态介于正常对照组与 Ｈ２Ｏ２ 模型组，并随着药物浓度的增高，细胞形态改善更加
明显，与 Ｈ２Ｏ２ 模型组比较，细胞间隙缩小，细胞间连接增加，边界较清楚。ＴＦＣＯＭ能对抗 Ｈ２Ｏ２ 诱导引起的细胞
凋亡，能促进 ＨＵＶＥＣ增殖分化，ＴＦＣＯＭ 低浓度组变化与 Ｈ２Ｏ２ 模型组比较差异无统计学意义，但中、高浓度组
细胞存活率逐渐增高，差异有统计学意义 （Ｐ ＜０．０１）。榅桲总黄酮低、中、高浓度能够促进细胞 ＤＮＡ合成，与
Ｈ２Ｏ２ 模型组比较差异有统计学意义 （Ｐ ＜０．０１）。正常对照组细胞的早期凋亡率为３．４％，Ｈ２Ｏ２ 模型组细胞的早
期凋亡率为１９．２％，与正常对照组比较差异有统计学意义 （Ｐ ＜０．０５）；ＴＦＣＯＭ 低、中、高浓度组的早期凋亡率为
１６．７％、１２．６％、６．１％，与 Ｈ２Ｏ２ 模型组比较差异均有统计学意义 （Ｐ ＜０．０５）。结论　ＴＦＣＯＭ 可抑制 Ｈ２Ｏ２ 诱
导的内皮细胞凋亡，减轻 Ｈ２Ｏ２ 对内皮细胞的损伤作用，可明显降低 Ｈ２Ｏ２ 对血管内皮细胞的氧化损伤。
关键词：榅桲总黄酮；人脐静脉内皮细胞；过氧化氢；氧化损伤
中图分类号：Ｒ２９　　文献标识码：Ａ　　文章编号：１００９－５５５１（２０１６）０６－０６９６－０７
ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００９－５５５１．２０１６．０６．００８
Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　Ｔｏｔａｌ　Ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ　ｉｎ　Ｃｙｄｏｎｉａ　ｏｂｌａｎｇａ　Ｍｉｌｌ．ｏｎ　ｈｕｍａｎ
ｕｍｂｉｌｉｃａｌ　ｖｅｉｎ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｃｅｌ　ｏｘｉｄａｔｉｖｅ　ｄａｍａｇｅ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ｈｙｄｒｏｇｅｎ　ｐｅｒｏｘｉｄｅ
Ｇｕｚａｉｎｕｅｒ　Ｍａｉｍａｉｔｉ　１，Ａｅｒｚｉｇｕｌｉ　Ｔｕｅｒｘｕｎ２，Ａｄｉｌｉ　Ａｂｕｄｕｒｅｈｅｍａｎ１，ＺＨＯＵ　Ｗｅｎｔｉｎｇ１，Ｗｕｌｉｙａ　Ｙｉｍｉｎｇ１，Ａｎｗａｒ　Ｕｍａｒ１
（１　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｂａｓｉｃ　Ｍｅｄｉｃａｌ，Ｘｉｎｊｉａｎｇ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，
Ｕｒｕｍｑｉ　８３００１１，Ｃｈｉｎａ；２　Ｔｈｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｃｅｎｔｅｒ，ｔｈｅ　Ｆｉｒｓｔ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ　ｏｆ　Ｘｉｎｊｉａｎｇ
Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｕｒｕｍｑｉ　８３００５４，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ　ｔｈｅ　ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ａｎｄ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ　ｏｆ　Ｔｏｔａｌ　Ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ　ｉｎ　Ｃｙｄｏｎｉａ
ｏｂｌａｎｇａ　Ｍｉｌ．（ＴＦＣＯＭ）ｏｎ　ｔｈｅ　ｏｘｉｄａｔｉｖｅ　ｉｎｊｕｒｙ　ａｎｄ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｕｍｂｉｌｉｃａｌ　ｖｅｉｎ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｃｅｌ
（ＨＵＶＥＣ）ｉｎｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ｈｙｄｒｏｇｅｎ　ｐｅｒｏｘｉｄｅ（Ｈ２Ｏ２）．Ｍｅｔｈｏｄｓ　ＨＵＶＥＣ　ｗｅｒｅ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ａｎｄ　ｄｉｖｉｄｅｄ
