全 文 ：收稿日期:2009-04-25;　修订日期:2009-08-03
基金项目:广西自然科学基金(No.054201, 0728237);
广西教育厅科研项目(No.200607MS031);
广西大学本科创新实验项目;
广西重点实验室研究基金(No.0804K021)
作者简介:金维维(1984-),男(汉族),安徽庐江人 ,现为广西大学化学化
工学院在读硕士研究生 ,学士学位 ,主要从事精细化工研究工作.
＊通讯作者简介:廖丹葵(1967-), 女(汉族),广西桂林人 , 现任广西大学
化学化工学院教授 ,博士研究生导师 ,博士学位 ,主要从事精细化工研究
工作.
蚕蛹蛋白氨基酸含量的高效液相色谱法测定
金维维 1 ,赵钟兴1 ,刘旭辉 1, 2 ,罗贞钰1 ,张　蕾 1 ,韦俏娜1 ,廖丹葵 1＊
(1.广西大学化学化工学院 ,广西 南宁　530004;　2.河池学院 ,广西 宜州　546300)
摘要:目的 建立蚕蛹蛋白氨基酸含量的测定方法。方法 采用柱前衍生反相高效液相色谱法。结果 在给定的色谱条件
下 , 18种氨基酸在 35min内获得了较好的分离 , 在一定浓度范围内 ,氨基酸的峰面积与浓度的线性相关系数在 0.990 6 ～
0.999 8之间 ,相对标准偏差为 2.02% ～ 5.45%(n=5)。并测定了蚕蛹蛋白中氨基酸的组成和含量。结论 该方法准确
可靠 、重复性好 ,可用于蚕蛹蛋白中氨基酸含量的测定。
关键词:蚕蛹蛋白;　氨基酸;　高效液相色谱法
中图分类号:R284.2　　文献标识码:A　　文章编号:1008-0805(2010)03-0537-02
DeterminationofAminoAcidsinProteinofSilkWorm byReversed-phaseHighPer-
formanceLiquidChromatography
JINWei-wei1 , ZHAOZhong-xing1 , LIUXu-hui1, 2 , LUOZhen-yu1 , ZHANGLei1 , WEIQiao-na1 , LIAODan-kui1＊
(1.SchoolofChemistryandChemicalEngineering, GuangxiUniversity, NanningGuangxi, 530004, China;
2.DepartmentofChemistryandLifeSciences, HechiUniversity, Yizhou, Guangxi, 546300, China)
Abstract:ObjectiveToestablishamethodfordeterminationofaminoacidsinproteinsofsilkworm.MethodsAreversed-
phasehigh-performanceliquidchromatographicmethodforthedeterminationofaminoacidswasdescribed.ResultsThemixture
of18 kindsofaminoacidswascharacterizedbyHPLCin36 min.Theresponsewaslinearforalaminoacidswithacorrelation
coeficientof0.990 6 ～ 0.999 8, methodprecisions(n=5)forthedifferentaminoacidswerebetween2.02% ～ 5.45% (rela-
tivestandarddeviation, RSD).Usingthismethod, 18kindsofaminoacidsinproteinofsilkwormweredetermined.Conclusion
Themethodisaccurate, reliableandrepeatableforthedeterminationofaminoacidsinproteinsofsilkworm.
