全 文 ：［质 量］
贴敷后祖师麻膏药中祖师麻甲素和 7-羟基香豆素的残留量测定
李 爽1， 石晓峰1，2* ， 范 彬2， 白朝辉1
(1． 甘肃中医学院，甘肃 兰州 730030;2． 甘肃省医学科学研究院，甘肃 兰州 730050)
收稿日期:2012-07-20
基金项目:甘肃省普通中医药科研课题 (GZK-2011-81)
作者简介:李 爽 (1986—) ，女，硕士生。研究方向:中药化学及中药质量标准。Tel:(0931)2614521-2110，E-mail:86-LS@163． com
* 通信作者:石晓峰 (1964—) ，男，主任药师、教授，硕士生导师。研究方向:天然药物化学。Tel: (0931)2614521-6039，E-mail:
shixiaofeng2005@ sina． com
摘要:目的 建立以高效液相色谱法测定祖师麻膏药中祖师麻甲素和 7-羟基香豆素的方法，并用于贴敷后祖师麻膏药中
药物残留量测定。方法 Agilent Eclipse Plus C18色谱柱 (4. 6 mm × 250 mm，5 μm) ;流动相为乙腈 － 0. 1%磷酸水溶液
(15 ∶ 85) ;体积流量为 1. 0 mL/min;检测波长 327 nm。6名健康志愿者签署知情同意书后分别在背部贴敷祖师麻膏药 3
贴，于 24、48、72 h各揭帖 1张，采用上述方法测定其祖师麻甲素和 7-羟基香豆素的残留量，进而计算残留率。结果
祖师麻甲素、7-羟基香豆素的质量浓度分别在 16. 8 ～ 67. 2 μg /mL (r = 0. 999 1)、5 ～ 60 μg /mL (r = 0. 999 1)范围内与
各自峰面积积分值呈良好的线性关系;平均回收率和 RSD分别为 100. 58%、100. 53%和 1. 62%、1. 74% (n = 9) ;贴敷
24、48、72 h后的祖师麻膏药中祖师麻甲素和 7-羟基香豆素的平均残留率分别为 69. 45%、53. 12%、30. 00%和 93. 23%、
88. 28%、86. 74%。结论 祖师麻膏药使用后祖师麻甲素和 7-羟基香豆素的残留较多，后者更明显存在差异。
关键词:祖师麻膏药;祖师麻甲素;7-羟基香豆素;残留量;高效液相色谱法
中图分类号:R927. 2 文献标志码:A 文章编号:1001-1528(2013)06-1209-04
doi:10． 3969 / j． issn． 1001-1528． 2013． 06． 022
Determination of residual amounts of daphnetin and 7-hydroxycoumarin in
Zushima Plaster used externally
LI Shuang1， SHI Xiao-feng1，2* ， FAN Bin2， BAI Chao-hui1
(1． Gansu College of TCM，Lanzhou 730030，China;2． Gansu Provincial Academy of Medical Science，Lanzhou 730050，China)
ABSTRACT:AIM To establish an HPLC method for the assay of daphnetin and 7-hydroxycoumarin in Zushima
Plaster and their residual amounts used externally． METHODS The determination was performed on Agilent E-
clipse Plus column (4. 6 mm × 250 mm，5 μm)with mobile phase consisted of acetonitrile and 0. 1% phosphoric
acid (15 ∶ 85)at the flow rate of 1. 0 mL /min． The detection wavelength was set at 327 nm． Six healthy volunteers
who were signed the informed consent applied three pieces of Zushima Plaster in their backs． The residual amounts
