全 文 ：云南省蚕豆茎疫病病原鉴定 ’
云南农大植保系 阮 业兴
我省蚕豆茎疫病 (细菌性 茎 枯 病) 自
9 16 5年在昆明呈贡发生以来 , 发病面积逐渐
扩大 , 流行频率不断增加 , 现已成为我省蚕
豆生产上急待解决的重要问题 ; 如在昆明地
区于 19 6 5年 、 2 9 7 2年 、 2 9 7 5年和 1 9 8 1年几次
大流行在生产上造成严重损失 。 1 9 8 1年仅呈
贡马金铺一个区 , 发病面积达 四 千 多 亩 ,
严重度达 5 0一 1 0 % , 严重田块颗粒无收 。
该病在国外如西德 、 苏联等曾有报道发
生危害 。 国内前人也 曾作过研究 , 但情况与
我省的不完全一致 。 根据我省以往的零星研
究 , 尚未能 全面认识该病特性 , 给防治工作
带来一定的盲目性 ; 为此作者对该病病原作
如下系统鉴定 。
一 、 研究材料和方法
( 一 ) 菌株的分离和培养 :
在蚕豆盛花期至初荚期 (即 发 病 高 峰
期 ) 分别到呈贡 、 安宁 、 昆明 、 篙明和鹤庆
等五县采集供试标本 , 各选取有喷菌现象的
病茎 , 用稀释分离法 (辅以组织分离法 ) 在
营养琼脂培养基上进行分离纯化 , 所获菌株
经初步接种试验后 , 有致病性者进行编号 ,
计有P 。。 1至 P 。。 2 7共 2 7个菌株 , 其 中鹤庆标 本
分离所获菌株接种发病症状不明 显 而 被 淘
汰 。 按地区选取 P 。 1 4 ( 呈贡马 一金 铺 ) , 0P 。 :
(官渡罗梭坡 ) , P 。 1。 (安宁鸣唉河 ) , P o Z ,
. `
(篙明阿子营 ) 等为供试菌株 。 病菌培养和
保存菌株的培养用营养琼脂培养基 (牛肉膏
3 克 , 蛋白膝 5 克 , 琼脂 1 7克 , 水 1 0 0 0毫升 )
和病原细菌通用培养基 (牛肉膏 3 克 , 蛋白
陈 5 克 , 萄葡糖 2 克 , 酵母粉 5 克 , N a C] 2
克 , K Z H P O 4 z 克 , 琼脂 2 7克 , 水 1 0 0 0毫升
两种 , 培养温度 28 ~ 30 O C , 冷藏 温 度 0 ~
5
C
C
。
(二 ) 致病性测定和病理反 应 试 验 方
法 :
菌株致病性测定在玉溪豆种上进行 ; 病
理过敏性反应试验在烤烟大金元 品 种 上 进
行。 测定和试验均采用单针针刺接种法 。 蚕
豆分苗期接种和花期接种 , 接种测定从 3 一
8 月份在简易温室和试验室阳台上进行 , 接
种后用玻璃钟罩或塑料罩保温24 小时 。 菌龄
2 4小时 , 菌液浓度按混浊度计 数 法 9 x 10 “
个 /毫升 , 接种后第 1一 20 天观察 , 烟 苗 为
5 片叶苗龄 。
(三 ) 病菌的形态和培养性 状 观 察 方
法 :
病菌的形态和大小采用吕氏 ( L 。 。 fl e r )
美兰染色法并结合革兰氏染色观察 ; 运动情
况用悬滴法观察 ; 革兰氏染色采用结晶紫草
酸馁染色法 ; 鞭毛染色采用银盐染色法 , 荚
膜染色采用绘图墨汁染色法和硫 酸 铜 染 色