ｉｎｔｏ　ｆｉｖｅ　ｇｒｏｕｐｓ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ　ｎｏｒｍａｌ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ，Ｈ２Ｏ２ｉｎｊｕｒｅｄ　ｇｒｏｕｐ（１０μｍｏｌ／Ｌ），ｌｏｗ－ｄｏｓａｇｅ　ｏｆ　ＴＦ－
ＣＯＭ　ｇｒｏｕｐ（１０μｇ／ｍＬ），ｍｉｄ－ｄｏｓａｇｅ　ｏｆ　ＴＦＣＯＭ　ｇｒｏｕｐ（２０μｇ／ｍＬ）ａｎｄ　ｈｉｇｈ－ｄｏｓａｇｅ　ｏｆ　ＴＦＣＯＭ　ｇｒｏｕｐ
　第３９卷　第６期 新 疆 医 科 大 学 学 报 Ｖｏｌ．３９　Ｎｏ．６
　２０１６年６月 Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｘｉｎｊｉａｎｇ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｊｕｎ．２０１６
（４０μｇ／ｍＬ）．Ｏｎ　ｔｈｅ　ｂａｓｉｓ　ｏｆ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈｉｎｇ　ｔｈｅ　ｏｘｉｄａｔｉｖｅ　ｄａｍａｇｅ　ｍｏｄｅｌ　ｏｆ　Ｈ２Ｏ２，ｏｂｓｅｒｖｅ　ｔｈｅ　ｐｅｒｉｏｄｉｃ
ｃｈａｎｇｅ　ｏｆ　ＨＵＶＥＣ，ｂｙ　ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ　ＨＵＶＥＣ　ｖｉｇｏｒ　ｕｓｉｎｇ　ｂｙ　ＭＴＴ　ｍｅｔｈｏｄ，ｆｌｏｗ　ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ　ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ　ａｎｄ
Ｈｏｃｈｅｓｔ３３２５８ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｓｔａｉｎｉｎｇ　ｍｅｔｈｏｄ　ｗｅｒｅ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｄｅｔｅｃｔ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｒａｔｅ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｃｅｌ　ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ　ｏｆ
ＴＦＣＯＭ　ｇｒｏｕｐ　ｗａｓ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｎｏｒｍａｌ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ　ａｎｄ　Ｈ２Ｏ２ｍｏｄｅｌ　ｇｒｏｕｐ，ａｎｄ　ｃｅｌ　ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ　ｉｍｐｒｏｖｅ－
ｍｅｎｔ　ｗａｓ　ｍｏｒｅ　ｏｂｖｉｏｕｓ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ　ｏｆ　ｄｒｕｇ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ．Ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　Ｈ２Ｏ２ｍｏｄｅｌ　ｇｒｏｕｐ，ｔｈｅ
ｃｅｌ　ｇａｐ　ｗａｓ　ｎａｒｒｏｗｅｄ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｉｎｔｅｒｃｅｌｕｌａｒ　ｊｕｎｃｔｉｏｎｓ　ｗｅｒｅ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｂｏｒｄｅｒ　ｗａｓ　ｃｌｅａｒ　ｉｎ　ＴＦＣＯＭ
ｇｒｏｕｐ．ＴＦＣＯＭ　ｃａｎ　ａｇａｉｎｓｔ　ｃｅｌ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｂｙ　Ｈ２Ｏ２ ａｎｄ　ｐｒｏｍｏｔｅ　ｔｈｅ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＨＵＶＥＣ．Ｔｈｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｔｈｅ　ｌｏｗ－ｄｏｓｅ　ＴＦＣＯＭ　ｇｒｏｕｐ　ａｎｄ　Ｈ２Ｏ２ｍｏｄｅｌ　ｇｒｏｕｐ　ｈａｄ
ｎｏ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ，ｗｈｉｌｅ　ｃｅｌ　ｓｕｒｖｉｖａｌ　ｒａｔｅ　ｏｆ　ｍｅｄｉｕｍ　ａｎｄ　ｈｉｇｈ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｇｒｏｕｐ　ｗａｓ　ｇｒａｄｕａｌｙ　ｉｎ－
