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乳酸菌发酵黄浆水的抗氧化研究



全 文 :China Brewing
2013 Vol.32 No.7
Serial No.256
收稿日期:2013-05-26
基金项目:广东省科技攻关项目(2011B020310004)
作者简介:杜 欣(1986-),女,硕士研究生,研究方向为粮食、油脂及植物蛋白工程;李 理*,教授,通讯作者。
我国是大豆的故乡,有着上千年的大豆种植和食用的
历史,大豆制品品种多、消费量大,近年来,随着大豆多种
生理活性成分的阐明,大豆食品在世界范围内获得了消费
者的普遍青睐。其中大豆异黄酮具有很强的抗氧化活性,
特别是经过微生物的发酵作用,糖苷型的异黄酮转化为苷
元型的异黄酮,抗氧化活性进一步增强[1-2]。
黄浆水是豆腐制造过程中产生的废水,在豆腐加工过
程中加入约10倍于大豆干重的水来研磨成浆,其中约有
1/2~1/3的水在随后的加工过程中被沥出[3],因其含有较高
含量的低聚糖、异黄酮以及少量的蛋白质等成分,直接排
放一方面造成资源的浪费,另一方面严重污染环境。益生
菌具有发酵产酸及整肠等多种益生功能,对维持人体肠道
微生物的良好生态平衡及其富贵病的防治有重要意义,
是当前的研究热点[4-5]。有研究表明,黄浆水中的低聚糖等
益生元可以促进小鼠盲肠发酵以及矿物质营养的平衡[6],
经过发酵的黄浆水会产生ACE抑制活性等[7]。本课题组的
前期研究表明潜在益生菌鼠李糖乳杆菌能够在黄浆水中
生长产酸[7],本项目拟在此基础上进一步研究嗜酸乳杆菌
和鼠李糖乳杆菌对黄浆水的利用情况,并分析比较黄浆水
和发酵黄浆水的体外抗氧化能力,为黄浆水的开发和应用
寻找新的途径。
1 材料与方法
1.1试验材料
1.1.1原料与试剂
黄浆水:由广州市豆腐制造企业提供;
鼠李糖乳杆菌(Lactobacilusrhamnosus6013),嗜酸
乳杆菌(Lactobacilusacidophilus20272):购于中国工业微
生物菌种保藏管理中心。
MRS培养基:蛋白胨10g,葡萄糖20g,酵母浸膏5g,乙
酸钠5g,柠檬酸氢二铵2g,牛肉膏10g,Tween-80 1mL,
K2HPO42g,MnSO4·4H2O 0.25g,M SO40.25g,蒸馏水
1000mL,pH=7.2。
TPTZ,DPPH,ABTS,菲洛嗪和生育酚(Trolox)购买
于美国西格玛公司;其他试剂均为分析纯级别。
乳酸菌发酵黄浆水的抗氧化研究
杜 欣,李 理*
(华南理工大学 轻工与食品学院,广东 广州 510640)
摘 要:应用鼠李糖乳杆菌和嗜酸乳杆菌发酵豆腐黄浆水,分析了黄浆水和发酵黄浆水还原三价铁、清除DPPH和ABTS+自由基以及
螯合二价铁的能力。结果表明,嗜酸乳杆菌发酵黄浆水的还原力最强,显著高于鼠李糖乳杆菌发酵的黄浆水和未发酵的黄浆水;经过
发酵的黄浆水清除DPPH和ABTS+自由基的能力明显大于未发酵黄浆水,但是菌种和发酵时间影响不大;螯合二价铁的能力依次为
鼠李糖乳杆菌发酵的黄浆水>嗜酸乳杆菌发酵的黄浆水>未发酵黄浆水,且延长发酵时间能提高其螯合二价铁的能力。
关 键 词:黄浆水;酸浆水;鼠李糖乳杆菌;嗜酸乳杆菌;抗氧化能力
中图分类号:TS201.3 文献标识码:A 文章编号:0254-5071(2013)07-0024-04
AntioxidantactivitiesofTofuwheyfermentedbylacticacidbacteria
DUXin,LILi*
(ColegeofLightIndustrialandFoodScience,SouthChinaUniversityofTechnology,Guangzhou510640,China)
Abstract:Thisresearchdiscussedtheantioxidantproperitiesofunfermentedandfermentedtofuwheys.Theantioxidantactivitieswereexaminedby
ferricreducingantioxidantpower,scavengingeffectonDPPHandABTS,andchelatingeffectonferrous.Theresultsindicatedthatthetofuwheyfer-
mentedbyLactobacilusacidophilushadthestrongestreducingpoweramongthetofuwheyfermentedbyLactobacilusrhamnosusandtheto uwhey
itself. The fermented tofu wheyhad stronger scavenging effect on DPPH and ABTS than unfermented soybean whey, but there were no significant
difference between strains and fermentation time. The order of chelating effect on ferrous was followed by: tofu whey fermented byLactobacilus
rhamnosus>tofuwheyfermentedbyLactobacilusaciophilus>unfermentedtofuwheys,andthe chelatingpower could be improved significantly
byextendingfermentationtime.Thisresearchconfirmedthatbothunfermentedandfermentedtofuwheyallhadantioxidantactivities,whichprovid-
edanewdirectionforfurtherusingoftofuwhey.
