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实验研究
野漆树苷对雷公藤甲素诱导肝损伤的保护作用
*
高书亮1，卢元元2，安利娟1，舒积成2，刘建群2＊＊，张 锐2，任晓静2
(1江西中医学院基础医学院，南昌 330004;2江西中医学院现代中药制剂教育部重点实验室，南昌 330004)
摘 要 目的:研究野漆树苷对雷公藤甲素诱导肝损伤的保护作用。方法:采用 DMEM 培养基培养人系 L02 肝细胞，加入
40μg /ml雷公藤甲素孵育，制备肝细胞损伤模型，继续培养 24h 后，分别加入 75、150、300μg /ml 不同剂量的野漆树苷，以及 150、
300μg /ml不同剂量的阳性对照药谷胱甘肽，继续孵育 24h后，采用MTT法测定各组细胞存活率。小鼠随机分为 6 组，分别每天给予
不同剂量药物:野漆树苷高、中、低剂量组(140、70、35mg /kg) ，阳性对照组给予 70mg /kg的甘利欣，模型组及空白对照组分别给予等
体积的蒸馏水。6d后，除空白对照组外，其余各组以 0． 625mg /kg剂量的雷公藤甲素灌胃 1 次，制备小鼠急性肝损伤模型，18h 后眼
眶后静脉取血检测血清 ALT和 AST，测定肝组织匀浆中 SOD、MDA、GSH-Px和 GST 的活性及观察肝脏病理学变化。结果:野漆树苷
300、150、75μg /ml剂量组均能显著提高雷公藤甲素损伤的人系 L02 肝细胞存活率。野漆树苷 140、70、35mg /kg 剂量组均能显著降
低雷公藤甲素所致急性肝损伤小鼠血清 ALT和 AST活性，降低肝脏 MDA含量，增强 SOD、GSH-Px和 GST活力，并能明显改善肝组
织的病理学损伤。结论:野漆树苷对雷公藤甲素诱导的肝损伤具有很好的保护作用。
关键词 野漆树苷;雷公藤甲素;肝损伤
野漆树苷(rhoifolin，芹菜素-7-O-新橙皮糖苷)是存在于化
橘红、山香圆及凤尾草等植物中的一种黄酮类成分［1，2］，具有抗
氧化、降血压和心率以及神经氨酸酶抑制作用等生物活性［3 ～ 5］。
雷公藤是目前治疗类风湿性关节炎等自身免疫性疾病最有效
的中药之一，雷公藤甲素(triptolide)是雷公藤的主要有效成分
之一，它具有显著的免疫抑制、抗炎、抗肿瘤和抗生育等作用，在
临床上主要用于治疗类风湿性关节炎、红斑狼疮、皮肤病、肾炎
和器官排斥反应等 50 多种病种［6］。但它又属于毒性很强的药
物，LD50约为 0． 8mg /kg(小鼠口服) ，急性中毒主要表现为肝损
伤、胃肠道毒性、长期毒性抑制骨髓、并损害心和肾脏等器
官［7］。雷公藤甲素的有效剂量与中毒剂量极为相近，临床用药
很不安全，这大大限制了它的临床应用。我们课题组发现凤尾
草对雷公藤甲素有很好的减毒作用，并对其诱导的肝损伤具有
较好的保护作用［8，9］，并从凤尾草中分离了野漆树苷等黄酮类
化合物［10］，本文首次报道了野漆树苷对雷公藤甲素诱导的人系
L02 肝细胞损伤以及小鼠急性肝损伤的保护作用。
1 材料与方法
1． 1 试验药物 野漆树苷由本课题组从凤尾草全草中分离
(其结构经 NMR等波谱鉴定，HPLC 面积归一化法测定纯度大
于 98%) ;谷胱甘肽(重庆药友制药有限责任公司) ;甘利欣胶囊
(连云港正大天晴制药有限公司生产)。
1． 2 动物和细胞株 昆明种小鼠，雌雄各半，体重 18 ～ 22g，由
江西中医学院实验动物中心提供，许可证号:SCXK(赣)2011-
0001;人系 L02 正常肝细胞(上海细胞所)。
1． 3 试剂 雷公藤甲素对照品(南京泽朗医药科技有限公司，
含量≥99%，HPLC测定) ;DMEM培养基(GIB-COBRL) ;噻唑
蓝(MT T ) (Fluka 公司) ;小牛血清(杭州四季青生物工程材
料有限公司) ;二甲基亚砜(DMSO) (Sigma 公司) ;胰蛋白酶
(Try psin，AM-RESCO 公司)。丙氨酸氨基转移酶(ALT)试剂
盒、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)试剂盒、超氧化物歧化酶
(SOD)试剂盒、丙二醛(MDA)试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶(
GSH-Px)试剂盒、谷胱甘肽-S转移酶(GST)试剂盒(均购自南京