Keywords:Proteinofsilkworm;　Aminoacids;　HPLC
　　蚕蛹(BombyxmoriL.)作为药用在我国有悠久的历史。现代
研究表明 , 蚕蛹具有较高的营养价值 , 其中蚕蛹蛋白是一种优质
蛋白质 , 不仅含有人体所需的 8种必需氨基酸 , 且氨基酸配比均
衡性好 , 国内已有厂家将蚕蛹水解制成复合氨基酸产品 [ 1] 。因
此测定蚕蛹氨基酸组成 ,对以蚕蛹蛋白为原料进一步开发功能产
品具有重要的参考价值。
目前 , 对氨基酸的测定除采用氨基酸自动分析仪外 [ 2] , 柱前
衍生反相高效液相色谱法测定氨基酸的技术也得到了很大的发
展 , 且具有快速灵敏 、不需专用仪器等优点 [ 3] 。 高效液相色谱法
分析氨基酸时常用的柱前衍生试剂如 OPA(邻苯二甲醛)、DAN-
SYL Cl(丹磺酰氯)、FMOC(9-芴甲基氯甲酸酯)和 PITC(异硫
氰酸苯酯)等各有优点和缺陷 [ 4～ 6] 。其中因为 OPA衍生步骤简
单 , 反应速度快 , 剩余试剂不干扰测定 , 衍生物可用紫外 、荧光
或电化学检测器检测 , 故其应用最广 ,但由于不能和仲氨酸反应 ,
而 FMOC能与仲氨酸反应 ,因此将 OPA-FMOC联用可克服两者
单独使用时的缺点。本实验以 OPA及 FMOC为柱前衍生化试
剂 , 利用二极管阵列(DAD)在同一通道用 338nm和 262nm双波
长检测 , 同时检测样品中的一级和二级氨基酸 , 建立了蚕蛹蛋白
质氨基酸分析的方法 。
1　仪器与试剂
Agilent1100高效液相色谱仪 , 配四元泵及真空在线脱气机 ,
美国安捷伦科技有限公司产品;CSF-1型超声波清洗器 ,上海超
声波仪器厂产品;101AS-2型电热恒温干燥箱 ,上海实验仪器有
限公司产品。
18种氨基酸标准品 、9 -芴甲基氯甲酸酯(FMOC)为进口
分装产品;3 -巯基丙酸(3 -MPA)由 AlfaAesar公司 , 邻苯二
甲醛 , 醋酸钠 , 三乙胺等为国产分析纯 , 上海国药试剂有限公
司产品;甲醇 , 乙腈 , 四氢呋喃为色谱纯 , 天津四友色谱试剂厂
产品。
2　方法
2.1　试剂配制 流动相 A:20 mmol/L醋酸钠缓冲液(含 0.5%四
氢呋喃及 0.3‰三乙胺 , pH=10.3), 0.45 μm滤膜过滤 , 备用;流
动相 B:甲醇;流动相 C:乙腈。衍生剂 A(OPA试剂):取 270 mg
OPA试剂 , 溶于 2ml无水乙醇中 , 加入 100 μl3-巯基丙酸 , 0.2
mol/L硼酸缓冲液(pH10.8)定容至 50 ml, 4℃避光保存。衍生
剂 B(FMOC试剂):取 10 mgFMOC试剂 , 乙腈定容至 10ml。 氨
基酸标准溶液:18种氨基酸标准品各 25 mg, 0.1 mol/LHCl溶解
定容至 25ml, 摇匀 , 4℃保存。
2.2　水解 称取适量经一次脱脂的蚕蛹(约含蛋白质 50 mg)于
安瓿瓶中 , 加入 6 mol/LHCl5 ml, 抽真空封口 ,于 110℃水解 24
h,开口后在真空干燥器中去酸 , 定容至 25ml, 冷冻保存。因某些
氨基酸如色氨酸 、组氨酸等在酸性条件下容易被破坏 [ 7] , 需另取
一定量的样品经 6 mol/LNaOH于安瓿瓶中真空水解 24 h, 6
mol/LHCl中和 , 定容至 25 ml,冷冻保存。
2.3　衍生 分别取 20μl氨基酸标准液和样品水解液置于 2ml的
Eppendorf管中 ,加入 70μl的衍生剂 A和 10μl的衍生剂 B, 振荡
2 min后 , 经 0.22 μm过滤膜过滤后进样。
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LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH2010 VOL.21 NO.3 时珍国医国药 2010年第 21卷第 3期
2.4　色谱分析条件 色谱柱为 AgilentEclipseAAA氨基酸分析
柱(4.6 mm×150 mm, 5 μm), DAD二极管阵列检测器 , 1 ～ 32