Keywords:soybeanwhey;fermentedtofuwheys;Lactobacilusrhamnosus;Lactobacilusacidophilus;antioxidantactivities
ResearchReport24· ·
中 国 酿 造
2013年 第 32卷 第 7期
总第 256期
1.1.2仪器
UV230紫外分光光度计,JJ500型电子天平,LDZX-
30KBS立式压力蒸汽灭菌器,SZX超净工作台,PYX-190S-A
生化培养箱等。
1.2实验方法
1.2.1发酵剂的制备
在黄浆水中加入1%的蔗糖和1%的浓缩乳清蛋白[8],
115℃灭菌10min后作为培养基,无菌环境下分别接入活化
好的鼠李糖乳杆菌6013和嗜酸乳杆菌20272,培养22h后即
为母发酵剂;母发酵剂在上述培养基中转接2~3次即可作
为工作发酵剂。
1.2.2黄浆水的发酵实验
将黄浆水于115℃条件下灭菌10min,然后在无菌环境
中接种工作发酵剂,30℃恒温培养12h和36h。
1.2.3 pH值和酸度值的测定
使样品恢复室温,直接用SevenEasypH(S20)计测定
样品的pH值;采用GB/T5009.46-2010方法测定酸度值,用
涅尔度°T表示。
1.2.4体外抗氧化能力的测定
(1)还原三价铁的能力(FRAP)测定
还原三价铁能力的测定方法参考Benzie和Strain[9]建
立的方法:用40mmol/L的HCl溶液配制浓度为10mmol/L的
TPTZ溶液,然后将2.5mL的TPTZ溶液,2.5mL的FeCl3·6H2O
溶液(20mmol/L)和25mL的醋酸盐缓冲液(300mmol/L,
pH3.6)混合,制备得到FRAP溶液。配制不同浓度的样品
或者生育酚100μL,加入3mL的FRAP溶液,在37℃下放
置10min,于593nm处测定吸光度值。通过标准曲线方程
y=0.0014x+0.0353,r2= 994(y:吸光度值,x:生育酚浓度
μmol/L),将结果表示为mM生育酚/mL样品。
(2)清除DPPH和ABTS+能力测定
清除DPPH自由基能力的测定方法参考Brandwilliams
等[10]建立的方法:配制不同浓度的样品或者生育酚2mL,
加入2mL的DPPH乙醇溶液(0.2mmol/L),振荡摇匀,在室
温下放置30min后,于517nm处测定吸光度值。通过标准
曲线方程为y=-0.0162x+1.0339,r2=0.999(y:吸光度值,x:
生育酚浓度μM),将结果表示为μM生育酚/mL样品。
清除ABTS+能力的测定方法参考Re[11]建立的方法:
配制含有7mmol/L的ABTS溶液和2.45mmol/L的过硫酸钾
的ABTS+溶液,使用前在黑暗室温环境中放置12h~16h。
用乙醇稀释ABTS+溶液,使其在734nm处的吸光度值
为(0.70±0.02)。配制不同浓度的样品或者生育酚30μL,
加入3mL稀释后的ABTS+溶液,在室温下反应6min,于
734nm处测定吸光度值。通过标准曲线方程y=-0.0003x+
0.6995,r2=0.997(y:吸光度值,x:生育酚浓度μM),将结果
表示为mM生育酚/mL样品。
(3)螯合二价铁能力测定
螯合二价铁能力的测定方法参考Dinis等[12]建立的方
法:配制不同浓度的样品或者生育酚3mL,加入50μL的Fe-
Cl2溶液(2mmol/L)和100uL的菲洛嗪溶液(5mmol/L),混
合均匀,在室温下反应20min,于562nm波长测定吸光度
值。螯合Fe2+能力的计算公式如下:
螯合Fe2+能力(%)=(1-
A2-A1
A0
)×100
式中:A0为用水做空白对照的吸光度值,A1为无菲洛嗪时
样品的吸光度值,A2为样品的吸光度值。
1.2.5数据处理与分析
采用SPSS17.0和Excel2010分析处理实验数据。所有
试验都有三组平行样品,实验数据表示为“平均值±标准