法 , 芽抱染色采用孔雀绿染色法 , 所用病菌
在营养琼脂培养基上培养 。 鞭毛染色培养 18
` 2 4小时 , 其它皆培养 4 8 ~ 7 2小时 。
参加工作的有王家和 、 唐嘉义 、 顾 山 、 据俊 、 李琪帮 , 昆明市植保站王银仙 , 昆明军马防治检疫所齐桂凤 、 王度
” “ ’祷知生永资同志 。 李成云同学参加部分工作。
病菌培养性状观察以在营养琼脂培养基
上的菌落形态 、 大小和色泽等为主 , 结合观
察乌兴斯基 ( U s e h于n众歹) 、 孔氏 ( C o五n ) 、
费米 ( F e r l们 ) 和杜氏 ( D u h a tn ) 等培养液
中的生长性状 。
(四 ) 病菌生化反应观察方法 :
生化反应共进行下列七个反应试验 :
1
. 明胶液化 : 培养基按牛肉膏 3 克 、 蛋
白陈 5 克 、 明胶 12克 、 水 1 0 0 0毫升配成 , 接
种后 2 、 7 、 1 4 、 30 夭观察 , 测定时用冰水
凝固法观察明胶液化情况 。
2
. 叫噪产生 : 培养基用杜氏 ( D u h a m )
培养基 , 测定用柯伐克斯 ( K o v a c s ) 法 。
3
. 淀粉水解 : 培 养 基 用 营 养 琼 脂 加
。 . 2%可溶性淀粉配成 , 平板划线培养 。 测
定采用鲁戈尔氏 ( L洲 9 01 ) 碘液浸淹法 。
4
. 石蕊牛乳反应 : 牛乳用冰冻法结合离
心法脱脂 , 在 10 磅下灭菌 15 分钟 , 接种后观
察培养液色泽变化 , 冻化或凝固情况 。
5
. 硫化氢产生 : 培养基采用蛋白陈胧氨
酸硫酸盐培养液测定 , 用醋酸铅液浸纸悬挂
法。
6
.硝酸盐还原试验 : 培养基用蛋白膝 10
克、 硝酸钾 1 克 、 蒸馏水 10 0 0毫升配成的培
养液 , 测定亚硝酸盐用格里斯 ( G r沁 : s ) 试
剂 , 测定硝酸盐用二苯胺试剂 , 接菌后分别
在 1 、 3 、 5 夭观察 。
7
. 碳素化合物发酵反应及耐 盐 试 验 方
法 :
测定碳素化合物发酵反应的培养基用营
养液中按 1 %比例加入各类糖及 指 示 剂 配
成 , 指示剂采用嗅白里兰 。 糖的种类计有 :
葡萄糖、 蔗糖 、 棉子糖 、 果糖 、 木糖 、 麦芽
糖 、 阿拉伯糖 、 乳糖 、 半乳糖 、 甘油 、 甘露醇及
糊精。 其中葡萄糖 、蔗糖 、 棉子糖 、 糊精 、 甘
油采用巧磅 2 0分钟灭菌 ; 果糖、 木糖 、 阿拉
伯糖 、 麦芽糖 、 乳糖 、 半乳糖、 甘露醇采用
间歇灭菌法 。 接菌后观察产酸产气情况 。 耐
豁试验亦使用营养液分别加 0 . 1% 、 0 . 25 %
和。 . 4%的 N a jC 三种处理 。 观察生 长情况
另外还做了酶反应测定 。
(五 ) 血清学反应 :
为了验证菌株之间的亲缘关系曾选抒典
型菌株 P 。 , 4 、 P。 1。和 P。 2 1作为抗原 , 对家免免
疫制成抗血清 。 ( 不分 H 抗原和 0 抗原 ) 。
细菌和抗血清的稀释都用 0 . 8 5% 的生理饮水
(P H 6
.
