全 文 ：江西农业学报　2007, 19(3):99 ～ 101
Acta Ag riculturae Jiangx i
反相液相色谱法测定乌桕叶中氨基酸含量
魏京广 1, 2 ,霍光华 1* ,代建国 2 ,詹五根 1 ,张 平 3
　 　收稿日期:2006 -11 -09
作者简介:魏京广(1980- ),男 ,汉族 ,山东临沂人 ,在读硕士,从事生物工程技术研究。 *通讯作者:霍光华。
(1. 江西农业大学 生物工程系 , 江西南昌 330045;2. 深圳职业技术学院生物应用工程系,广东深圳 518055;
3. 华南农业大学动物科学学院 ,广东 广州 510642)
摘　要:以邻苯二甲醛(OPA)与 9 -芴基羰酰氯(FMOC -CI)作衍生剂 , 正缬氨酸为内标 , 利用二极管阵列(DAD)可变波
长检测程序, 采用柱前衍生 RP -HPLC法测定了乌桕叶中氨基酸含量。结果表明:各种氨基酸的保留时间(Rt)、相对峰面积
(A
x
/A
I
)的 RSD均较满意 ,回收率为 93. 21% ～ 114. 24%;乌桕叶中含有大量的氨基酸, 总得含量在 1. 3000mg /mL左右, 含量
较高的是异亮氨酸( Ile )、谷氨酸(G lu)、天冬氨酸(Asp)、亮氨酸(Leu)和精氨酸(Arg),合计含量占总含量的 60%以上。 18种
氨基酸中含有的人体必需氨基酸有 7种 ,其总含量为 0. 5984mg /mL,占总氨基酸含量的 46. 03%。
关键词:乌桕叶;氨基酸;RP -HPLC;可变波长检测
中图分类号:O652. 63　文献标识码:B　文章编号:1001 -8581(2007)03 -0099 -03
Study on Determ ination ofAm inoAc ids in Chinese Tallow Leaves by RP -HPLC
WEI Jing - guang1, 2 , HUO Guang - hua1* , DA I Jian - guo2 , ZHAN W u - gen1 , ZHANG P ing3
(1. Bioenginee ring Depa rtm ent, Jiangx iAg ricultural Un iversity, Nanchang 330045, Ch ina;
2. Depa rtm ent o fApplied B iological Eng ineering, Shenzhen Poly technic Co llege, Shenzhen 518055, China;
3. Co llege of Anim a l Sciences, South Ch inaAg ricultural Unive rsity, Guangzhou 510642, Ch ina)
Abstract:The am ino ac ids in Chinese ta llow leaves w ere sepa ra ted and quantified by RP -HPLC after be ing de rived w ith O -
ph thaldialdehyde (OPA) and 9 - fluoreny lm ethy l chlo ro fo rma te(FMOC), and DAD variab le - wavelength as m easure prog ram. The
re su lts show ed that the RSD for rem aining time and A x /A I of am ino acids was sa tisfied, and the recoveries ranged from 93. 21% to
114. 24%. Chinese ta llow leaves contained plenty of am ino acids which the tota l concentration was 1. 3000m g /mL. The ma in am ino
ac ids in Ch inese tallow leaves we re Ile, G lu, Asp, Leu, and A rg, which accounted fo rm ore than 60% of to ta l am ino ac ids. The 7 es-
sential am ino acids in the 18 am ino acids go t the amount o f 0. 5984m g /mL, accounted fo r 46. 03% o f the tota l am ino acids.
Key words:Chinese tallow leave s;Am ino acids;RP -HPLC;Variable -w ave leng th measure
　　乌桕 [Sapium sebiferum(L)Roxb. ]原产我国 ,至今已
有 1500年的栽培历史 ,长期以来主要用其种子脂 ,叶没
有得到很好的开发利用。其叶具消痈肿、治癣疾 、抗病
菌 、杀害虫等效 ,另外它还是柏蚕的饲料。氨基酸是其营
养成分的重要组成部分 ,因此测定乌桕叶中的氨基酸含
量 ,对进一步开发乌桕叶具有重要的参考价值 。近年来 ,
柱前衍生 RP -HPLC法测定氨基酸技术取得了很大的
进展 ,并有逐渐取代传统氨基酸测定仪的趋势 。本文采