ｃｒｅａｓｅｄ，ａｎｄ　ｈａｄ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ（Ｐ ＜０．０１）．Ｌｏｗ，ｍｅｄｉｕｍ，ｈｉｇｈ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＴＦＣＯＭ　ｃａｎ　ｐｒｏ－
ｍｏｔｅ　ｔｈｅ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｆ　ｃｅｌ　ＤＮＡ，ａｎｄ　ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　Ｈ２Ｏ２ ｍｏｄｅｌ　ｇｒｏｕｐ，ｈａｄ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ（Ｐ ＜
０．０１）．Ｔｈｅ　ｅａｒｌｙ　ｓｔａｇｅ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｒａｔｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｎｏｒｍａｌ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ　ｗａｓ　３．４％，ｔｈｅ　ｅａｒｌｙ　ｓｔａｇｅ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｒａｔｅ
ｏｆ　Ｈ２Ｏ２ｍｏｄｅｌ　ｇｒｏｕｐ　ｗａｓ　１９．２％，ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｎｏｒｍａｌ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ　ｗａｓ　ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ
（Ｐ ＜０．０５）．Ｔｈｅ　ｅａｒｌｙ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｒａｔｅ　ｏｆ　ＴＦＣＯＭ　ｉｎ　ｌｏｗ，ｍｅｄｉｕｍ　ａｎｄ　ｈｉｇｈ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｇｒｏｕｐｓ　ｗｅｒｅ
１６．７％，１２．６％，６．１％，ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　Ｈ２Ｏ２ｍｏｄｅｌ　ｇｒｏｕｐ，ｔｈｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ　ｗｅｒｅ　ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌｙ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ（Ｐ
＜０．０５）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　ＴＦＣＯＭ　ｃａｎ　ｉｎｈｉｂｉｔ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｃｅｌ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ，ａｎｄ　ｒｅｄｕｃｅ　ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　Ｈ２Ｏ２ｏｎ　ｅｎ－
ｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｃｅｌｓ，ｃａｎ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｒｅｄｕｃｅ　ｔｈｅ　ｏｘｉｄａｔｉｖｅ　ｄａｍａｇｅ　ｏｆ　Ｈ２Ｏ２ｏｎ　ｖａｓｃｕｌａｒ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｃｅｌｓ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ＴＦＣＯＭ；ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｃｅｌ；Ｈ２Ｏ２；ｏｘｉｄａｔｉｖｅ　ｓｔｒｅｓｓ　ｉｎｊｕｒｙ
　　维药比叶 （Ｂｉｙｅ），在新疆又名别木梨，英文名
Ｑｕｉｎｃｅ，统 称 为 “榅 桲” ［１］。 榅 桲 （Ｃｙｄｏｎｉａ