4一 7 ) 。 血清效价测定和交叉凝集
反应均重复做过三次以土 。
二 、 研究结果
(一 ) 病菌致病性测定 :
供试菌株在蚕豆上接种 丁一 2 天叶片刺
伤部位出现 工一 2二 二 水浸状病斑 , 以后病斑
成圆形或不规 则形扩大 , 呈坏死斑 , 一毛秆症
状开始在刺伤部位变黑 , 以后向上下延伸 ,
呈长条形黑褐色病斑 。 高温高 湿 ( 在 温 空
内 ) 下叶片及茎部病斑迅速扩大变黑腐烂 ,
与田间症状相似 ; 若温湿度较 差 (在 阳 台
上 ) , 病斑扩大较小 , 茎叶很少 出 现 变 黑 腐
烂 。 各菌株接种的发病结果见表 1 。
从表 1表明 , 马全铺 、 鸣唉河菌株致病
力较其他菌株强 , 花期接种发病程度比苗期
接种发病严重 。 镜检发病植株可 见 喷 菌 现
象 , 重分离可得到与原菌株相同的病菌 , 用
单染色法直接染色植株汁液 ( 有喷菌部位 ) ,
可见与分离获得菌相同形状的病菌 。 另外经
多代培养的菌株有明显降低致 病 的 趋 势 ;
1 98 2年 4 月分离经多次移植保藏的菌株 , 到
19 8 3年 2 月测定致病性 , 未见发病 。
(二 ) 病理过敏性反应试验 :
病菌对烤烟病理过敏性反应与致病性测
定结果一致 , 经接种后第一 、 二 、 五 天 观
察 ; 第一夭后在针眼周围出现水渍状斑痕 ,
中心是灰色 , 周围是黄色晕圈 。 第五天后呈
灰黑色坏死斑 , 对照处理无上述反应 。 供试
菌株 P 。。。 、 P 。 1 吐、 1〕 。 、 : 、 P 。 : , 均出现坏死斑 ,
证明为致病菌 。
(三 ) 病菌的形态 、 培养性状及染色反
表 1 致 病 性 浦 定 结 果
苗株来源 供试菌株 测定次数 发病株率 ( % ) 严重程度
呈 贡 县
(金马铺 》
P
0 0 2
P 0 1 弓
P o x 7
P 0 2
名
6 8
。
2 ~1 0 0
7 5
。
3 ~1 0 0
5 7
。
4 ~1 0 0
6 3
。
2 ~1 0 0
1 ~4
1 ~4
1 ~3
1 ~3
安 宁 县
(呜唉河 )
P 0 0
7
P o 王5
P 0 1 6
4 8
。
1 ~1 0 0
6 4
。
5 ~1 0 0
32
。
4 ~1 0 0
1 ~2
1 ~3
1 ~2
官 渡 区
( 罗梭坡)
P 0 0 5
P 0 1 ,
62
。
8 ~ 1 0 0
3 7
。
4 e 1 00
1 ~ 2
1 ~ 2
满明县 (阿子营 ) P o 2 1 3 6 2。 3~ 1 0 0 1 ~ 2
备注 : 严重程度 以温室中的症状为准 , 标准分为 O ~ 4 级 , 0 级为不发病 , 4级为茎叶变黑枯死 。
应 : . 萄糖培养基上不生长 , 在 F e1’ m i氏和 D hu a讯
病菌通过染色证明菌体为短杆状 , 单生 氏培养液中 P 08 、 0P 2 1 生长微弱或不生长 ,
或双生 , 大小为 1 . 1一 2 . 5 x o . 5~ 1 . 1 ( 件 ) , 0P 拓 、 P 。: 4生长良好 , 有菌膜 、 混浊 , 培养液变
革兰氏染色阳性 , 鞭毛单极生 1 一 4 根 , 无 绿色 , 在 U s hc i sn k y 氏培养液中生长良好 , 有
芽抱 , 无荚膜 ; 在营养琼脂培养基上菌落浅 菌膜 , 有絮状沉淀物 ,其中 P。 , 。培养液变绿色 ;
黄色 , 圆形 , 直径为 1 ~ 3n m , 表面光滑 , 在 C o h n 氏培养液中生长微弱 , 稍有絮状沉
有粘性 , 稍隆起 , 有光泽 ; 老菌 落 颜 色 变 淀 。 各菌株形态与文献 P s e1t 0 d o m o n as fa b a
深 , 基质也变黄褐色 ; 平板划线的菌落常出 的比较如表 2 。 从表 2 表明 , 供试各菌株除
现似小菌落的连续颗粒状物 。 在营养琼脂培 大小稍有变化外 , 其形态基本一致 , 与文献
养基 , 植病细菌通用培养基 、 P D A培养基上 P . f ab a 比较 , 供试菌株无荚膜 , 菌落颜 色
生长良好 ; 在马铃薯斜面上菌落成条块状生 白至浅黄色 ; P . f ab a菌种有荚膜 , 菌落颜
长 , 暗白色至淡黄色 , 老菌落黄褐色 , 表面 色为白色 , 表面有皱纹 。
有皱纹 , 基质变成兰紫色 ; 在牛肉膏加 1 %葡
表 2 各菌株形态与文献 P . f汕 a 菌种比较表
供试菌株 形 态 大 小 革氏染色 鞭毛数 芽抱 英膜 菌 落 形 态
P o o , 短杆状 1。 8~ 2 。 Z x
0
。 7~ 1
。
1
单极生
1~ 4根
P
o z。 1 。 0~ 1
.