建成生物工程研究所)。
1． 4 仪器 NAPCO5410 型 CO2 细胞培养箱(PRECISION SCI-
ENT IF-IC) ;Model 550 型酶标仪(BIO-RAD) ;SABA PM4000
全自动生化分析仪(意大利 AMS 公司) ;XK96-A 快速混匀器
(美堰市新康医疗器械有限公司) ;徕卡 RM2145 切片机(德国
徕卡公司) ;Sigma 2-16k高速低温离心机(Sigma公司)。
1． 5 方法
1． 5． 1 野漆树苷对雷公藤甲素诱导的肝细胞损伤的保护作用
取处于对数生长期的人系 L02 肝细胞，用胰酶消化后，调整细
胞悬液浓度为 1 × 106 /ml，以 10%小牛血清的 DMEM 培养基均
匀接种于 96 孔培养板中，每孔 100μl(边缘孔用无菌 PBS 填
充)。5%CO2，37℃孵育培养 24h 后，弃去培养液，分别加入
40μg /ml雷公藤甲素(TP) ，正常对照组除外，继续培养 24h 后，
弃去培养液，再分别加入 75，150，300μg /ml 不同剂量的野漆树
苷，及 150，300μg /ml不同剂量的阳性对照药谷胱甘肽(GSH)。
每组设 6 个复孔，另设正常对照孔和调零孔。5% CO2，37℃孵
育 24h后各孔加入 20μl 0． 5%的 MTT，37 ℃避光培养 4h。终止
培养，小心弃上清液，各孔加入 100μl DMSO，混匀，振荡器振荡
10min，使结晶物充分溶解。酶标仪在波长 490 nm 处测定其吸
光度 A值，以 A 值间接反映 L02 肝细胞在培养孔中的增殖密
度。并以正常组细胞存活率为 100%，其余组 A 值与正常组相
除计算细胞存活率。
1． 5． 2 野漆树苷对雷公藤甲素致小鼠急性肝损伤模型的影响
取 60 只小鼠，随机分为空白对照组、雷公藤甲素模型组、阳性
对照组、野漆树苷高(140mg /kg)、中(70 mg /kg)、低(35mg /kg)
剂量组，每组 10 只。阳性对照组给以 70mg /kg 的甘利欣，模型
组及空白对照组分别给以等体积的蒸馏水，其余各组在造模前
连续 6 天灌胃给野漆树苷。第 6 次灌胃给药后禁食 12h(不禁
81 中药药理与临床 2012;28(6)
* 基金项目:国家自然科学基金资助项目(编号:30960495) ＊＊通讯作者
水) ，以雷公藤甲素的 20%丙二醇混悬液按 0． 625mg /kg剂量灌
胃 1 次造模，空白对照组灌胃等体积的 20%丙二醇。造模后 18
小时(禁食不禁水)眼眶后静脉取血，3000rpm离心制备血清，然
后脱臼处死，按试剂盒操作说明检测 ALT和 AST，同时取肝脏，
称量，测定肝重指数，取同一部位肝组织 1 块，放入 10%甲醛溶
液中固定，制备切片，HE 染色，光镜观察。剩余肝脏用纯化水
冲洗，除去血液，滤纸吸干，加入预冷的生理盐水，在冰水中用匀
浆器配成 10%肝匀浆，用离心机 3500rpm离心 10min，取上清液
按试剂盒操作说明测定组织蛋白含量、SOD、MDA、GSH-Px 和
GST。AST，ALT 水平测定采用赖氏法;总蛋白测定采用考马斯
亮兰法;MDA 含量测定采用硫代巴比妥酸(TBA)比色法;SOD
含量测定采用羟胺法，GSH-Px 和 GST活性测定采用比色法。
2 结果
2． 1 野漆树苷对雷公藤甲素诱导的肝细胞损伤的保护作用
由表 1 可以看出，雷公藤甲素对 L02 肝细胞生长具有很强的抑
制作用，与文献报道的雷公藤甲素的急性毒性主要表现为肝损
伤相一致。野漆树苷高、中、低剂量组(300、150、75μg /ml)均能
显著提高雷公藤甲素损伤的人系 L02 肝细胞存活率。体外试
验结果表明，野漆树苷对雷公藤甲素诱导的人系 L02 肝细胞损
伤有极显著的保护作用，效果优于阳性对照药谷胱甘肽。
2． 2 野漆树苷对雷公藤甲素致小鼠急性肝损伤模型的影响
从表 2 可以看出，雷公藤甲素模型组肝组织匀浆中 SOD、GST、
GSH-Px水平明显降低，MDA水平明显升高，与空白组比较差异
有显著性(p ＜ 0． 05)。野漆树苷高、中、低各剂量组(140、70、
35mg /kg)均可有效降低肝损伤模型血清 AST、ALT 水平，与模
型组比较有显著性差异。野漆树苷高剂量组能显著提高 SOD、
GST、GSH-Px 水平，降低 MDA 水平，中、低剂量组也能提高