Ｏｂｌａｎｇａ　Ｍｉｌｌ，ＣＯＭ）是蔷薇科 （Ｒｓａｃｅａｅ）楹椁属
（Ｃｙｄｏｎｉａ）的果树，榅桲是新疆维吾尔医药领域中
具有独特疗效、浓郁的地方民族传统药材。榅桲总
黄酮 （ＴＦＣＯＭ）为榅桲果实的提取物，榅桲果实中
含有丰富的黄酮类化合物和人体必需的微量元素，
总黄酮含量＞６０％ ［２］。以往研究结果证实，榅桲提
取物具有补脑益心、降压、降脂、降糖、抗炎、抗氧化、
调节免疫、止泻、利尿等药理作用，但对其防止心血
管系统疾病的机制研究尚未阐明［３－８］。处于功能障
碍状态下的内皮细胞能直接或间接地反映某种程度
上的氧化，同时内皮细胞损伤和功能障碍加快了动
脉硬化的发生和发展，成为动脉粥样硬化（Ａｓ）形成
的开始［９］。本实验采用体外培养细胞的方法，人脐
静脉内皮细胞 （ＨＵＶＥＣ）直接被 Ｈ２Ｏ２ 损伤并建
立模型，初步探究ＴＦＣＯＭ对 ＨＵＶＥＣ氧化损伤的
保护作用及抗凋亡功能的机制，为榅桲的进一步开
发利用提供新的理论依据。
１　试剂与仪器
１．１　主要试剂　ＨＵＶＥＣ由新疆医科大学第一附
属医院科研中心细胞室提供，过氧化氢（Ｈ２Ｏ２，批
号：ＢＣＢＮ６０３５Ｖ）、二甲基 亚 砜 （ＤＭＳＯ，批 号：
Ｑ２２５９）、四甲基偶氮唑盐 （ＭＴＴ，批号：Ｍ５１７８）、胰
蛋白酶（批号：Ｊ１５００３１）均购于美国Ｓｉｇｍａ公司，
Ｍ１９９培养基（批号：ＮＡＣ１３５５）、胎牛血清（批号：
４１Ｇ５７４１Ｋ）均为美国 Ｇｉｂｃｏ公司产品，ＰＢＳ（批号：
ＮＡＨ１４４４）、双 抗 （批 号：Ｊ１５００２３）均 为 美 国
ＨｙＣｌｏｎｅ公司产品，Ａｎｎｅｘｉｎ　Ｖ－ＦＩＴＣ／－ＡＡＤ试剂
盒（批号：４２９３７１９，为美国ＢＤ公司产品），检测周期
的试剂盒（批号：４２２０９１８，南京凯基生物科技有限公
司），Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８ 荧 光 染 色 试 剂 盒 （批 号：
２０１５１２１８），４％多聚甲醛（批号：２０１５１１０３，为博世德
生物科技有限公司产品）。
１．２　仪器　酶标仪Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ　ＰＬＵＳ（美国ＢＩＯ－
ＲＡＤ公司），ＣＯ２ 培养箱３７１型（美国 Ｔｈｅｒｍｏ公
司），超净台ＳＷ－ＣＪ－２Ｆ（上海智域分析仪器公司），
倒置显微镜ＩＸ７１－１２ＦＬ／ＰＨ（日本Ｏｌｙｍｐｕｓ公司），
离心机 ＢＲ４ｉ型（美国Ｂｅｃｋｍａｎ公司），微量进样器
（德 国 Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ 公 司），超 纯 水 仪 ＭＩＬＬＩ－Ｑ
ＢＩＯＣＥＬ（美国 Ｍｉｌｉｐｏｒｅ公司），电子天平 ＴＰ１１４
（北京Ｓｃｏｔｓｍａｎ公司），恒温水浴锅ＤＫ８Ｄ（北京永
光明医疗仪器厂），流式细胞仪ＦＡＣＳＡｒｉａＩＩ（美国
Ｂｅｃｋｍａｎ公司），全自动细胞计数仪及计数板
２Ｃ０８３５１Ｐ（Ｋｏｒｅａ）。
２　方法与结果
２．１　榅桲总黄酮的制备　榅桲叶采摘自新疆喀什
地区叶城县，榅桲总黄酮由新疆医科大学基础医学
院药理教研室制备。制备方法：榅桲叶用水洗净，
５５℃鼓风干燥４８ｈ，冷却后粉碎过筛，采用索式提
取器石油醚脱脂２ｈ，药渣挥干溶剂，真空干燥。干
燥药渣以３０倍量６０％乙醇超声提取３次，每次
４０ｍｉｎ，合并滤液，减压浓缩至浸膏状，真空干燥得
榅桲叶总黄酮粗品。总黄酮粗粉加水溶解，过滤，滤
７９６　第６期 古再努尔·买买提，等：榅桲总黄酮对过氧化氢诱导人脐静脉血管内皮细胞氧化损伤的保护作用研究
液先经ＡＢ－８型大孔吸附树脂分离、乙醇洗脱、收集
洗脱液、减压蒸馏得浓缩液。浓缩液再经聚酰胺树
脂分离、乙醇洗脱、收集洗脱液、减压蒸馏得浓缩液、
冷冻干燥后得到榅桲叶总黄酮的精制品，备用。采
用分光光度法测定其含量，榅桲总黄酮纯度＞６０％。
２．２　Ｈ２Ｏ２ 浓度的测定　采用３０％Ｈ２Ｏ２ 细胞培养
时，先用超纯水配成１ｍｍｏｌ／Ｌ的 Ｈ２Ｏ２，用 Ｍ１９９
培养液稀释使用。
２．３　ＨＵＶＥＣ的培养　从－８０℃冰箱中取出 ＨＵ－
ＶＥＣ，放进３７℃水浴锅里快速振摇，在１～２ｍｉｎ内
解冻并离心。离心后将细胞悬液移到２５ｍＬ培养
瓶中并加入５ｍＬ含１０％ＦＢＳ的 Ｍ１９９培养液，轻
轻摇匀后放入３７℃、９５％空气、５％ＣＯ２ 培养箱中
进行培养２４ｈ。在显微镜下观察细胞的生长情况，
过夜后换１次培养液。细胞生长至可传代培养细胞
时，经酶消化法加入１ｍＬ　０．２５％胰蛋白酶消化，并
按１∶２或１∶３传代。
２．４　生长曲线　取对数生长期细胞以５×１０４／ｍＬ细
胞／孔接种于９６孔板中，隔日换液，连续１０ｄ观察
细胞的生长情况。
２．５　实验方法和计量分组　待细胞生长至８０％