2 X
0
。
5~ 0
。
9
白至 极淡黄色 , 圆形粘性 , 稍隆
起 , 有光泽 , 菌落直径 1 ~ 3 m m
同 上
P
o i 。 。
6 5~ 1
。
g x
。
8~ 1
。
0
同 上
Po
: i
1
。
7~ 2
。
S K
0
。
8~ 1
。
0
同 上
P
。
f
a
b
a 1
。
1~ 么。 S X
0
.
8~ 1
.
1
同上 有 白色 , 阅形直径 8一 1 2 m m枯性 ,
稍隆起 , 闪光有皱纹
各供试菌株培养性状及与文献P . f a 比 一 污染 , 并无致病性。 在培养液 中 的 性 状 ;
的比较如表 3 。 从表 3 表明 , 供试菌株在固 P 。场的培养液是绿色 , 与 0P 08 、 P。 , `和 P 。 : , 不
体培养基中比较一致 , 菌落颜色有 浅 黄色 同 ; 供试菌与文献 F . fab 。比较 , 除 P。 1: 差异
(营养琼脂上 ) 和白色 ( P D A 上 ) , ’ 与 文 较大外 , 其余菌株仅在 C iol n 氏液中的生长
献 P . fab a 最大差异是菌落表面无皱纹。 经 情况比文献 P . f a b a 的差些 。
多次分离纯化证明凡出现皱纹都有芽抱杆菌
表 3 各菌株培养性状与文献 P . f a b a菌种比较
赢澄靶~ Po o: P o 1 4 P 0 1 5 P o 2 1 F 。 fa ba
背养培养基 浅黄色 , 回形有光泽 同左 同 左 同左 自色 , ilQ 形 , 闪光 , 有皱纹
固 通用培养基 菌落同长 , 生长很快 同左 同 左
薯块培养基 暗 白色 , 条块状有皱纹 同左 同 左
同左
同左
问左
暗白色 , 一 L之条形 , 有皱纹 ,
闪 ;七、
P D A培养基 白色 、 圆形 , 有光泽 同左
宫养掖加有葡糖 不生长 卜习左 同左
体培养基
营养培养液 混浊 , 有絮状沉淀 , 菌胶
液呈谈褐色
生长微弱或不生长
同左
〕
卜习乙它
混浊 , 有絮状沉淀 , 同P o 08 棍浊 , 有 菌膜和沉淀物 , 招
菌膜液呈绿色 养液呈 赤褐 色
F e r m i氏液
D
u
h
a m 氏液
同 上
同左
同 上
同左
U
s e h in s k少
氏培养浪
生 长中等 , 有沉淀 价菌
膜 , ;交呈径色
同 左 棍浊 , 有沉淀积
菌膜 , 液呈绿色
同P o o `
生 长微弱或不生长
生 长中等 , 且很薄而不完全
的茵膜 液呈深澄色 ,有沉 淀物
生长中等 , 溶液表 面有很薄
的菌且莫
墙养荃体液
C ho
n 氏培养液 生匕差 , 稍有沉 淀 同左 同左 生 长微弱或不生长
. .曰 . . , . . 曰. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .一一 . ~ . . ~ ~ r一一 - 晌. . . . 圈. . ~ ~ ~ . ~ ~ ~ ~( 四 ) 病菌生了;;反应 : 乳0P 1 5能凝 固 , 其余均澄清 , 不凝固 , 不冻据观察结果 : 能液化明胶 , 户一 生 硫 化 化 , 「澄清液为草黄色 。 各菌株生化反应结果氢 , 叫噪除 P o l 。 能产生外 , 其余各 菌 不 产 与文献尸 . f ab 吐匕较见表 4 。 、
生 ; 不能水解淀粉 ; 能还原硝酸盐 ; 石蕊牛
裹 4 各葛株生化反应结果与文献 P . f a b a 菌株比较
~弋之: 之迎荫种项 目 P u 。。 P 0 2 ;
明 胶 液 化
呵l 嗓 产 生
硫化氢产生
淀 粉 水 解
硝酸盐还凉
石 蕊 牛 乳
:芝比 达化
P 0 2 。
奋皮化
P o : 1 P
.