of daphnetin and 7-hydroxycoumarin in Zushima Plaster，one piece of which was tore off from each volunteers back
in 24，48，72 hours，were determined by HPLC． Then the residual rate was calculated． RESULTS The linear
ranges of daphnetin and 7-hydroxycoumarin were 16. 8-67. 2 μg /mL (r = 0. 999 1) and 5-60 μg /mL (r =
0. 999 1) ，respectively，and their average recoveries were 100. 58% (RSD of 1. 62%，n = 9)and 100. 53%
(RSD of 1. 74%，n = 9) ，respectively． The average residual rates of daphnetin and 7-hydroxycoumarin in Zushima
Plaster in 24，48，72 h were 69. 45%，53. 12%，30. 00% and 93. 23%，88. 28%，86. 74%，respectively．
CONCLUSION HPLC determination shows that the plaster leaves more residual amounts of daphnetin and 7-
hydroxycoumarin after being used externally，and the latter is comparatively abundant．
KEY WORDS:Zushima Plaster;daphnetin;7-hydroxycoumarin;residual amount;HPLC
祖师麻膏药 (国药准字 Z62020522)为国家中
药保护品种，收载于 《部颁标准中药成方制剂第
十八册》 (标准号:WS3-B-3456-98) ，由祖师麻提
取精制的浸膏粉和武威膏药组成［1］。主药祖师麻
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药材含有香豆素类、二萜类、木质素类、黄酮类、
蒽醌类及甾醇类等化学成分［2-3］。有关采用高效液
相色谱法 (HPLC)研究祖师麻药材指纹图谱［4-5］
及其主要有效成分祖师麻甲素 (7，8-二羟基香豆
素，又称瑞香素，Daphnetin)、7-羟基香豆素 (伞
形酮，又称伞形花内酯，7-Hydroxycoumarin)、紫
丁香苷 (syringin)定量测定的方法已有文献报
道［6-10］，对祖师麻膏药中祖师麻甲素和紫丁香苷测
定的 HPLC法也有文献报道［11-12］。为了评价祖师麻
膏药的透皮吸收效果，本实验采用高效液相色谱
法，建立了同时测定祖师麻膏药中祖师麻甲素和
7-羟基香豆素的方法，并通过对祖师麻膏药贴敷前
后祖师麻甲素和 7-羟基香豆素的测定，考察贴敷
后祖师麻膏药的药物残留率，希冀为祖师麻膏药的
使用和二次开发提供科学依据。
1 仪器与材料
1. 1 仪器
Agilent1120 型高效液相色谱仪 (美国安捷伦
公司) ;AE260 型万分之一电子天平 (瑞士 Mettle
Toledo公司) ;CP225D 型十万分之一电子分析天
平 (德国 Sartorius公司) ;SHZ-D 型循环水式真空
泵 (河南巩义市予华仪器有限责任公司) ;
SK3310HLC型超声波清洗器 (上海科导超声仪器
有限公司) ;766 型远红外快速干燥箱 (江苏省南
通县金余电器配件厂)。
1. 2 试药
祖 师 麻 膏 药 (10 g /张，批 号:20090809、
20111118)由甘肃泰康制药有限责任公司提供;对
照品祖师麻甲素 (供定量测定用，批号:110900-
200405)、7-羟基香豆素 (供定量测定用，批号:
111739-200501)均由中国食品药品检定研究院提
供;甲醇 (色谱纯，批号:20110627012)、乙腈
(色谱纯，批号:2010100102)均由西陇化工股份公
司提供;水为重蒸水;其他试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2. 1 样品溶液的制备