min检测波长为 338 nm, 32 min后检测波长为 262 nm, 柱温为
35℃, 按在表 1中的条件进行梯度洗脱。
表 1　流动相梯度洗脱程序
时间t/min 流动相 A(%) 流动相 B(%) 流动相 C(%)流速 v/ml· min-1
0.0 100 0.0 0.0 0.6
4.0 98.0 1.0 1.0 0.6
10.0 92.0 4.0 4.0 0.8
35.0 55.0 25.0 20.0 1.0
40.0 55.0 25.0 20.0 1.0
2.5　样品的定性与定量 样品的定性采用保留时间法 , 即在相
同的色谱分析条件下 ,样品中氨基酸的色谱峰与氨基酸标准的色
谱峰保留时间相同或者相近 , 则认为样品中含有此氨基酸。样品
的定量采用标准曲线法 ,即配制一定浓度氨基酸混合溶液 , 得出
各氨基酸与其峰面积之间的线性回归方程 ,在同样的色谱分析条
件下 , 对样品中的氨基酸进行分析 , 根据峰面积与线性回归方程
得出样品中氨基酸的浓度 [ 8] 。
3　结果
3.1　氨基酸混合标准样品的分析结果 在流动相(A)中加入适
量的四氢呋喃(THF)可显著改善氨基酸的 OPA衍生物在 Eclipse
AAA柱上的分离效果 [ 8] 。加入三乙胺可显著改善峰型并减小峰
宽 , 降低实验误差 ,经多次实验确定 THF和三乙胺的最佳加入量
分别为 0.5%和 0.03%。
　　由于OPA衍生一级氨基酸 , FMOC衍生二级氨基酸 , 将 18种
氨基酸混合标准溶液衍生化后按表 1的色谱条件进样分析 。结
果见图 1。
1 -Asp　2 -Glu　3 -Ser　4 -His　 5-Gly　6 -Thr　7-Ala
8-Arg　 9-Tyr　 10-Cys　 11-Val　12 -Met　 13-Trp
14 -Phe　 15-Ile　 16-Leu　17-Lys　 18 -Pro
图 1　氨基酸标准混合液高效液相色谱图
取不同浓度的氨基酸标准溶液进行衍生和分析 ,以峰面积为
纵坐标 ,氨基酸的进样量为横坐标 , 作标准曲线。各氨基酸的标
准曲线及其它结果见表 2。 18种氨基酸混合标准溶液连续 5次
进样分析 , 各氨基酸保留时间的相对标准偏差为 0.05% ～
3.0%,峰面积的相对标准偏差在 1.9% ～ 5.4%之间。结果表
明 , 每种氨基酸进样量在 0.04 ～ 0.3μg范围内时 , 其线性相关系
数在 0.990 6 ～ 0.999 8之间 ,具有良好的线性关系 ,由于利用 E-
clipseAAA氨基酸专用分析柱分离 , 与 ODS通用色谱柱相比 , 其
分离效果和稳定性更好 [ 9]。
表 2　氨基酸的保留时间 、线性范围 、回归方程 、相关系数及精密度
氨基酸 保留时间 t/min 回归方程 相关系数 R2 线性范围 m/μg RSD＊(%)
Asp 2.168 Y=4 910.9x-28.276 0.994 9 0.039 2 ～ 0.3136 3.99
Glu 2.465 Y=4 889.7x-64.485 0.995 8 0.035 2～ 0.281 6 3.04
Ser 6.627 Y=4 637.5X-18.971 0.996 6 0.038 4～ 0.307 2 2.02
His 8.885 Y=2 570.4X-40.157 0.997 7 0.047 2～ 0.377 6 5.20
Gly 9.191 Y=5 226.5X-71.912 0.999 7 0.040 8～ 0.326 4 4.87
Thr 9.965 Y=3 116.6X+90.976 0.992 6 0.038 4～ 0.307 2 3.66
Ala 12.488 Y=4 350.1X-2.9974 0.999 8 0.036 8～ 0.294 4 3.01
Arg 13.852 Y=1 975.3X-5.493 8 0.999 5 0.042 4～ 0.339 2 2.35
Tyr 16.442 Y=1 940.5X+4.8221 0.998 0 0.039 2 ～ 0.313 6 3.93
Cys 18.943 Y=3 870.8X+4.923 8 0.993 5 0.038 4～ 0.307 2 1.96