f al
、 a
液化 液化
极玛
掩清液呈草黄色 ,
不凝固不冻 比
J jJ厂 冻 化 同 P 。 、 、 `仓`介, ,仁功、 {匕不 阮 {门
过氧化 氢酶 十
较 化 两 +
芳 只 广生少虽叫味
从表 4看出: P 。 : 。 菌株石蕊牛乳反应为 噪 , 与文献 P . fa ba 稍有不同。
冻化 , 与其他各株不同 , 供试菌均不产生 lIJ (五 ) 碳水化合物利用及耐盐试验
表 5 碳 水 化 合 物 利 用 试 验
、众李~ 、少试菌株
、一二厚矿~ 一 P 08 P川 尸015 兰全 P 。 fa b a
项 目
葡 萄 糖
麦 芽 糖
划` 汇l
棉 子 糖
糊 精
D一果糖
D一木塘
阿拉伯糖
甘 露 醉
蔗 枪
乳 糖
半 乳 糖
产酸 产气 产酸 产气 产酸 产 气 产酸 产气 产酸 产 气
_ _ _ _ + + 一 一 微 一
一 一 一 一 + 十 一 一 一 一
结果证明 , 除 P 。 : 。 菌株在部份糖发酵中
能产酸产气外 , 其余各株在各类糖发酵中都
不能产酸产气。 耐盐试验在 0 . 1%浓度下 生
长中等 , 在 0 . 4%浓度下生长微弱 。 测 定 结
果见表 6 。
表 6 耐盐试验结果
\ _ 供试菌株
、 、
\ p
。 。 。 p o z ; P。 ; 。 P o Z , P
.
fa b a
aN CI 浓扩丫 、
表 7 三个菌株的交叉凝集反应
嚷鳄丈 P o 一召 P o 2 1 P o z s
P o l 弓
P o Z z
P 0 1 5
工 : 32 0 0
1 : 2 0 0
1 : 8 00
1 : 8 00
1 : 1 6 00
0
.
1%
0
。
2 5%
O
。
4%
1 %
2 %
3 %
生长 中等 同左 同左 同左
生长微弱 同左 同左 同左
不 生 长 同左 同左 同左
生长很快
生长受阻
生长微弱
苦 各菌株在 1 %葡萄糖液中均不生长 。
(六 ) 抗血清交叉凝集反 应 (试 管 凝
集)
三 、 结论与讨论
. 上述结果证明 , 供试菌接种蚕豆引起蚕
豆茎杆变黑枯死 , 与田间症状相似 , 为蚕豆
茎疫病的病原菌 。 并根据染色反应和鞭毛着
生方式与数量 , 证明供试菌为 P s e du o m o an s
属细菌。
据 目前报道 : 侵染蚕豆的 P s e时 。 m o n as
属细菌有 P . f a b a 和 P . vi ic ae 两种 。 此项试
验所列菌种在菌体大小 、 明胶液化 、 硝酸盐
还原与 P . f a b a 的反应一致 , 而与 P . v ic iae 的
特性不 同。 根据以上结果 , 我们认为引起云
南蚕豆茎疫病病原菌为 P s e u d o m o , i a s f a b a 和
俞大级先生报道的蚕豆茎疫病 P e du o m o n沥
f a b a ( y u ) B u r k基本相同 。
但是本研究结果证明 , 供试菌中 0P 。 : 、
P
。 14 、
P
o Z : 三株在培养性状及糖发酵等反应
与 P。 , 。 差异很大 , 而且数种培养液中均使溶
云南省小麦规范化栽培技术
云南省农科院 刘基一 杨昌寿
农作物规范化栽培技术在促进农业生产
发展上 , 起着明显的推动作用 。 我省小麦生
产 自然条件复杂 , 根据小麦生长的共性及不
同地区的特点 , 制定小麦栽培技术中一系列
