全 文 ：第 19卷 3期 中 国 病 毒 学 19（3）：281-284
2004年 6月 VIROLOGICA SINICA June 2004

收稿日期：203-11-13，修回日期：2004-01-12
* 基金项目：科技基础性工作专项资金项目（2001DEA10004）
作者简介：梁文星（1979-），男，山东省籍，在读硕士研究生，研究方向为植物病毒分子生物学。
** 通讯作者：Corresponding author Tel: (010)62892771, E-mail: fanzf@cau.edu.cn
紫藤脉花叶病毒 cp基因在大肠杆菌中的表达及抗血清的制备*
梁文星 1，宋丽敏 1，黄金光 1，田国忠 2，李怀方 1，范在丰 1**
（1. 中国农业大学植物病理系，北京 100094； 2. 中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所，北京 100091）
Expression of the cp gene and Antiserum Preparation of Wisteria
Vein Mosaic Virus
LIANG Wen-xing 1, SONG Li-min 1, HUANG Jin-guang 1, TIAN Guo-zhong 2, LI Huai-fang 1, FAN Zai-feng 1**
(1.Department of Plant Pathology, China Agricultural University, Beijing 100094, China; 2. Research Institute of Forest Ecology,
Environment and Protection, China Academy of Forestry, Beijing 100091, China)

Abstract: The coat protein (CP) gene of the Beijing isolate of Wisteria vein mosaic virus (WVMV-BJ)
was amplified by RT-PCR, and ligated to the expression vector pET22b(+). The recombinant plasmid
pET-WVMVCP was transformed into E. coli BL21(DE3) and then induced by IPTG. It was shon that
the CP gene was highly expressed by SDS-PAGE and Western blot analysis. The molecular weight of
the recombinant protein was about 34.4kDa. Antiserum with high specificity was produced after the
rabbit was immunized with purified recombinant protein, and the titer was determined to be 1/1024 by
micro-precipitation, or 1/8192 by antigen coating plate- ELISA(ACP-ELISA).
Key words: Wisteria vein mosaic virus; CP; Prokaryotic expression; Antiserum; ELISA

摘要：采用 RT-PCR方法自紫藤脉花叶病毒北京分离物（WVMV-BJ）的基因组中分离出其 CP基因，连接到原核
表达载体 pET22b(+)上。获得的重组子 pET-WVMVCP转化大肠杆菌 BL21（DE3）后，用 IPTG进行诱导表达。
SDS-PAGE和Western blot分析表明，cp基因在大肠杆菌中获得了高效表达，融合蛋白分子量约为 34.4 kDa。将
融合蛋白纯化后免疫兔子，获得了特异性较高的抗血清。微量免疫沉淀法测定该抗血清的效价为 1/1024，酶联法
(enzyme-linked immunosorbant assay，ELISA)测定的效价为 1/8192。
关键词：紫藤脉花叶病毒；外壳蛋白；原核表达；抗血清；ELISA
中国分类号： S432.4.1;S435.131.4 文献标识码：A 文献编号：1003-5152(2004)03-0281-04