偏差”的形式,显著性差异通过一维方差分析(ANOVA)
和Duncan多项极差检验法分析得到。
2 结果与分析
2.1发酵黄浆水的pH值和酸度值的变化
据报道黄浆水中的固形物含量约为2.5g/100mL,主要
是蛋白质、小分子糖类以及一些生物活性物质[13],适合于
微生物的生长。pH值和酸度值可以反映乳酸菌发酵黄浆
水后形成的游离H+和有机酸的变化情况。从表1可以看出,
鼠李糖乳杆菌和嗜酸乳杆菌均能在黄浆水中生长,并且利
用碳源生长产酸,降低黄浆水的pH值,增加其酸度值。随
着发酵时间的延长,酸度值显著增加,但是这两个菌种在
产酸能力上没有显著性差异。
2.2黄浆水的抗氧化能力
2.2.1还原三价铁的能力(FRAP)
在pH值较低的环境中,Fe3+-TPTZ复合物能够被还原
成Fe2+-TPTZ的形式,呈现出蓝色,并且在593nm处有最大
吸光度值。蓝色越深,吸光度值越大,说明还原能力越强[9]。
从表2可以看出,随着浓度的增大,黄浆水的还原能力
增强,且差异显著。当黄浆水的浓度达到25%时,在相同浓
度时,发酵黄浆水的还原能力大于未发酵黄浆水,其中鼠
李糖乳杆菌发酵黄浆水的还原能力和未发酵黄浆水没有
显著差异,而嗜酸乳杆菌发酵黄浆水的还原力明显较强。
同种菌种发酵黄浆水时,延长发酵时间,可以增强其还原
表1 发酵黄浆水的pH值和酸度值
Table 1 The pH value and titratable acidity of fermented soybean whey
样品 pH值 酸度(°T)
L.R12h
L.R36h
L.A12h
L.A36h
4.17±0.053b
4.03± .056a
4.25±0.066b
4.02± .113a
27.94±0.825a
32.76±0.941b
26.85±0.552a
34.91±0.830c
注:L.R12h和L.R36h分别表示经鼠李糖乳杆菌发酵12h和36h的黄浆
水;L.A12h和36h分别表示经嗜酸乳杆菌发酵12h和的36h的黄浆
水。小写字母标注同一列数据的显著性差异(p<0.05)。
研究报告 25· ·
China Brewing
2013 Vol.32 No.7
Serial No.256
能力,但是效果不显著。
2.2.2清除DPPH和ABTS+自由基的能力
(1)清除DPPH的能力
在乙醇溶液中,DPPH自由基稳定存在,呈紫色,在
517nm处有一个特征吸收峰。当遇到自由基清除剂后,
DPPH上的孤对电子就会被配对,溶液颜色变浅[10]。吸光度
值越小,说明清除DPPH自由基的能力越强。
从表3可以看出,当黄浆水浓度小于50%时,随着浓度
的增大,黄浆水清除DPPH能力明显增强;但是当黄浆水
浓度达到50%时,同样处理方式得到的黄浆水清除DPPH
的能力没有显著差异,其中发酵黄浆水清除DPPH的能力
显著高于未发酵黄浆水的,但是菌种和发酵时间对黄浆水
清除DPPH能力没有显著影响。
(2)清除ABTS+自由基的能力
无色的还原型ABTS和过硫酸钾反应,生产蓝绿色的
氧化型ABTS+。当遇到抗氧化剂时,ABTS+被还原,溶液颜
色变浅,吸光度值变小[14]。
从表4可以看出,随着浓度的增大,黄浆水清除ABTS
能力显著增强。在相同浓度时,发酵黄浆水的清除能力大
于未发酵黄浆水的,而菌种和发酵时间对发酵黄浆水清除
ABTS+能力的影响均不显著。
2.2.3螯合二价铁能力
菲洛嗪能够定量的与Fe2+形成复合物,溶液颜色变红。
但是当有螯合剂存在时,会干扰复合物的形成,溶液颜色
变浅,吸光值越小,表明螯合能力越强[15]。螯合二价铁的能
力用螯合率表示,螯合率越大,其抗氧化能力越强。
从附图可以看出,黄浆水具有较强的螯合Fe2+能力,
随着浓度的增大,螯合率变大,当浓度达到50%时,增大幅
表2 未发酵和发酵黄浆水还原三价铁的能力
Table 2 The ferric reducing antioxidant capacity of unfermented