2. 1. 1 对照品溶液的制备 精密称取祖师麻甲素
对照品 4. 20 mg 和 7-羟基香豆素对照品 2. 50 mg，
各置 25 mL 量瓶中，加 40%乙醇溶解并定容，分
别配制成每 1 mL 含祖师麻甲素 0. 168 mg、7-羟基
香豆素 0. 100 mg的对照品溶液。
2. 1. 2 供试品溶液的制备 除去背衬刮取膏药上的
药物，精密称取 0. 5 g，置 50 mL 圆底烧瓶中，加入
40%乙醇 10 mL，称定质量，回流提取1 h，放置室温
后称定质量，用 40%乙醇补足减失质量，过滤。滤渣
加入 40%乙醇 10 mL，称定质量，回流提取 1 h，放
置室温后用 40%乙醇补足减失质量，过滤，滤渣再加
入 40%乙醇 2 mL 冲洗，合并滤液和冲洗液，蒸干，
残渣用 40%乙醇溶解并定容至 10 mL 量瓶中，0. 45
μm微孔滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液。
2. 1. 3 阴性样品溶液的制备 按祖师麻膏药生产
工艺制备不含祖师麻浸膏粉的样品，依 2. 1. 2 项下
操作制成阴性对照溶液。
2. 2 香豆素成分测定
2. 2. 1 色谱条件与系统适用性试验 Agilent E-
clipse Plus C18 色 谱 柱 (4. 6 mm × 250 mm，
5 μm) ;流动相为乙腈 － 0. 1% 磷酸水溶 液
(15 ∶ 85) ;体积流量 1. 0 mL /min;检测波长 327
nm;柱温 30 ℃;进样量 20 μL。分别精密吸取上
述溶液各 20 μL，注入液相色谱仪，依上述优化色
谱条件进样测定。结果样品中祖师麻甲素、7-羟基
香豆素均得到较好分离，与其相邻色谱峰分离度大
于 1. 5。理论塔板数以祖师麻甲素和 7-羟基香豆素
峰面积计算不得低于 3 000。见图 1。
1． 祖师麻甲素 2. 7-羟基香豆素 1． daphnetin 2. 7-hydroxycoumarin
图 1 对照品 (A)，阴性样品 (B)和供试品 (C)的高效液相色谱图
Fig. 1 HPLC chromatograms of reference substances (A)，negative sample (B)and sample (C)
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2. 2. 2 线性关系的考察 分别精密吸取祖师麻甲
素对照品溶液 100、150、200、250、300、350、
400 μL和 7-羟基香豆素对照品溶液 50、100、200、
300、400、500、600 μL 至 1 mL 量瓶中，用 40%
乙醇稀释至刻度摇匀，制得系列质量浓度的混合对
照品溶液。精密吸取上述对照品溶液各 20 μL，依
次进样测定峰面积。以质量浓度 (Y，μg /mL)为
纵坐标，峰面积 (X)为横坐标进行线性回归。
祖师麻甲素回归方程:Y = 1. 126 48 × 10 －6X －
0. 036 11 (r = 0. 999 1) ，线性范围 16. 8 ～ 67. 2
μg /mL。7-羟基香豆素回归方程:Y = 7. 595 17 ×
10 －7X － 1. 663 73 (r = 0. 999 1) ，线性范围 5 ～ 60
μg /mL。
结果表明，祖师麻甲素和 7-羟基香豆素在各
自的质量浓度范围内与峰面积的积分值呈良好线性
关系。
2. 2. 3 精密度试验 精密吸取祖师麻甲素对照品
溶液 300 μL、7-羟基香豆素对照品溶液 400 μL，
于 1 mL量瓶中，加 40%乙醇稀释至刻度，摇匀，
配制成祖师麻甲素、7-羟基香豆素质量浓度分别为
50. 4 μg /mL、40 μg /mL 的混合对照品溶液。精密
吸取该对照品溶液 20 μL，按上述液相色谱条件，
重复进样 6 次，测定峰面积，结果祖师麻甲素、7-
羟基香豆素峰面积积分值的 RSD 分别为 1. 33%和
1. 25%，表明仪器精密度良好。
2. 2. 4 稳定性试验 精密称取样品 0. 5 g (批号:
20090810) ，按 2. 1. 2 项下操作制得供试品溶液，
依上述色谱条件，于 0、2、4、6、8、10、12、
24 h分别进样 20 μL，测定峰面积，求得祖师麻甲