～９０％融合成单层时进行实验，实验设５组：正常
对照组、Ｈ２Ｏ２ 模型组（１０μｍｏｌ／Ｌ）及 ＴＦＣＯＭ 低
浓度（１０μｇ／ｍＬ）、中浓度（２０μｇ／ｍＬ）、高浓度
（４０μｇ／ｍＬ）干预组，先加 ＴＦＣＯＭ 干预２４ｈ后再
加入终浓度为１０μｍｏｌ／Ｌ 的 Ｈ２Ｏ２，继续培养４ｈ
后进行有关指标的测定。
２．６　ＭＴＴ法检测　细胞按１×１０５／ｍＬ密度接种于
９６孔板中，每孔加入含１０％ＦＢＳ的 Ｍ１９９培养液
１００μＬ，每组设６个复孔，３７℃、５％ ＣＯ２ 培养箱中
培养２４ｈ。正常对照组和 Ｈ２Ｏ２ 模型组仅加 Ｍ１９９
培养液，药物干预组分别加入不同浓度的榅桲总黄
酮干预２４ｈ后，药物干预组和 Ｈ２Ｏ２ 模型组同时每
孔加入现配制的终浓度为１０μｍｏｌ／Ｌ的Ｈ２Ｏ２ 培养
液１００μＬ，轻轻摇荡，同样条件下继续培养４ｈ；镜
下观察后每孔细胞加入终浓度为０．５ｍｇ／ｍＬ的
ＭＴＴ溶液２０μＬ，继续培养４ｈ后弃去各孔内的培
养液，每孔加入１５０μＬ的 ＤＭＳＯ溶液，充分振荡
１０ｍｉｎ，使 ＭＴＴ溶液反应的蓝紫色结晶甲瓒完全
溶解，用全自动酶标仪在４９０ｎｍ波长处检测各孔
吸光度（ＯＤ值）。实验结果以 ＯＤ值或抑制率表
示。抑制率（％）＝（对照组ＯＤ－实验组ＯＤ）／对照
组ＯＤ×１００％。
２．７　细胞周期检测　将细胞按５×１０５／ｍＬ密度接
种于小皿（分组与处理同上）。用０．２５％胰蛋白酶消
化并收集细胞，１　０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，弃上清，加
ＰＢＳ洗涤细胞２次，加预冷的７０％乙醇并均匀吹
打，制备细胞悬液，在４℃冰箱避光过夜，固定后再
次离心并ＰＢＳ清洗２次，彻底除尽乙醇。加１ｍＬ
碘化丙啶染液（ｐｒｏｐｉｄｉｎｅ　ｉｏｄｉｄｅ，ＰＩ）使细胞悬浮于
染液中，室温避光３０ｍｉｎ，染色后用３００目筛网过
滤，检测细胞周期的变化。
２．８　凋亡率检测　将细胞按１×１０６／ｍＬ密度接种
于小皿（分组与处理同上）。药物处理后的细胞弃去
培养基，加ＰＢＳ洗１次，收集细胞，加０．２５％胰蛋白
酶１ｍＬ消化，制成细胞悬液后以１　０００ｒ／ｍｉｎ离心
５ｍｉｎ，弃上清，加ＰＢＳ洗涤细胞２次，再次以同样
的条件离心。加入５μＬ　Ａｎｎｅｘｉｎ　Ｖ－ＦＩＴＣ试剂和
５μＬ　７－ＡＡＤ，轻轻震摇混匀，每管加入５００μＬ的１
×ｂｉｎｄｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒ，室温（２５℃）避光１５ｍｉｎ，染色后
用３００目筛网过滤，１ｈ内用流式细胞仪检测。
２．９　Ｈｏｃｈｅｓｔ　３３２５８荧光染色　将细胞按５×１０５／ｍＬ
密度接种于６孔板中（每孔２ｍＬ，每组设３个复
孔），细胞分组与处理同前。药物处理后的细胞弃去
培养基，加ＰＢＳ洗２次，用４％多聚甲醛 （４℃，１５～
２０ｍｉｎ）固定，弃除固定液，加ＰＢＳ洗２次，每孔加
入１ｍＬ　Ｈｏｃｈｅｓｔ　３３２５８（浓度为２０μｇ／ｍＬ）染色
液，室温避光染色１０ｍｉｎ后，荧光显微镜２００倍下
随机取３个视野（激发波长３５０ｎｍ左右，发射波长
４６０ｎｍ左右），观察各组呈蓝色细胞核的细胞、荧光
情况并进行拍照。
２．１０　生长曲线　细胞接种后的前２ｄ生长较慢，
但从第３天开始生长加快，细胞数量显著增多，第３
～４天细胞进入对数生长期，第６～７天进入平台
期。故选用第３天为最佳加药时间，见图１。
图１　ＨＵＶＥＣ生长曲线图
２．１１　ＴＦＣＯＭ对Ｈ２Ｏ２ 氧化损伤ＨＵＶＥＣ形态学改
变的影响　（１）正常对照组：细胞生长快，大小相等，
细胞质饱满透亮，呈多角形紧密连接状；贴壁坚固，
胞核完好，边界清楚，呈单层 “铺路石”状排列，没
有重叠生长现象。（２）Ｈ２Ｏ２ 模型组：经１０μｍｏｌ／Ｌ
Ｈ２Ｏ２ 作用细胞后，数量明显减少，多数损伤的细胞
出现核收缩，胞体变圆变小，间隙增宽，边界不清，胞
８９６ 新 疆 医 科 大 学 学 报 第３９卷　
膜不完整，甚至损伤破裂，贴壁能力降低，导致成片
状细胞脱落区，培养板底部可以见到细胞碎片。（３）
ＴＦＣＯＭ干预组：细胞形态介于对照组与 Ｈ２Ｏ２ 模
型组，并随着药物浓度的增高，细胞形态改善更加明
显，与 Ｈ２Ｏ２ 模型组比较细胞间隙缩小，细胞间连接
增加，边界较清楚，ＴＦＣＯＭ低、中、高浓度均可减轻
Ｈ２Ｏ２ 氧化损伤后的细胞形态和排列及增殖能力，
见图２。
正常对照组（×１０倍） 　　 Ｈ２Ｏ２ 模型组（×１０倍） 　　 ＴＦＣＯＭ高浓度组（×１０倍）
图２　ＴＦＣＯＭ对Ｈ２Ｏ２ 氧化损伤ＨＵＶＥＣ细胞形态学的影响
２．１２　ＭＴＴ法对ＨＵＶＥＣ细胞的影响　用不同浓度
的 Ｈ２Ｏ２ 刺激 ＨＵＶＥＣ，随着 Ｈ２Ｏ２ 浓度的升高细
胞存活率急剧下降，当 Ｈ２Ｏ２ 浓度达到１０μｍｏｌ／Ｌ