用 OPA与 FMOC作柱前衍生剂 ,利用 DAD可变波长检
测程序即在同一通道用 338nm和 262nm双波长检测 ,同
时检测样品中的一级和二级氨基酸 ,操作简单 ,衍生化反
应迅速 ,灵敏度高 ,少杂质干扰。
1　材料与方法
1. 1　仪器与试剂　仪器:Agilent1100高效液相色谱仪:
在线真空脱气机 ,四元梯度泵 , DAD二极管阵列检测器 ,
自动进样器 , HP -A. 09. 01化学工作站;G rant XB14超
声波清洗器 , ORION - 868酸度计 , 101C - 2电热恒温干
燥箱 , 420电热恒温水箱 , 1000电磁搅拌器 。
试剂:天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(G lu)、丝氨酸 (Ser)、
组氨酸 (H is)、甘氨酸 (G ly)、苏氨酸 (Thr)、丙氨酸
(A la)、精氨酸 (A rg)、酪氨酸(Tyr)、胱氨酸 (Cys)、缬氨
酸(Val)、蛋氨酸 (M et)、苯丙氨酸 (Phe)、异亮氨酸
(Ile)、亮氨酸 (Leu)、赖氨酸(Lys)、脯氨酸(Pro)标准品
和混合品、OPA 衍生剂购于 Agilen t公司;正缬氨酸
(ISTD)、FMOC(9 -F luorenylmetloyl ch loroformate), S igma
公司产品;甲醇 、乙腈 ,色谱纯 ,天津协和公司;三乙醇胺、
四氢呋喃、乙酸钠 ,分析纯 ,广州化学试剂厂;超纯水 (电
阻率 18. 2MΨ)。
1. 2　试验材料
1. 2. 1　试验材料　乌桕叶用超纯水洗后 ,放在 60℃烘箱
里烘干 ,粉碎机粉碎 ,储藏备用 。
1. 2. 2　试剂配制　流动相 A:0. 02mol /L醋酸钠溶液
1000mL ,加 180μL三乙醇胺 ,用 1% ～ 2%醋酸调 pH至
7. 20±0. 05,加 3mL四氢呋喃 , 0. 45μm膜过滤后 ,超声处
理 10m in 。
流动相 B:0. 02mol /L醋酸钠 (pH7. 20±0. 05)∶乙腈
∶甲醇 =1∶2∶2, 0. 45μm膜过滤后 ,超声处理 10m in。
内标 (ISTD)标准溶液:称取 58. 6mg正缬氨酸溶于
50mL 0. 1mol /L HC l溶液中 ,配成 10nmol /μL贮备液 ,于
0 ～ 4℃冰箱保存 ,使用时用 0. 1mo l /LHC l稀释至 1nmol /
μL。衍生剂邻苯二甲醛 (OPA):Agilen t试剂盒 ,浓度为
10mg /mL;衍生剂 FMOC:称取 12. 5mg溶于 5mL乙腈溶
液 。配制的衍生剂于 0 ～ 4℃冰箱保存 ,备用。
氨基酸工作曲线:将 17种混合氨基酸标准品(浓度
为 1nmol /μL),用 0. 1mol /L HC l依次稀释成 500、250、
100、25pmol /μL 5个稀释度 ,于 0 ～4℃冰箱保存 ,备用 。
17种单氨基酸标准液:称取 25 ～ 60mg单氨基酸溶
于 0. 1mo l /LHC l溶液 ,制成浓度为 10nmol /μL的标准贮
备液 ,于 0 ～ 4℃冰箱保存 ,使用时用 0. 1m ol /L HC l稀释
至 2nmol /μL。
1. 3　色谱分析条件　色谱柱 Hypersil - ODS C18柱
(5μm , 200mm ×4. 6mm , .i d. ),柱温:35℃;DAD可变波
长检测程序和流动相梯度洗脱程序分别见表 1和表 2 。
表 1　DAD可变波长检测程序
通道 时间
(m in)
样品波长
(nm)
参比波长
(nm)
A 0～ 21. 50 338 /10 390 /20
A 21. 50～ 25. 00 262 /16 324 /8
表 2　流动相梯度洗脱程序
时间 t(m in) 流动相 B(%) 流速 v(mL /m in)
0 0 0. 45
17. 00 60 0. 45
18. 10 100 0. 45
18. 50 100 0. 80
23. 90 100 0. 80
24. 00 100 0. 45
25. 00 0 0. 45
1. 4　样品处理与衍生化
1. 4. 1　样品处理 　称取样品 100mg置安瓿瓶中 ,加
6mol /L盐酸 5mL ,抽真空立即封管 ,放入烘箱 ,在 110℃
下水解 24h ,冷却后打开水解管 ,转移至小烧杯中 ,水浴
挥干盐酸 ,再用水洗数次 ,彻底挥干盐酸 ,用 0. 1mo l /L盐
酸溶解 ,并定容至 25mL, 0. 45μm滤膜过滤 ,滤液备用。
1. 4. 2　样品衍生化　用自动进样器依次吸取 6. 0μL的
0. 4mol /L的硼酸缓冲液 (pH9. 5)、1. 0μL的邻苯二甲醛
(OPA)、1. 0μL的样品 、1. 0μL的内标 (正缬氨酸 )、
1. 0μL的氯甲酸芴甲酯 (FMOC),混匀 ,衍生 ,即得。
2　结果与讨论
2. 1　工作曲线的绘制　以峰面积 /内标面积 (Ax /AI)为
纵坐标 (Y),各个标准氨基酸浓度 /内标物浓度(Cx /C I)
为横坐标 (X),制作氨基酸工作曲线 ,其线性回归方程及
相关系数见表 3。 18种氨基酸混合标准溶液的 HPLC图
谱与乌桕叶氨基酸 HPLC图谱见图 1、2。可见 ,在选定的
条件下 ,氨基酸混合标准样品和乌桕叶样品都得到了理
想的分离。