规范 , 借以指导生产 , 必将推动我省小麦生
产向前发展 。
小麦规范化栽墙技术包括品种类型 、 播
种节令 、 产量水平 、 产量途径 、 主要生长阶
段单株生长指标及各阶段的促控方案等六个
环节 。 它们之间相互紧密联系而有连贯性 ,
在实施过程 中要全面地按规范要求执行 , 才
容易获得预期的效果 。
我省小麦种植 区划分为滇南早熟 、 滇中
中熟和滇东北及泣西北晚熟三大麦区。 在生
产上分 田麦和地麦两种耕作类型 , 它们受生
态因素的制约所适用 f }勺品种类型 是 不 相 同
的。 地麦处于无水灌溉的条件下 , 需要抢墒插
种。 田麦具有优越的水利条件 , 不需要抢墒
而可延迟到雨季结束之后播种 , 由于播种节
令推迟 , 要求既是迟播又要早熟不能影响稻
谷栽插的适宜节令 。 因此 , 田麦品种要以易
于通过春化阶段的春性小麦品种 类 型 为 规
范 , 地麦要以通过春化阶段较慢 的半冬性品
种为规范 。 我省属于春性类型的田麦品种有
“ 0 2 3 0 , ,
、 “ 0 4 8 3 , , 、 “ 墨查 , , 、 “ 4 2 8 3 ”
等品种 , 无论在滇南早熟麦区 、 滇中中熟麦
区以及滇北晚熟麦区均可使用 。 属于半冬性
或弱春性类型的地麦品种有适于滇南早熟麦
区的 “ 南原一号 , , 、 “ 2一4 ” 、 “ 了6 1 2一 3 ”
等品种 , 适于中熟麦区及晚熟麦区的有 “ 云
麦 2 9 ” 、 “ 2 1 4 ” 、 “ ]爬地麦 ” 等品种 。 根据
生态条件及当地耕作制度定适宜的品种类型
是小麦栽培技术规范的第一个环节 。
适宜的品种类型确定之后 , 就可以根据
品种冬春性的强弱程度定播种节令 。 全省各
麦区的旱地小麦均须在九月下旬至十月初雨
季未结束时将地麦播种完毕以保证出苗 。 稻
田刁、麦因品种春性强弱程度不同及各麦区气
候温暖程度不同 , 在滇南早熟麦区一般应在
十月中旬或十月下旬播种 ; 在滇中中熟麦区
及滇北晚熟麦区应在十月底至十 一 月 初 播
种 , 使春性小麦既不受冻又不延迟成熟期 。
如 19 8 6年我省中熟麦区遭受了历史 上少见的
低冻害 , 小麦损失达 3 亿多斤 。 而曲靖市隽
旗村的咫亩田麦 , 采用春性品种 “ 昭 3 0 ” ,
掌握在 1 0 )」 2 5 日至 1 0 ) 1 2 8 日 播 利, , 冻 害
率仅为 30 ~ 拍% , 最后亩产仍达到 6 6 1 斤 。
因此在品种定型基础上规范播种节令是小麦
液呈绿色 , 扰 P 。。 : , 少, 。 , 、 , 口。 2 ; 与 P . f a b a比
较 , 在 l引嵘产生 、 菌落色泽 、 D u h a m 氏培养
液中价勺生长情 况和耐盐试验四项指标存在差
异 , 再经抗 血清交 叉凝集反应表明 P 。 , 4和0P 2 ,
亲缘 片系较近 , 与 P . f o l〕 。 比 较应该是株系
间的于异 。 尸: } , 。 和其它菌林关系较疏 , 显然
是 F S洲 d川 n o n “ 5当中的另一种细菌 , 暂作为
一个未定种 (尸、 c , ,d 。 , 1, ( , n : : 、 生〕 . ) 。
本研究还证明该细菌为 不 耐 盐 菌 , 在
。 . 4% N a CI 一F即不生长 。 也不耐葡萄糖 , 在
l %葡萄糖液中即不生 一长 (参 考 文 献 从
川各)