素、7-羟基香豆素峰面积积分值的 RSD 分别为
2. 58%和 2. 10%，表明供试品溶液在 24 h 内稳定
性良好。
2. 2. 5 重复性试验 精密称取同一批祖师麻膏药
0. 5 g (批号:20090810) ，共 6 份，按 2. 1. 3 项下
操作制得供试品溶液，按上述色谱条件，进样 20
μL测得祖师麻甲素的平均质量分数和 RSD 分别为
0. 691 0 mg /g和 1. 51%，7-羟基香豆素的平均质量
分数和 RSD分别为 0. 677 0 mg /g 和 1. 48%，结果
表明该方法重复性较好。
2. 2. 6 加样回收率试验 精密称取已知量 (批
号:20090810)样品约 0. 3 g，共 9 份，按样品含
有量的 80%、100%和 120%分别加入祖师麻甲素
和 7-羟基香豆素对照品溶液，按 2. 1. 2 项下操作制
得供试品溶液，依上述色谱条件下进样 20 μL，测
定峰面积，计算结果见表 1，祖师麻甲素和 7-羟基
香豆素的平均加样回收 率 分 别 为 100. 58%
(RSD =1. 62%)和 100. 53% (RSD =1. 74%)。
表 1 加样回收率试验结果 (n =3)
Tab. 1 Results of recovery test (n =3)
化学
成分
取样
量 / g
原有
量 /mg
加入
量 /mg
测得
量 /mg
回收
率 /%
RSD /
%
祖师麻 0. 290 7 0. 200 9 0. 165 8 0. 368 7 101. 21 1. 62
甲素 0. 281 3 0. 194 4 0. 165 8 0. 357 1 98. 13
0. 300 3 0. 207 5 0. 165 8 0. 377 1 102. 29
0. 298 3 0. 206 1 0. 207 3 0. 413 7 100. 15
0. 302 8 0. 209 2 0. 207 3 0. 419 1 101. 25
0. 295 3 0. 204 1 0. 207 3 0. 416 8 102. 60
0. 298 7 0. 206 4 0. 248 8 0. 456 1 100. 36
0. 288 6 0. 199 4 0. 248 8 0. 451 2 101. 21
0. 299 4 0. 206 9 0. 248 8 0. 450 7 97. 99
7-羟基 0. 290 7 0. 196 8 0. 162 5 0. 360 8 100. 92 1. 74
香豆素 0. 281 3 0. 190 4 0. 162 5 0. 357 2 102. 65
0. 300 3 0. 203 3 0. 162 5 0. 368 4 101. 60
0. 298 3 0. 201 9 0. 203 1 0. 403 5 99. 26
0. 302 8 0. 205 0 0. 203 1 0. 406 2 99. 06
0. 295 3 0. 199 9 0. 203 1 0. 403 5 102. 46
0. 298 7 0. 206 4 0. 243 7 0. 445 6 99. 34
0. 288 6 0. 195 4 0. 243 7 0. 443 5 101. 81
0. 299 4 0. 202 6 0. 243 7 0. 440 7 97. 70
2. 3 贴敷后祖师麻膏药中祖师麻甲素、7-羟基香
豆素的残留量测定
6 名健康志愿者，签署知情同意书后分别在
背部贴敷祖师麻膏药 (批号:20111118，祖师麻
甲素和 7-羟基香豆素的平均质量分数分别为
1. 217 8 mg /g、0. 738 4 mg /g)3 贴，于 24、48、
72 h各揭帖 1 张，编号后，除去背衬刮取膏药上
的药物，撕碎，备用。按 2. 1. 2 项下操作制得供
试品溶液，按上述色谱条件下，进样 20 μL 测定
峰面积，计算祖师麻膏药贴敷不同时间后祖师麻
甲素、7-羟基香豆素的残留量。依下列公式计算
祖师麻膏药贴敷后祖师麻甲素、7-羟基香豆素的
残留率，结果见表 2。
残留率 = 药物残留量
药物质量分数
× 100%
由表 2 可知，贴敷 24、48、72 h 后的祖师麻
膏药中祖师麻甲素和 7-羟基香豆素的平均残留率
分别为 69. 45%、53. 12%、30. 00% 和 93. 23%、
88. 28%、86. 74%。