时，Ｈ２Ｏ２ 对 ＨＵＶＥＣ细胞造成适宜的损伤且细胞
存活率为５０％ 左右，与正常对照组相比，差异有统
计学意义 （Ｐ ＜０．０１）。因此选用浓度为１０μｍｏｌ／Ｌ
的Ｈ２Ｏ２ 进行后续实验。用ＴＦＣＯＭ低、中、高３个
不同浓度给药时，ＴＦＣＯＭ 能对抗 Ｈ２Ｏ２ 诱导引起
的细胞凋亡，能促进 ＨＵＶＥＣ增殖分化，ＴＦＣＯＭ
低浓度组变化与 Ｈ２Ｏ２ 模型组相比差异无统计学意
义，但ＴＦＣＯＭ 中、高浓度组细胞存活率逐渐增高，
差异有统计学意义 （Ｐ ＜０．０１），结果见表１。
表１　ＴＦＣＯＭ对氧化损伤的ＨＵＶＥＣ细胞
活力比较（－ｘ±ｓ，ｎ＝６）
组别 剂量／（μｍｏｌ／Ｌ） ＯＤ　 ＩＲ／％
正常对照组 － ０．１８４±０．００９ －
Ｈ２Ｏ２模型组 １０　 ０．１２１±０．００５＃＃ ３８．８
ＴＦＣＯＭ低浓度组 １０　 ０．１２８±０．００８　 ３０．５
ＴＦＣＯＭ中浓度组 ２０　 ０．１３４±０．００１＊ ２４．１
ＴＦＣＯＭ高浓度组 ４０　 ０．１４０±０．００３＊＊ １９．１
　　注：与 Ｈ２Ｏ２模型组比较，＊Ｐ ＜０．０５，＊＊Ｐ ＜０．０１；与正常对
照组比较，＃＃Ｐ ＜０．０１
２．１３　细胞周期比较结果　从细胞周期分析看，
１０μｍｏｌ／Ｌ的 Ｈ２Ｏ２ 可引起 Ｇ０／Ｇ１期细胞比值增
高，Ｓ期细胞比值下降，即细胞ＤＮＡ合成的量减少。
加入低、中、高３个不同浓度的ＴＦＣＯＭ干预后Ｇ０／
Ｇ１期细胞比值有所下降，Ｓ期细胞和Ｇ２／Ｍ 期细胞
比值有不同程度的增加，ＴＦＣＯＭ 低、中、高浓度组
与Ｈ２Ｏ２ 模型组相比，差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５
或Ｐ ＜０．０１），结果见表２、图３。
２．１４　凋亡率检测　正常对照组细胞的早期凋亡率
为３．４％，经１０μｍｏｌ／Ｌ　Ｈ２Ｏ２ 作用后模型组细胞的
早期凋亡率为１９．２％，与正常对照组相比内皮细胞
的早期凋亡率明显增加，差异有统计学意义 （Ｐ ＜
０．０５）；ＴＦＣＯＭ作用后 ＨＵＶＥＣ均能逆转 Ｈ２Ｏ２ 引
起的细胞凋亡，ＴＦＣＯＭ 低、中、高浓度组 ＨＵＶＥＣ
的早期凋亡率分别为１６．７％、１２．６％、６．１％，与
Ｈ２Ｏ２ 模型组比较差异具有统计学意义 （Ｐ ＜
０．０５），随着药物的浓度增高，凋亡率降低，且呈一定
的浓度依赖性，见图４。
表２　各组ＨＵＶＥＣ细胞周期比较（％，－ｘ±ｓ，ｎ＝６）
组别 Ｇ０／Ｇ１ Ｇ２／Ｍ　 Ｓ
正常对照组 ７５．５±２．１　 ３．６２±０．６１　 ２０．９±１．０
Ｈ２Ｏ２模型组 ６６．４±０．９＃＃ ２．６１±０．６０＃ ２０．３±０．６
ＴＦＣＯＭ低浓度组 ６２．１±２．０＊ ４．６６±０．６７　 ３２．６±１．３＊
ＴＦＣＯＭ中浓度组 ６１．３±１．１＊＊ ４．８６±０．６２　 ３４．１±１．７＊
ＴＦＣＯＭ高浓度组 ５９．９±１．１＊＊ ５．２６±０．３８＊ ３５．１±０．９＊＊
　　注：与 Ｈ２Ｏ２ 损伤组比较，＊Ｐ ＜０．０５，＊＊Ｐ ＜０．０１；与正常对照组比
较，＃Ｐ ＜０．０５，＃＃Ｐ ＜０．０１。
２．１５　Ｈｏｃｈｅｓｔ３３２５８荧光染色　Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８是
一种与ＤＮＡ特异结合并能穿透细胞膜的蓝色荧光
染料，对凋亡细胞发生染色，而对正常细胞的染色较
慢。荧光染色显示，正常细胞核呈弥散均匀荧光，凋
亡细胞因发生染色质凝聚而被浓染，可见浓染致密
的颗粒状荧光强度很高的蓝色亮点。细胞荧光染色
结果：（１）正常对照组：细胞核完整而呈椭圆形，出
现的荧光强度很弱，几乎无凋亡的细胞；（２）Ｈ２Ｏ２
模型组：加入１０μｍｏｌ／Ｌ　Ｈ２Ｏ２ 处理后，ＨＵＶＥＣ细
胞变圆，细胞核发生变化，呈核体积变小、大小不等、
染色不均匀等明显的凋亡特征，呈浓缩致密的颗粒
状或块状强度高的蓝色荧光，大部分细胞发生凋亡；
（３）ＴＦＣＯＭ干预组：经低、中、高３个不同浓度的
ＴＦＣＯＭ干预后荧光强度发生改变，随着药物浓度
９９６　第６期 古再努尔·买买提，等：榅桲总黄酮对过氧化氢诱导人脐静脉血管内皮细胞氧化损伤的保护作用研究
的增高，高浓度组荧光强度明显减弱，出现的蓝色亮
点数目变少，药物干预组凋亡细胞明显少于 Ｈ２Ｏ２
模型组。榅桲总黄酮对 Ｈ２Ｏ２ 导致的凋亡具有一定
的拮抗作用，见图５。
正常对照组 　　 Ｈ２Ｏ２ 模型组 　　 ＴＦＣＯＭ低浓度组
ＴＦＣＯＭ中浓度组 　　 ＴＦＣＯＭ高浓度组 　　
图３　ＴＦＣＯＭ对氧化损伤ＨＵＶＥＣ细胞周期变化的影响
正常对照组 　　 Ｈ２Ｏ２ 模型组 　　 ＴＦＣＯＭ低浓度组
ＴＦＣＯＭ中浓度组 　　 ＴＦＣＯＭ高浓度组 　　
图４　ＴＦＣＯＭ对氧化损伤ＨＵＶＥＣ细胞凋亡率的影响