表 3　17种氨基酸的回归分析结果
氨基酸 线性回归方程 相关系数
A sp Y=1. 2548X +0. 1238044 0. 9963
G lu Y=1. 1675X +0. 1157024 0. 9960
Ser Y=1. 2565X +0. 1443354 0. 9951
H is Y=0. 6728X +0. 121449 0. 9898
G ly Y=0. 9882X +0. 0713843 0. 9975
Th r Y=1. 4190X +0. 1316393 0. 9962
A la Y=1. 2188X +0. 104276 0. 9967
A rg Y=1. 3938X +0. 1244856 0. 9964
Tyr Y=1. 2066X +0. 1011044 0. 9970
C ys Y=2. 0595X +0. 1291825 0. 9974
Val Y=0. 7423X +0. 0587519 0. 9975
Met Y=0. 7667X +0. 0666903 0. 9967
Phe Y=0. 6783X +0. 0743976 0. 9953
Ile Y=0. 6207X +0. 0491208 0. 9976
Leu Y=0. 7248X +0. 06769 0. 9965
Lys Y=0. 2771X +0. 0588899 0. 9894
Pro Y=1. 1261X +0. 1637727 0. 9891
图 1　18种氨基酸混合标准溶液的 HPLC图谱
图 2　乌桕叶氨基酸 HPLC图谱
2. 2　精密度实验　为保证分析结果的准确性 ,本文以同
一种混合标准氨基酸和同一测试样品对各种氨基酸的保
留时间 (Rt )、相对峰面积 ( Ax /AI )及其标准偏差
(RSD%)进行了分析 ,各重复 5次 ,结果显示:保留时间
的最大标准偏差 RSD出现在天冬氨酸上 (0. 1269%),其
它氨基酸均小于 0. 1%,效果满意;在相对峰面积中 ,最
大标准偏差为缬氨酸 (Ile)(5. 5277%),其次为赖氨酸
Lys(4. 5792%)和蛋氨酸 Met(4. 4807%),效果较差 ,这
可能与其衍生化反应程度或衍生物的稳定性有关。
100 江　西　农　业　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　　　19卷
2. 3　回收率实验　本文采用单点和多点加入法将各种
单氨基酸标准液定量加入分析测试样作回收率试验 ,实
验结果表明 :各种氨基酸的回收率为 93. 21% ～
114. 24%,结果令人满意 。
2. 4　乌桕叶中氨基酸的检测　检测结果见表 4。
表 4　乌桕叶氨基酸的测定结果
氨基酸 含量μm ol /m L mg /mL
Asp 1. 1591 0. 1543
G lu 1. 3181 0. 1940
S er 0. 6570 0. 0690
H is 0. 1203 0. 0139
G ly 0. 6157 0. 0462
A la 0. 2215 0. 0197
Arg 0. 6869 0. 1197
Tyr 0. 2837 0. 0514
Cys / /
Val 0. 6014 0. 0705
M et 0. 0565 0. 0084
Phe 0. 5199 0. 0859
Ile 1. 5134 0. 1985
Leu 1. 1265 0. 1478
Lys 0. 4587 0. 0671
Pro 0. 2900 0. 0334
合计 9. 7983 1. 3000
　注:Cys的含量过低,未能统计到。
从表 4中可以看出 ,乌桕叶中含有大量的氨基酸 ,总
得含量在 1. 3000mg /mL左右 ,含量较高的有异亮氨酸
(Ile )、谷氨酸(G lu)、天冬氨酸(Asp)、亮氨酸(Leu)和精
氨酸(A rg),它们合计占总含量的 60%以上。 18种氨基
酸 中含有人体必需的氨基酸 7种 , 其总含量为
0. 5984mg /mL,占总氨基酸含量的 46. 03%。
3　讨论
pH值对测试结果影响较大 ,流动相的最佳 pH值为
7. 20±0. 05, pH值小于 7. 1时 ,氨基酸出峰不完全 , pH
大于 7. 3时 ,色谱峰出峰时间会提前 ,影响分离效果。
OPA的衍化 pH应大于 8. 5,而 FMOC衍生化反应的 pH
必须大于 9. 0。
氨基酸分析应用广泛 ,传统的方法一般采用氨基酸
测定仪进行 ,目前国内已经开展了氨基酸的高效液相色
谱方法的研究工作 [ 1 ～ 4] ,效果令人满意 。本文采用 OPA
和 FMOC联合柱前衍生 ,衍生反应在 2m in内完成 ,可以
同时测得 18种氨基酸 ,是一种理想的全谱氨基酸分析
方法 。
此方法在建立过程中 ,要注意以下几个环节:样品
水解时 ,一定要水解充分 ,否则会造成出峰不全的现象;
样品衍生时应严格控制衍生的时间 ,保证衍生时间足够;
柱温不可过低 ,过低将易导致流动相中出现结晶 ,堵塞色
谱柱 ,产生柱压过高等现象 。
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(上接第 88页)
林 、草原、矿产 、水、林特产等自然资源的开发与环境管
理 ,加快自然保护区建设步伐 ,实现自然资源的持续利用
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