SOD、GST、GSH-Px水平，降低 MDA水平。说明野漆树苷具有较
强的抗氧化和清除自由基的作用，在提高 SOD 水平，降低 MDA
水平方面，野漆树苷高剂量组优于阳性药甘利欣组，而中剂量
组与甘利欣组效果相当(P ＞ 0． 05)。
表 1 野漆树苷对雷公藤甲素诱导的人系 L02 肝细胞损伤的影响
(珋x ± s，n = 6)
组别 剂量(μg /ml) A值 细胞存活率(%)
正常对照 1． 5240 ± 0． 0356 100． 00
模型对照 0． 1375 ± 0． 0124 9． 02
野漆树苷 75 0． 3400 ± 0． 0258 22． 31＊＊
野漆树苷 150 0． 4105 ± 0． 0454 26． 94＊＊
野漆树苷 300 0． 5002 ± 0． 0389 32． 82＊＊
谷胱甘肽 150 0． 3482 ± 0． 0431 22． 85＊＊
谷胱甘肽 300 0． 3895 ± 0． 0612 25． 56＊＊
与模型组比较 * P ＜ 0． 05，＊＊ P ＜ 0． 01(下同)
各组小鼠肝组织切片图见图 1:空白组(A)所检各鼠肝切
片右见肝小叶结构清晰正常，肝细胞无变性，无水肿，无坏死，肝
血窦未见明显淤血。小叶内及小叶间未见炎性细胞浸润及纤
维组织增生。小叶间动、静脉及胆管未见异常。肝损伤模型组
(B)肝组织呈片状坏死病灶，病灶内肝组织损伤明显，肝细胞浊
肿、气球样变性。肝细胞中度点状、碎片状坏死;坏死区内炎性
细胞浸润，汇管区内有单核细胞浸润。甘利欣组(C)病灶较模
型组明显改善;未见明显肝细胞坏死、炎性细胞浸润等肝损伤
病变;偶见肝血窦充血。野漆树苷高剂量组(140mg /kg) (D)病
灶较模型组明显改善;未见明显肝细胞坏死、炎性细胞浸润等
肝损伤病变;偶见肝血窦充血。野漆树苷中剂量组(70mg /kg)
(E)病灶较模型组明显改善;未见明显肝细胞坏死、炎性细胞浸
润等肝损伤病变;偶见肝血窦充血。野漆树苷低剂量组(35mg /
kg) (F)病灶较模型组明显改善;未见明显肝细胞坏死，偶见肝
血窦充血，局限性炎性细胞浸润等现象。肝组织切片图表明肝
损伤模型在野漆树苷给药干预下，肝组织结构出现显著的恢复
性变化，野漆树苷效果与阳性対照药甘利欣相当。动物实验进
一步确定野漆树苷对雷公藤甲素诱导的肝损伤有很好的保护
作用。
表 2 野漆树苷对雷公藤甲素所致急性肝损伤小鼠肝生化指标的影响(珋x ± s，n = 10)
组别
剂量
(mg /kg)
死亡数
AST
(U /ml)
ALT
(U /ml)
SOD
(U /mg·prot)
MDA
(umol /mg·prot)
GST
(U /mg·prot)
GSH-PX
(U /mg·prot)
空白对照 0 33． 95 ± 9． 50* 18． 27 ± 1． 24* 121． 36 ± 17． 18* 0． 95 ± 0． 16* 115． 82 ± 13． 30* 539． 27 ± 29． 37*
模型对照 0． 625 0 125． 95 ± 19． 34Δ 53． 47 ± 6． 49Δ 43． 64 ± 7． 00Δ 3． 58 ± 0． 57Δ 40． 96 ± 6． 80Δ 253． 56 ± 31． 87Δ
甘利欣 75 0 27． 43 ± 0． 87* 31． 59 ± 4． 48* 64． 97 ± 4． 15* 1． 12 ± 0． 05* 93． 57 ± 6． 50* 471． 03 ± 37． 47*
野漆树苷 140 0 31． 93 ± 3． 5* Δ 35． 81 ± 2． 02* Δ 69． 23 ± 3． 65* Δ 1． 08 ± 0． 06* 57． 87 ± 9． 79* Δ 469． 98 ± 39． 13*
野漆树苷 70 0 39． 36 ± 2． 43* 37． 94 ± 4． 38* 64． 04 ± 2． 55* 1． 19 ± 0． 05* 49． 69 ± 5． 20* 448． 80 ± 29． 01* Δ
野漆树苷 35 0 48． 43 ± 5． 20* 44． 65 ± 4． 58* 62． 77 ± 4． 54* Δ 1． 63 ± 0． 16* 49． 41 ± 4． 62* 379． 87 ± 20． 58*
与阳性对照组比较 Δ P ＜0． 05
图 1 各组小鼠肝组织 HE染色(HE ×200)