and fermented soybean whey
黄浆水
L.R12h
L.R36h
L.A12h
L.A36h
0.24±0.025Aa
0.26±0.004Aa
0.27±0.032Aa
0.32±0.021Aa
0.34±0.034Aa
1.37±0.087Ba
1.42±0.055Ba
1.49±0.016Bab
1.62±0.146Bbc
1.71±0.035Bc
2.73±0.072Ca
2.79±0.057Ca
2.76±0.100Ca
2.97±0.043Cb
.09± .090Cb
3.90±0.007Da
3.99±0.124Da
3.92±0.031Da
.60±0.146Db
4.68±0.075Db
4.99±0.145Ea
5.18±0.132Eb
5.06± .066Eab
5.50±0.270Ec
5.66±0.101Ec
样品
黄浆水的浓度/%
5 25 50 75 100
注:L.R12h和L.R36h分别表示经鼠李糖乳杆菌发酵12h和36h的黄浆
水;L.A12h和36h分别表示经嗜酸乳杆菌发酵12h和的36h的黄浆
水。小写字母标注同一列数据的显著性差异(p<0.05),大写字母标
注同一行数据的显著性差异(p<0.05)。
表3 未发酵和发酵黄浆水清除DPPH自由基能力
Table 3 The scavenging effect on DPPH of unfermented and
fermented soybean whey
黄浆水
L.R12h
L.R36h
L.A12h
L.A36h
4.39±
0.411Aa
9.99±
0.347Ac
11.37±
0.400Ae
9.00±
0.386Ab
10.33±
0.170Ad
21.30±
0.176Ba
25.34±
0.233Bb
26.53±
0.223Bd
25.96±
0.259Bc
26.55±
0.047Bd
28.83±
0.064Ca
30.21±
0.062Cb
30.21±
0.031Cb
30.05±
0.018Cb
30.02±
0.099Cb
28.61±
0.053Ca
30.11±
0.189Cb
30.02±
0.128Cb
30.10±
0.064Cb
29.87±
0.062Cb
28.48±
0.135Ca
30.15±
0.031Cc
29.88±
0.099Cbc
29.84±
0.082Cbc
29.72±
0.141Cb
样品
黄浆水的浓度/%
5 25 50 75 100
注:L.R12h和L.R36h分别表示经鼠李糖乳杆菌发酵12h和36h的黄浆
水;L.A12h和36h分别表示经嗜酸乳杆菌发酵12h和的36h的黄浆
水。小写字母标注同一列数据的显著性差异(p<0.05),大写字母标
注同一行数据的显著性差异(p<0.05)。
表4 未发酵和发酵黄浆水的清除ABTS自由基能力
Table 4 The scavenging effect on ABTS of unfermented and
fermented soybean whey
原液
L.R12h
L.R36h
L.A12h
L.A36h
6.05±
0.239Aa
8.50±
0.234Aab
9.61±
0.401Ab
9.54±
0.140Ab
6.05±
0.333Aa
21.61±
2.111Ba
24.06±
0.444Bab
24.72±
1.444Bab
23.87±
0.714Bab
25.57±
0.357Bb
26.06±
1.444Ca
35.39±
0.484Cb
36.94±
2.667Cb
36.39±
1.333Cb
37.72±
3.851Cb
30.87±
1.916Da
42.91±
1.619Db
43.17±
0.222Db
42.28±
1.000Db
43.02±