Val 19.673 Y=3 729.2X-12.560 0.999 0 0.038 4～ 0.307 2 3.48
Met 20.158 Y=2 939.9X-4.175 4 0.998 2 0.036 8～ 0.294 4 3.17
Trp 22.397 Y=1 580.5X+15.485 0.997 8 0.027 2～ 0.217 6 4.76
Phe 22.638 Y=2 401.1X-17.790 0.995 0 0.040 0～ 0.320 0 2.63
Ile 23.042 Y=3 001.8X-8.207 4 0.999 6 0.038 4～ 0.307 2 2.65
Leu 24.643 Y=2 986.5X+11.648 0.999 3 0.036 0～ 0.288 0 2.26
Lys 31.407 Y=2 683.2X-31.548 0.994 0 0.038 4～ 0.307 2 4.30
Pro 34.940 Y=8 233.8X+19.377 0.990 6 0.039 2～ 0.313 6 5.45
　　＊ n=5
3.2　样品分析及结果 在与氨基酸混合标样相同的实验条件下 ,
进行蚕蛹蛋白盐酸水解液和氢氧化钠水解液的样品分析 , 图 2为
酸解蚕蛹蛋白的氨基酸液相色谱图 ,通过标准曲线计算出蚕蛹蛋
白中氨基酸的含量如表 3。实验结果表明蚕蛹蛋白中的 18种氨
基酸在其色谱条件下除色氨酸和苯丙氨酸外完全分离。
从表 3可知蚕蛹蛋白中 18种氨基酸的含量都在 15 mg/g蛋
白质以上 , 品种齐全 , 8种必需氨基酸缬氨酸 、蛋氨酸 、异亮氨酸 、
苯丙氨酸 、亮氨酸 、色氨酸 、苏氨酸 、赖氨酸占总量的 60%, 且必
需氨基酸和 l8种氨基酸的配比的含量均符合联合国粮农 /世界
卫生组织(FAO/WHO)所规定的理想蛋白质模式 [ 10] 。同时蚕蛹
蛋白中非极性氨基酸丙氨酸 、缬氨酸 、亮氨酸和甘氨酸含量占总
氨基酸含量的 27.5%, 芳香氨基酸苯丙氨酸 、色氨酸和酪氨酸含
量占总氨基酸含量的 13.8 %, 这两类氨基酸组成共占氨基酸总
组成的 41.3%。对于以蛋白质为原料开发如降血压肽等功能食
品 ,若选择蚕蛹蛋白为原料 ,就一般规律而言 , 有可能得到高活性
的降血压肽。
图 2　酸解蚕蛹样品中氨基酸的高效液相色谱图
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时珍国医国药 2010年第 21卷第 3期 LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH2010 VOL.21 NO.3
表 3　蚕蛹蛋白中的氨基酸含量 mg· g-1
氨基酸 含量 氨基酸 含量
Asp 84.07 Val 48.85
Glu 92.00 Met 26.30
Ser 30.47 Trp 33.39
His 26.39 Phe 41.16
Gly 16.79 Ile 37.94
Thr 30.62 Leu 54.78
Ala 43.81 Lys 127.10
Arg 50.29 Pro 16.76
Tyr 45.22
Cys 63.36 总计 869.29
4　结论
建立了 OPA和 FMOC试剂联用柱前衍生的高效液相色谱分
析方法 , 在 35min内 18种常见氨基酸可获得较好的分离。 用峰
面积定量计算其重复性和精密度较好。
在相同实验条件下 ,检测了蚕蛹蛋白质中氨基酸的组成和含
量 , 表明蚕蛹蛋白氨基酸品种齐全 , 必需氨基酸和 l8种氨基酸的
配比的含量均符合联合国粮农 /世界卫生组织(FAO/WHO)所规
定的理想蛋白质模式 ,蚕蛹蛋白中非极性氨基酸和芳香氨基酸含
量占氨基酸总组成的 41.3%, 可作为开发功能食品的优质原料。
参考文献:
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收稿日期:2009-03-17;　修订日期:2009-08-12
基金项目:江西省自然科学基金(No.2007GQY0114)
作者简介:李辉敏(1974-),女(汉族),江西九江人 ,现任九江学院基础医
学院副教授 ,硕士学位 ,主要从事药品质量控制工作.