A:空白组;B:模型组;C:甘利欣组;D:野漆树苷 140mg /kg;E:野漆树苷 70mg /kg;F:野漆树苷 35mg /kg
91中药药理与临床 2012;28(6)
3 讨论
体外和体内实验结果表明野漆树苷对雷公藤甲素诱导的
肝损伤具有很好的保护作用。野漆树苷能有效降低雷公藤甲
素肝损伤模型血清 AST、ALT水平，显著提高 SOD、GST、GSH-Px
水平，降低 MDA 水平，并能明显改善肝组织的病理学损伤。
SOD、GST、GSH-Px等指标表明野漆树苷保肝机制与抗过氧化清
除自由基，促进肝细胞的再生和修复有关。野漆树苷是凤尾草
中主要黄酮成分之一，本实验结果表明野漆树苷是凤尾草降低
雷公藤甲素毒性的活性成分之一。雷公藤等含雷公藤甲素药
物可通过与野漆树苷配伍降低毒性，从而提高其临床应用的安
全性。
参考文献
1 刘晓涵，陈永刚，林励，等． 化橘红中柚皮苷和野漆树苷含量同时测
定方法的建立． 中药新药与临床药理，2010;21(6)∶ 640 ～ 642
2 章光文，周国平，谢二磊，等． 山香圆叶中黄酮类成分研究． 中国中
药杂志，2009;34(12)∶ 1603 ～ 1604
3 Kiem P，Nguyen TM，Minh C，et al． Two new c-glucosyl benzoic acids
and flavonoids from Mallotus nanus and their antioxidant activity ． Archives of
Pharmacal Research，2010;33(2)∶ 203 ～ 208
4 Occhiuto F，Circosta C，De Pasquale A，et al． Comparative hemody-
namic effects of the flavonoids rhoifolin and vitexin in the dog． Phytotherapy
Research，1990;4(3)∶ 118 ～ 20
5 杨小玲，王燕平，谢宁，等． 野漆树苷的提取方法及其制备药物用途．
中国专利:CN102633850A，20120815．
6 秦卫松，刘志红． 雷公藤甲素及其作用机制． 肾脏病与透析肾移植
杂志，2007;16(2)∶ 158 ～ 161
7 丁虹，吴建元，童静，等． 雷公藤甲素急性毒性及其机制研究． 中药
材，2004;27(2)∶ 115 ～ 118
8 刘建群，洪沁，张维，等． 凤尾草对雷公藤甲素的减毒作用． 中国医
院药学杂志，2010;30(6)∶ 443 ～ 446
9 刘建群，张维，高书亮，等． 凤尾草对雷公藤甲素致小鼠肝损伤的保
护作用研究． 中国药房，2010;21(43)∶ 4033 ～ 4035
10 舒积成，张锐，张维，等． 凤尾草中黄酮类化学成分研究． 中成药，
2012;34(6)∶ 1122 ～ 1126
Study on the protective effect of rhoifolin against hepatic injury induced by triptolide
Gao Shuliang1，Lu Yuanyuan2，An Lijuan1，Shu Jicheng2，Liu Jianqun2，Zhang Rui2，Ren Xiaojing2
(1 School of Basic Medical Sciences，Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine，Nanchang 330004;2 Key Laboratory
of Modern Preparation of TCM，Ministry of Education，Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine，Nanchang 330004)
Objective:Study on the protective effect of rhoifolin against hepatic injury induced by triptolide． Method:The protective effects of
rhoifolin at the concentration of 75，150，300μg /ml，on the in vitro damage of human L02 liver cells injured by triptolide at the concentration