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表 2 祖师麻膏药贴敷不同时间后祖师麻甲素和 7-羟基香豆素的残留量和残留率
Tab. 2 Residual amount and residual rate of daphnetin and 7-hydroxycoumarin in Zushima Plaster used for different time
序号
祖师麻甲素的残留量 /(mg·g － 1) (残留率 /%) 7-羟基香豆素的残留量 /(mg·g － 1) (残留率 /%)
24 h 48 h 72 h 24 h 48 h 72 h
1 0. 823 7 (67. 64) 0. 597 1 (49. 03) 0. 387 8 (31. 84) 0. 702 6 (95. 15) 0. 663 1 (89. 80) 0. 632 1 (85. 60)
2 0. 762 3 (62. 60) 0. 615 6 (50. 55) 0. 392 1 (32. 20) 0. 685 5 (92. 84) 0. 672 3 (91. 05) 0. 655 1 (88. 72)
3 0. 948 6 (77. 89) 0. 650 3 (53. 40) 0. 380 1 (31. 21) 0. 688 9 (93. 30) 0. 651 3 (88. 20) 0. 645 7 (87. 45)
4 0. 969 1 (79. 58) 0. 758 7 (62. 30) 0. 314 6 (25. 83) 0. 709 7 (96. 11) 0. 629 3 (85. 22) 0. 626 4 (84. 83)
5 0. 817 9 (67. 16) 0. 634 5 (52. 10) 0. 343 4 (28. 20) 0. 681 0 (92. 22) 0. 670 7 (90. 83) 0. 669 1 (90. 61)
6 0. 752 8 (61. 82) 0. 625 4 (51. 35) 0. 374 4 (30. 74) 0. 662 9 (89. 78) 0. 624 5 (84. 57) 0. 614 5 (83. 22)
平均残留量
(残留率)
0. 845 7 (69. 45) 0. 646 9 (53. 12) 0. 365 4 (30. 00) 0. 688 4 (93. 23) 0. 651 9 (88. 28) 0. 640 5 (86. 74)
3 讨论
选用文献报道的流动相如甲醇 － 0. 5%醋酸水
溶液 (25 ∶ 75)［6］、甲醇 － 0. 5% 磷酸水溶液
(20 ∶ 80)［7］、乙腈-水 (30 ∶ 70)［8］、乙腈-水
(8 ∶ 92)［11］分别考察祖师麻甲素和 7-羟基香豆素
的分离效果与色谱峰对称性，结果均不理想。而采
用乙腈 － 0. 1%磷酸水溶液 (15 ∶ 85)为流动相，
祖师麻甲素、7-羟基香豆素的色谱峰的对称性和分
离度均较好，达到理想的分离效果。
分别选用水、20%乙醇、40%乙醇、60% 乙
醇、80%乙醇、无水乙醇作为提取溶剂对祖师麻膏
药进行回流提取，以祖师麻甲素、7-羟基香豆素的
提取率为考察指标，发现 40%乙醇作为提取溶剂
提取效率较高，故以其为提取溶剂。
文献 ［13］ 报道，祖师麻膏药贴于人体使用
24 h后，药布上残留的香豆素类成分占使用前的
90%左右，贴 48 h 后有效成分仍残留 80%，表明
膏药中部分有效成分未被吸收。但是实验中测得 6
名志愿者贴敷 24、48、72 h 后的祖师麻膏药中祖
师麻甲素和 7-羟基香豆素的平均残留率分别为
69. 45%、53. 12%、30. 00%和 93. 23%、88. 28%、
86. 74%，说明祖师麻膏药中主要有效成分香豆素
类的透皮吸收率存在明显差异，这可能与其化学结
构中的羟基数量有关。
由于使用后祖师麻膏药有效成分的残留较多，
使用时可反复揭贴使用多次。考虑到使用后祖师麻
膏药中有效成分香豆素类的残留较高，可添加适当
的透皮促进剂使其发挥更大的药效。
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2013 年 6 月
第 35 卷 第 6 期
中 成 药
Chinese Traditional Patent Medicine
June 2013
Vol． 35 No． 6