复叶耳蕨地上部分微量元素锌铁铜锰含量测定
李辉敏 ,张　磊
(九江学院 ·基础医学院 ,江西 九江　332000)
摘要:目的 测定复叶耳蕨地上部分微量元素 Zn, Fe, Cu, Mn的含量。方法 利用微波消解法处理样品 , 火焰原子吸收分
光光度法测定 。结果 复叶耳蕨地上部分 Zn, Fe, Cu, Mn含量分别为 175.51, 286.91, 14.38, 78.84μg/g。结论 复叶耳蕨
地上部分含有丰富的 Zn, Fe, Cu, Mn,该方法简便 , 结果准确可靠 , 可用于实际样品的测定。
关键词:原子吸收分光光度法;　微波消解;　复叶耳蕨;　微量元素
中图分类号:R284.2　　文献标识码:A　　文章编号:1008-0805(2010)03-0539-02
DeterminationofContentsofTraceElementsinAerialPartsofArachniodesexilis
LIHui-min, ZHANGLei
(MedicalSchool, JiujiangColege, Jiujiang, Jiangxi332000 , China)
Abstract:ObjectiveTodeterminethecontentsoffourtraceelementsofZn, Fe, CuandMninaerialpartsofArachniodesexi-
lis.MethodsThesamplesweredigestedwithmixedacidofHNO3 andH2O2 bymicrowavedigestion.FAASmethodwasestab-
lishedforthedeterminationofZn, Fe, CuandMninthesamples.ResultsThecontentsofZn, Fe, CuandMnwere175.51,
286.91, 14.38, 78.84μg/ginaerialpartsofArachniodesexilis.ConclusionThereareplentyofZn, Fe, CuandMninaerial
partsofArachniodesexilis.Thismethodissimpleandreliableandcanbeusedforthedeterminationofpracticalsamples.
Keywords:FAAS;　Microwavedigestion;　Arachniodesexilis;　Traceelements
　　微量元素在生物体内的作用日益受到人们的重视。它们在
生物体内成为某些酶 、激素和维生素的主要组成部分 , 在人体的
代谢中起着重要作用 。Zn是人体上百种酶的组成部分和激活因
子 , 对体内的免疫功能起调节作用 , 并能通过酶系统发挥对机
体代谢的调节和控制 , 还起到抗菌抗病毒作用;Cu, Fe是人体必
需的微量元素 , 参与机体多种代谢活动和生理过程 , 可增强机
体免疫力 , Fe是血红蛋白中氧的携带者 , 也是很多酶的活性部
分;Zn, Mn对神经系统机能和结构发挥重要作用。 有些微量元
素如 Fe, Cu, Zn, Mn, Co等比例失调与许多疾病如癌症 、心血管疾
病 、瘫痪的发生及人体衰老有着密切的关系。有些微量元素的缺
乏将导致生殖机能下降和中枢神经感觉障碍 [ 1] 。对微量元素含
量的研究有助于全面了解中草药的生理活性。复叶耳蕨 Arach-
niodesexilisChing为鳞毛蕨科复叶耳蕨属植物 ,广泛分布于世界
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LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH2010 VOL.21 NO.3 时珍国医国药 2010年第 21卷第 3期