of 40μg /ml were evaluated with cell survival rates，which were determined by MTT assay． Sixty mice were randomly divided into six groups
as follows:The drug groups mice were treated with rhoifolin for six day at the dose of 140，70，35mg /kg，respectively． The normal control
group and the model control group took equivalent amount of distilled water by the same route． And mice in the positive control group were
treated with 70mg /kg diammonium glycyrrhizinate． After the last administration，all groups except the normal control were administered with
triptolide at dose of 0． 625mg /kg by gavage to induce acute hepatic injury． Thereafter，the contents of ALT，AST in serum，the activities of
SOD，MDA，GSH-Px and GST in the liver were measured and the hepatic histological changes were observed by optical microscope． Re-
sults:The cell survival rates of human L02 liver cells injured by triptolide and then treated with rhoifolin at the concentration of 75，150，
300μg /ml were significantly increased． The contents of ALT，AST in serum were significantly decreased，the content of MDA in the liver was
also significantly lowered，and the activities of SOD，MDA，GSH-Px and GST in liver were significantly improved after preventive treatment
with rhoifolin at the dose of 140，70，35mg /kg． Rhoifolin can ameliorated the hepatic pathological changes． Conclusion:The protective
effect of rhoifolin against hepatic injury induced by triptolide was significant in vitro and in vivo．
Key words rhoifolin;triptolide;hepatic injury
黄连解毒汤所含黄芩苷、京尼平苷对 K562 /ADM细胞多药耐药相关基因表达的影响*
林 潇1，盛国良1，孙付军2，李贵海2＊＊
(1山东中医药大学，济南 250014;2山东省中医药研究院，济南 250014)
摘 要 目的:研究黄连解毒汤中黄酮成分对人类红白血病耐药细胞(K562 /ADM 细胞)的增殖抑制作用及相关因子表达
的影响，并对其作用机制进行初步的探讨。方法:采用 MTT 法检测黄连解毒汤中黄酮成分对细胞增殖抑制的影响，半定量 RT-PCR
02 中药药理与临床 2012;28(6)
* 基金项目:山东省自然基金资助项目(编号:Y2005C57) ＊＊通讯作者