紫藤作为城市园林绿化美化的重要植物，在公
园、校园、庭院等地普遍种植。但在许多地区，紫
藤花叶病的发生和危害也很普遍。对北京地区的抽
样调查发现其平均发病率为 40％，严重的地点甚至
高达 80％以上。感病紫藤叶片表现花叶、斑驳、黄
化、脉明等症状[1]。紫藤脉花叶病的病原为紫藤脉
花叶病毒（Wisteria vein mosaic virus，WVMV），
WVMV属于马铃薯 Y病毒属(Potyvirus)。该属是种
类最多的植物病毒属,有近 200 种确定和可能的成
员[2],能侵染茄科、藜科、豆科、禾本科等的多种植
物，并经常造成重大经济损失。马铃薯Ｙ病毒属病
毒含一正单链 RNA基因组，长约 10000 nt，基因组
只包含一个开放阅读框架（ORF），进行表达时先
翻译成一大的多聚蛋白，再通过自身编码的蛋白酶
将多聚蛋白加工成 10个成熟蛋白[3]。从多聚蛋白的
Ｎ端到Ｃ端不同基因产物依次为: P1、HC-Pro、P3、
6K1、CI、6K2、NIa-VPg、NIa-Pro、NIb和 CP。
CP 在病毒的蚜传、远距离传播以及保护病毒
的 RNA不受 RNA酶分解等中起着重要作用，同时
因为其 N端区域免疫原性较强，在不同病毒间变异
282 中 国 病 毒 学 第 19卷
程度较大，因此，以 CP 为抗原制备抗体进行免疫
反应，有助于检测 Potyvirus 不同种。本实验针对
WVMV-BJ，应用 RT-PCR技术扩增了其 cp基因；
首次将此基因在大肠杆菌中进行了高效表达，并制
备了相应的特异性抗血清，从而为此病毒的血清学
检测提供了条件。
1 材料与方法
1.1 材料
提纯的 WVMV 由本实验室保存；菜豆普通花
叶病毒（Bean common mosaic virus, BCMV）抗血
清为 Agdia 公司产品；原核表达载体 pET22b(+)，
大肠杆菌 DH5α和 BL21（DE3）由本实验室提供；
DNA 回收试剂盒购自清华天为时代公司；IPTG、
NBT、BCIP试剂购自 Sigma公司；λDNA/EcoRⅠ+
Hind Ⅲ和工具酶购自大连宝生物公司；标准分子量
蛋白购自上海丽珠东风生物公司；M-MLV 为
Promega 公司产品。引物根据本实验室已测定的
WVMV-BJ 的 CP 基因的序列设计，由北京赛百盛
公司合成，上游引物 WCP5F：5′-GCC AAG CTT
TCT GAT AAA GAT AAA ATG CAA G-3′（下划线部
分为 Hind Ⅲ酶切位点），下游引物WCP3R：5′-CGT
CTC GAG TCA CTG CGG AGG TCC CAT-3′（下划
线部分为 XhoⅠ酶切位点）。
1.2 病毒 RNA的提取
以提纯的WVMV为材料，根据 Dijkstra等的
SDS-酚仿法[4]提取病毒的 RNA。
1.3 病毒 CP基因的扩增
以病毒 RNA 为模板，用引物 WCP3R 进行反
转录，42℃反应 1h [5]。以反转录产物为模板，用宝
生物公司的 Ex Taq DNA聚合酶进行 PCR扩增。反
应条件为：94℃变性 3min，94℃30s，60℃30s，72
℃50s，35个循环，然后 72℃延伸 10min。
1.4 含 cp基因的原核表达载体的构建
PCR 产物用 1%的琼脂糖进行电泳，与预期大
小相符的条带经 DNA 回收试剂盒回收后以 Hind
Ⅲ和 XhoⅠ双酶切。质粒 pET22b(+)同样用 Hind Ⅲ
和 XhoⅠ双酶切。将经酶切处理的 PCR产物及载体
进行连接，转化大肠杆菌 DH5α。经 PCR扩增和酶
切筛选出的重组子进行测序以验证阅读框架的正
确性。
1.5 cp基因的诱导表达及 SDS-PAGE分析
将读框正确的重组子及 pET22b (+) 转化大肠
杆菌 BL21，挑取单菌落于 3mL LB 液体培养基中
（含氨苄青霉素 60 µg/mL），37℃振动培养过夜后，
按 1：100稀释到新鲜的 LB液体培养基中（含氨苄
青霉素60 µg/mL），振荡培养至OD600达到0.4～1.0，
加入 IPTG至终浓度为 1mmol/L，继续于 37℃培养
3～4h。离心收集菌体，加入 1/10体积样品缓冲液，
震荡悬浮，100℃煮沸 5 min，用 12%的胶进行
SDS-PAGE分析，浓缩胶电压为 8V/cm，分离胶为
15V/cm。考马斯亮蓝 R-250 染色 1h 后，室温摇床
上脱色 3h [6]。
1.6 诱导表达产物的检测及纯化
SDS-PAGE后，电转移法转膜，丽春红 S染色
检测转移效率。转移后的硝酸纤维素膜先以 5％的
脱脂奶粉封闭，然后分别以 BCMV抗血清为一抗、
碱性磷酸酯酶标记的 A 蛋白为二抗温育，最后用
NBT / BCIP显色对表达产物进行Western blot分析
[7]。收集的菌体用抽提缓冲液重悬，反复冻融 3 次
后，12 000g离心 15min收集包含体[5]，溶解后进行
SDS-PAGE。将凝胶在染色液中染色后，从中切下
目标条带，按 1∶1的比例（W/V）加入 0.85%的生
理盐水，于冰浴中研磨，12 000g离心 10min，上清
经 0.85%生理盐水透析过夜，-20℃保存[8]。
1.7 纯化蛋白的定量及抗血清的制备
以牛血清白蛋白标准液为对照，加入考马斯亮
蓝G-250溶液后，通过测定溶液在595 nm的吸光值
对纯化产物进行定量[9]。先耳静脉取血2mL 制备少
量正常血清。向纯化产物中加入等体积的福氏不完
全佐剂进行乳化，免疫一只德国大白兔。分五次注
射：第一次肌肉注射结合皮下注射，第二次脚垫注
射，第三、四次耳静脉注射，第五次肌肉注射，每
次免疫剂量约为0.1mg，每隔7d注射一次。最后一
次注射7d后静脉少量采血测定效价，然后动脉一次
性采血，制备的抗血清加入0.02%的叠氮化钠，-20℃
保存。
1.8 抗血清效价的测定
将抗血清进行一系列稀释后，以发病紫藤叶片
汁液作为抗原包板，用 ACP-ELISA 方法测定血清
的效价[10]；同时以提纯的WVMV为抗原用微量免
疫沉淀法测定抗血清的效价[10]。
2 结果
2.1 cp的扩增
用设计的 CP基因特异性引物进行 RT-PCR，扩
增产物经 1％的琼脂糖凝胶电泳，可见大小为 850bp
的特异性扩增条带，与预期的大小相符。
2.2 重组质粒的 PCR和酶切验证
对重组质粒 pET-WVMVCP 用引物 WCP5F 和
梁文星, 等. 紫藤脉花叶病毒 cp基因在大肠杆菌的表达及抗血清的制备* 283
WCP3R 进行扩增，得到 850bp 的条带；根据以前
测序结果，在 WVMV-BJ的 cp内部靠近 C-末端处
有 PstⅠ酶切位点，用 Hind Ⅲ和 PstⅠ双酶切
pET-WVMVCP，可见 750bp 条带，与预期大小相
符，说明 cp已连接到 pET22b(+)载体上。测序结果
证明阅读框架正确。
2.3 表达产物的检测和分析
将 pET-WVMVCP 转化大肠杆菌 BL21，并进
行 IPTG 诱导表达，SDS-PAGE 后，考马斯亮蓝染
色结果表明：含 pET-WVMVCP的菌株特异地产生
了一分子量为 34.4 kDa的条带。此条带大小与预期
相符。由于 BCMV与WVMV间有血清学关系，因
此以 BCMV 抗血清对融合蛋白进行免疫检测。
Western blot显示，BCMV抗血清仅与此 34.4 kDa
的诱导表达产物反应，而与其它条带之间均无反应
（图 1），证明此条带即为所需要的产物。