３　讨论
内皮细胞是血管壁的主要组成部分，是细胞和
血液物质交换的第一屏障。内皮细胞通过合成、分
泌血管活性物质而调节血管内环境的稳态，如保持
血液循环通畅、血管收缩和舒张平衡、防止血小板聚
集而形成血栓。血管内皮是心血管疾病危险因子的
关键靶点，血管内皮细胞受损是导致动脉粥样硬化
的起始点，血管内皮细胞损伤的影响因素很多，其中
００７ 新 疆 医 科 大 学 学 报 第３９卷　
氧化应激引起的血管内皮细胞氧化损伤是血管内皮
功能障碍的重要因素之一，其导致的内皮细胞结构
破坏和功能障碍是造成许多心血管疾病的病理基
础［１４］。前期研究表明，ＴＦＣＯＭ 对缺血再灌注造成
的血管内皮细胞的损伤具有保护和对抗作用，且此
作用与抗炎作用和抗氧化作用有关［１５］，但对于ＴＦ－
ＣＯＭ 能否防止血管内皮细胞受损的机制尚无
报道。
正常对照组（×２００） 　　 Ｈ２Ｏ２ 模型组（×２００） 　　 ＴＦＣＯＭ低浓度组（×２００）
图５　Ｈｏｃｈｅｓｔ３３２５８荧光染色
　　ＭＴＴ法可用于研究血管内皮细胞活性与活细
胞的数目，且两者呈正比关系，而血管内皮细胞活性
的高低可以反映细胞的能量代谢与增殖情况［１６］。
本研究显示，１０μｍｏｌ／Ｌ　Ｈ２Ｏ２ 作用４ｈ诱导损伤，
使细胞存活率降低，生长缓慢，出现凋亡，凋亡率随
着过氧化氢的浓度增高而增加，而用ＴＦＣＯＭ 干预
后可以减少 Ｈ２Ｏ２ 诱导的细胞氧化损伤，提高了细
胞活力，说明榅桲总黄酮对 Ｈ２Ｏ２ 引起的氧化损伤
具有抑制作用，能使细胞凋亡率明显下降；血管内皮
细胞损伤的原因有很多，其中氧化应激是导致血管
内皮细胞损伤的主要原因，Ｈ２Ｏ２ 是一种常见的活
性氧，如果生物体内没有及时清除过氧化氢，Ｈ２Ｏ２
会轻易透过细胞膜作用于血管内皮细胞，使细胞膜
破裂、ＤＮＡ断裂、细胞器受损、并直接或间接地激活
细胞内的多条信号传导通路来调节基因的表达，造
成细胞结构和功能受损，最终引起细胞凋亡，同时使
羟自由基的产生增加，导致细胞膜脂质过氧化，使细
胞损伤而死亡［１７］。在细胞周期中，１０μｍｏｌ／Ｌ的
Ｈ２Ｏ２ 可引起Ｇ０／Ｇ１期细胞比值增加，Ｓ期细胞比
值下降，得知细胞ＤＮＡ合成减少，进入程序性死亡
期或静息期的细胞数量增多。加入不同剂量的ＴＦ－
ＣＯＭ 干预后可抑制 Ｈ２Ｏ２ 引起的变化。与此相
反，Ｇ０／Ｇ１期的细胞比例有所下降，Ｓ期细胞比例
有不同程度的增加，凋亡率显著降低，由此可见ＴＦ－
ＣＯＭ可以促进受损的内皮细胞ＤＮＡ合成，对改善
细胞分裂增殖有益。Ｈｏｃｈｅｓｔ　３３２５８荧光染色结果
显示：Ｈ２Ｏ２ 诱导的细胞凋亡经ＴＦＣＯＭ 处理后核
固缩和核碎片细胞数量显著减少，多数细胞核形态
接近正常，从形态学方面证实了 ＴＦＣＯＭ 对 Ｈ２Ｏ２
诱导的 ＨＵＶＥＣ细胞凋亡具有保护作用。
已有研究证实，氧化应激成为内皮细胞损伤和
凋亡的直接原因，是促发动脉粥样硬化、血管顺应性
改变、对缩血管性因素和扩血管性因素反应改变的
最重要因素［１８－１９］。超氧化物因阴离子和过氧化物
对动脉粥样硬化进展起了很大的促进作用，而细胞
的氧化还原状态取决于ＲＯＳ的氧化和抗氧化保护
作用，寻找具有抗氧化应激作用的药物可以达到保
护血管内皮细胞的完整性而防止动脉粥样硬化的目
的，对于动脉粥样硬化的预防和治疗有很重要的临
床意义，也是医药工作者目前必须解决的问题的之
一。具有抗氧化作用的药物可以降低或消除内皮细
胞氧化损伤，保护血管内皮细胞，并防治或预防心血
管疾病。本实验以血管内皮细胞为基础，过氧化氢
作为氧化应激诱导剂建立体外损伤模型，用榅桲总
黄酮预处理并对内皮细胞的保护作用及其机制进行
了初步探究，为榅桲总黄酮的抗氧化提供了进一步
的实验依据和理论基础，也可以为临床的开发应用
提供更可靠的科学依据。
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ｕｍｂｉｌｉｃａｌ　ｖｅｉｎ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｃｅｌｓ［Ｊ］．Ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌ　Ｒｅｓ，２００８，７５
（２）：１４４－１５４．
［收稿日期：２０１６－０３－０８］
（本文编辑　周芳）

（上接６９５页）
［６］　Ｚｈｕ　Ｑ，Ａｎｄｅｒｓｏｎ　ＧＷ，Ｍｕｃｈａ　ＧＴ，ｅｔ　ａｌ．Ｔｈｅ　Ｓｐｏｔ　１４ｐｒｏｔｅｉｎ
ｉｓ　ｒｅｑｕｉｒｅｄ　ｆｏｒ　ｄｅ　ｎｏｖｏ　ｌｉｐｉｄ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｌａｃｔａｔｉｎｇ
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ａｌ．Ｔｈｅ　ｓｐｏｔ　１４ｐｒｏｔｅｉｎ　ｉｎｈｉｂｉｔｓ　ｇｒｏｗｔｈ　ａｎｄ　ｉｎｄｕｃｅｓ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａ－
ｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｅｌ　ｄｅａｔｈ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ＭＣＦ－７ｂｒｅａｓｔ　ｃａｎｃｅｒ　ｃｅｌｓ［Ｊ］．
Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｊ，２００５，３９０（Ｐｔ１）：５７－６５．
［１０］　Ｓｕｂｉｋ　Ｋ，Ｌｅｅ　ＪＦ，Ｂａｘｔｅｒ　Ｌ，ｅｔ　ａｌ．Ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｐａｔｔｅｒｎｓ　ｏｆ
ＥＲ，ＰＲ，ＨＥＲ２，ＣＫ５／６，ＥＧＦＲ，Ｋｉ－６７ａｎｄ　ＡＲ　ｂｙ　ｉｍｍｕｎｏ－
ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｉｎ　ｂｒｅａｓｔ　ｃａｎｃｅｒ　ｃｅｌ　ｌｉｎｅｓ［Ｊ］．Ｂｒｅａｓｔ
Ｃａｎｃｅｒ（Ａｕｃｋｌ），２０１０，４（１）：３５－４１．
［１１］　Ｃｏｌｂｅｒｔ　ＣＬ，Ｋｉｍ　ＣＷ，Ｍｏｏｎ　ＹＡ，ｅｔ　ａｌ．Ｃｒｙｓｔａｌ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｏｆ
Ｓｐｏｔ　１４，ａ　ｍｏｄｕｌａｔｏｒ　ｏｆ　ｆａｔｔｙ　ａｃｉｄ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ［Ｊ］．Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ
Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ，２０１０，１０７（４４）：１８８２０－１８８２５．
［１２］　Ｚｈａｎｇ　Ｗ，Ｐｅｎｇ　Ｗ，Ｚｈａｏ　Ｍ，ｅｔ　ａｌ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ａｎｄ　ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ　ｃｒｙｓｔａｌｏｇｒａｐｈｉｃ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｔｈｙｒｏｉｄ
ｈｏｒｍｏｎｅ　ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ［Ｊ］．Ａｃｔａ　Ｃｒｙｓｔａｌｏｇｒ　Ｓｅｃｔ　Ｆ
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ｔｏｍｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ｈｅｒ２ｒｅｖｅａｌｓ　ａ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎ　ｔｏ　ｆａｔｔｙ
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ｌｉｐｉｄ　ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ　ｉｎ　ｂｒｅａｓｔ　ｃａｎｃｅｒ　ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ［Ｊ］．Ｃａｎｃｅｒ
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ｃｈｅｍｏｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ　ｆｏｒ　ｍａｍｍａｒｙ　ｃａｎｃｅｒ　ｉｎ　ｎｅｕ－Ｎ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ
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ｂｒｅａｓｔ　ｃａｎｃｅｒ：ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ａ　ｎｅｗ　ｍｏｌｅｃ－
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（本文编辑　杨晨晨）
２０７ 新 疆 医 科 大 学 学 报 第３９卷