3.382Db
31.83±
1.477Da
50.91±
0.945Eb
51.17±
1.018Eb
52.31±
2.445Eb
51.57±
2.016Eb
黄浆水
黄浆水的浓度/%
5 25 50 75 100
注:L.R12h和L.R36h分别表示经鼠李糖乳杆菌发酵12h和36h的黄浆
水;L.A12h和36h分别表示经嗜酸乳杆菌发酵12h和的36h的黄浆
水。小写字母标注同一列数据的显著性差异(p<0.05),大写字母标
注同一行数据的显著性差异(p<0.05)。
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中 国 酿 造
2013年 第 32卷 第 7期
总第 256期
度趋于平缓。在相同浓度时,发酵黄浆水的螯合率大于未
发酵黄浆水,且差异显著(p<0.05);鼠李糖乳杆菌发酵黄
浆水的螯合能力大于嗜酸乳杆菌发酵黄浆水,而且延长
发酵时间,两种乳酸菌发酵的黄浆水的螯合能力都明显增
强。鼠李糖乳杆菌发酵36h后,黄浆水的螯合能力最强。
具有抗氧化活性的物质通常可以通过多种机制来实
现抗氧化作用,例如阻止链式反应的发生,螯合过渡金属
催化剂,分解过氧化物,阻止氢原子的传递,还原氧化物和
清除自由基等[16]。本研究测定了黄浆水在三种机制中的抗
氧化能力,从实验结果可以看出,黄浆水本身就具有较强
的抗氧化能力,这可能是因为黄浆水中含有蛋白质类、糖
类以及异黄酮类的抗氧化活性成分。吴瑕等[17]人利用碱性
蛋白酶制备的大豆蛋白水解物在卵磷脂脂肪氧化系统中
可以降低硫代巴比妥酸值(TBARS),且具有较好的清除
DPPH自由基的能力。MATEOSAPARICIOI等[18]人从大豆
豆渣中提取的可溶性多糖,发现其片段具有体外还原能力
和自由基清除能力,其中可溶于0.05mol/L氢氧化钠的多
糖片段具有最高的抗氧化活性。大量研究表明大豆异黄
酮对羟自由基和超氧自由基有较强的清除能力[19]以及抑
制由金属离子引发的过氧化反应[20]。
从研究结果来看,发酵黄浆水具有更高的抗氧化能力,
表明乳酸菌的发酵作用可以增强其抗氧化活性。从已有
的报道来看,很多菌种都可以通过发酵作用增强大豆的抗
氧化能力。YANGJ等[21]应用醋酸杆菌、乳酸杆菌、酵母和
链霉菌作为混合发酵剂发酵大豆汁,与未发酵的豆汁相
比,发酵液具有更高的DPPH、超氧阴离子和羟基自由基
清除能力。杨国锋等[22]也研究发现应用少孢根霉RT-3发酵
豆粕,其抗氧化活性高于未发酵豆粕的抗氧化活性,并且
抗菌能力增强。发酵作用带来的抗氧化能力提高,一方
面与活性异黄酮的生成有关,另一方面也与益生菌及抗
氧化性肽的生成有关,因为发酵乳和发酵乳清的抗氧化能
力也会提高,如有报道表明牛奶开菲尔和豆奶开菲尔与普
通的牛奶和豆奶相比,具有更好的抗氧化活性[23],发酵乳
清清除羟自由基和DPPH的能力与乳清相比分别提高了
22.73%和46.09%[24]。
3 结论
黄浆水中含有一定量的营养素,适合鼠李糖乳杆菌和
嗜酸乳杆菌的生长。黄浆水本身具有一定的抗氧化活性,
发酵作用可以提高其抗氧化能力,具体情况如下:(1)乳酸
菌发酵增强黄浆水还原三价铁的能力,其中嗜酸乳杆菌的
影响较为显著,但是延长发酵时间对黄浆水还原能力的增
强没有显著影响。(2)通过发酵可以增强黄浆水清除DPPH
和ABTS+的能力,但是两种菌种之间及发酵时间都没有显
著差异。(3)发酵作用显著增强了黄浆水的螯合能力,其中
鼠李糖乳杆菌发酵36h的黄浆水螯合二价铁的能力最强。
通过乳酸菌发酵,可以提高黄浆水的酸度值,产生特
殊的风味与口感;同时由于活性异黄酮、抗氧化性肽等成
分的生产,提高黄浆水的功能价值。所以发酵后的黄浆水
可以通过调配,制成保健型饮品,也可以作为功能性成分
应用于食品,饲料,制药等领域。
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