图 1 表达产物的 SDS-PAGE和Western blot分析
Fig.1 The SDS-PAGE and Western blot analysis of the gene
product expressed
M, Protein Marker; A1, Proteins from E. coli cells harboring the
recombinant plasmid pET-WVMVCP induced by IPTG; A2, Proteins of E.
coli cells harboring the expression vector pET22b (+) induced by IPTG;
B1, Western blot analysis of the product of pET-WVMVCP; B2, Western
blot analysis of the product of pET22b (+).

2.4 表达产物的纯化及定量
对诱导表达后的菌体反复冻溶，高速离心后，
分别取上清和沉淀进行 SDS-PAGE，证明表达产物
主要在沉淀中，即主要以包涵体形式存在。将分离
的包涵体电泳后，对 34.4 kDa的条带切胶、研磨、
离心、透析，得到纯度较高的表达产物（图 2）。以
标准牛血清白蛋白的浓度和A595分别为横坐标和纵
坐标绘制标准曲线后，测定所纯化的表达产物的浓
度为 89.3 µg/mL。
2.5 抗血清的制备及效价的测定
将纯化的重组蛋白作为免疫原免疫大白兔，五









图 2 纯化的重组蛋白
Fig.2 SDS-PAGE analysis of the purified recombinant protein
M.Protein Marker; 1, Purified protein.

次注射后获得了 WVMV 特异性的抗血清。以
WVMV为抗原进行 ACP-ELISA，结果表明：抗血
清稀释 8192 倍后仍能明显的检测出病毒，同时抗
血清的专化性很强，与健康的紫藤汁液没有明显的
血清学反应（见表 1）。微量免疫沉淀法测得血清的
效价为 1024。
3 讨论
WVMV 在许多国家都有发生[11~15]，引起一种
世界性的病害。此病毒能明显的降低紫藤的生活力
特别是开花能力，影响其观赏性。因此，对其快速、
准确的检测就显得尤为重要。在本实验中，将
WVMV的 CP基因在大肠杆菌中进行了高效表达，
并用纯化的表达产物制备了抗血清。抗血清的制备
为 WVMV 的检测以及紫藤花叶病发生规律的研究
提供了条件。
DNA重组技术的发展使得蛋白质的生产进入了
一个新的时代。大肠杆菌表达系统具有表达量大、
周期短、易操作、成本低、高效性和稳定性等优点，
在科研生产中得到了广泛的应用。控制培养条件，
可使重组蛋白在菌体内主要以包涵体形式存在。包
涵体虽然由无活性的蛋白组成，但包涵体的形成却
大大有利于重组蛋白的生产和纯化[16]：（1）包涵体
具有高密度，易于分离纯化；（2）重组蛋白以包涵
体的形式存在有效的抵御了大肠杆菌中蛋白酶的降
解；（3）避免了重组蛋白对宿主细胞的毒害作用；（4）
包涵体主要含有重组蛋白，对其进行分离一般能得
到较高纯度的重组蛋白。本实验通过对包涵体进行
分离来纯化重组蛋白，结果获得了大量的纯度较高
的重组蛋白，为抗血清的制备提供了便利条件。
本实验以纯化的重组蛋白来制取抗血清，与传
统的以提纯的病毒制取抗血清的方法相比具有以
43.0
kDa
31.0
M A1 A2 B1 B2
43.0
31.0
kDa
M 1
284 中 国 病 毒 学 第 19卷
表 1 ACP-ELISA测定抗血清的效价
Table 1 Titer of antiserum determined by ACP-ELISA
Dilution of antiserum Antigen（1:10
diluted）
Antigen (1:100
diluted)
1/1024 1.661 0.800
1/2048 0.882 0.430
1/4096 0.483 0.216
1/8192 0.245 0.117
1/16384 0.139 0.068
Negative control 0.050 0.040
Blank control 0.009 0.006

下优点：（1）只需将含有重组质粒的菌株诱导表达
即可获得大量重组蛋白，而提纯病毒相对来讲需大
批寄主植物，且周期长；（2）纯化的重组蛋白不含
寄主植物的任何成分，所制取的抗血清特异性强。
而提纯病毒含有或多或少的寄主成分，所制取的抗
血清需用健康植物的汁液进行吸附，操作麻烦；（3）
只需少量的重组蛋白即可获得效果较好的抗血清
（本实验用量约为 500µg），而用提纯的病毒来制备
抗血清则用量较大（至少数毫克），对一些在寄主
体内含量较低或较难提纯的病毒来讲，要获得此数
量的病毒相当困难。
本研究采用多种免疫途径相结合的免疫方法。
由于兔的脚掌活动量较大，脚垫注射可使蛋白释放
较完全，皮下和肌肉注射加福氏佐剂的抗原可使抗
原缓慢释放，静脉加强注射可刺激抗体较大幅度上
升，这样多种途径结合可使免疫作用完全、高效[10]。
测定抗血清效价有多种方法，如试管沉淀反
应、微量沉淀反应、免疫扩散反应等，但其均具有
一定的局限性。除微量沉淀反应外，本实验还采用
ELISA方法测定抗血清的效价，操作简单，灵敏度
高。而且由于紫藤叶片中病毒含量较低[14]，所测得
的效价完全可以作为病毒检测中抗血清的稀释倍
数来用。因此，用 ELISA方法来测定抗血清的效价
相对而言更具有实用性。

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