全 文 ：基金项目:辽宁省教育厅科研项目(No.2008045);
教育部留学回国人员科研启动基金(No.2008-890)
1 大连大学药物研究所(辽宁 大连 , 116622)
2 大连大学附属医院骨伤科
■通讯作者:　　E-mail:shiliying99074@163.com
·实验研究·
牛膝中三萜皂苷抑制破骨细胞分化作用的研究
于大永1 　吕晓超1 　史丽颖1 ■　李健2
[ 摘要] 　目的:通过牛膝中三萜皂苷类成分对破骨细胞分化的影响 ,探讨牛膝防治骨质疏松症的作用机理。方法:建立破
骨细胞分化体外实验模型 ,在甲状旁腺素(PTH)的诱导下 ,骨髓细胞分化形成 TRAP 阳性破骨样细胞。在细胞培养过程
中 ,分别加入 2 、20、200μM 的各组三萜皂苷样品进行干预 ,考察每组样品对破骨细胞形成的影响。结果:考察的 7 个三萜
皂苷类成分均能不同程度地抑制破骨细胞分化 , 其中竹节参苷 IVa和木鳖子皂苷 Ib 抑制作用最强 , 且其抑制作用具有可
逆性。结论:牛膝中三萜皂苷类成分可有效抑制破骨细胞形成 ,提示其可能作为骨吸收抑制剂用于防治骨质疏松症。
[ 关键词] 　牛膝;三萜皂苷;破骨细胞;骨质疏松
[ 中图分类号] 　R285.5　　[ 文献标识码] 　A　　[ 文章编号] 　1005-0205(2011)03-0009-03
Inhibitory Effect of Triterpenoidal Saponins from Achyranthes
bidentata Bl.on Osteoclast Differentiation
YU Dayong
1 　LV X iaochao1 　S HI Liying1 　L I J ian2
1I nstitute o f Materia M edica , Dalian Univ ersity
2Depar tment o f Or thopedics , Affilia ted H ospital o f Dalian Univ ersity
Abstract　Objective:To obse rve the effect o f trite rpenoidal saponins from Achyranthes bidentata Bl.on osteocla st differen-
tiation , and to elucidate their po tential mechanism on antio steopo ro sis.Methods:The bone mar row cells w ere cultured in
the presence o f PTH to fo rm tartr ate-resistant acid phospha ta se(T RAP)-po sitive multinucleated ce lls , then triterpenoidal
saponin samples at the concentration of 2 , 20 , and 200 μM w ere added to test the effect on o steo calst differentiation.Re-
sults:Seven trite rpenoidal saponins show ed inhibito ry activ ity on o steo clast diffe rentiation , among which chikusetsusaponin
Iva and momordin Ib showed mo re po tent inhibito ry activity , and the inhibitory ac tivity w ere reve rsible.Conclusion:T riter-
penoidal saponins from Achy ranthes bidentata Bl.can inhibit o steo clast fo rma tion , indicating that they can be used as bone
resorption inhibito r to treat osteopo rosis.
Key words　Achy ranthes bidentata Bl.;T riterpenoidal saponins;Osteoclast;Osteoporo sis
　　正常的骨组织 ,在骨重建的过程中骨吸收和骨形成处于平
衡状态 ,因为年龄或疾病等原因导致骨吸收大于骨形成就会导
致骨量下降 ,当骨量下降到一定程度则在临床上诊断为骨质疏
松[ 1] 。因此 ,从细胞水平讲骨质疏松的治疗可以通过抑制破骨
细胞介导的骨吸收过程或促进成骨细胞介导的骨形成过
程[ 2 ,3] 。目前骨吸收抑制剂在临床应用广泛 , 抑制破骨细胞分
化和机能是其主要途径。
我们对中药方剂抗骨质疏松活性及其活性物质的研究过
程中发现 ,补肾健骨汤中味药牛膝可能对其抗骨质疏松作用起
关键作用[ 4 ,5] 。本研究研究了牛膝中三萜皂苷类成分对破骨细
胞分化作用的影响 ,现报告如下。
1　材料与方法
1.1　实验材料
小鼠(ddY)从日本 Sankyo Labo Se rvice 公司获得 , FBS 胎
牛血清购自美国 JRH Bioscience s 公司 , α-M EM 从 ICN Bio-
medicals 公司获得。甲状旁腺素(par athy ro id ho rmones , PTH)
和益钙宁(elcatonin , 40 U/ml)分别购自日本 Peptide Institute
公司和日本 Asahi Kasei公司。
1.2　牛膝中三萜皂苷类成分的分离
牛膝根干燥粉碎后 , 用甲醇加热回流提取 3 次 , 然后将甲
醇提取物依次用正己烷 、乙酸乙酯 、正丁醇萃取 , 对正丁醇层分
别应用葡聚糖凝胶过滤色谱 、正反相硅胶色谱等色谱分离技术
进行分离 , 并对分离到的化合物结构进行结构鉴定 , 分别为竹
节参苷 IVa(1 , chikuse tsusaponin IVa)、竹节参苷 IVa 丁酯(2 ,
chikusetsusaponin IVa buty l este r)、竹节参苷 IVa 甲酯(3 ,
chikusetsusaponin IVa methyl ester)、竹节参苷 V(4 , chikuset-
susaponin V)、竹节参苷 V 甲酯(5 , chikusetsusaponin V methyl
ester)、木鳖子皂苷 Ib(6 ,momordin Ib)及牛膝皂苷 E(7 , achy-
9中国中医骨伤科杂志 2011年 3月第 19卷第 3期
rantho side E)。
1.3　实验方法
1.3.1　细胞培养
采用 Takahashi[ 6]等人的方法评价药物对破骨细胞形成的
抑制活性。破骨样多核细胞在小鼠骨髓细胞培养体系中形成 ,
具体方法如下:取七周龄雄性 ddY小鼠胫骨 , 以α-MEM 冲洗胫
骨骨髓腔 ,骨髓细胞(1.5×106 cells/ ml)置于24 孔培养板中(0.
5mL/w ell)在含有 10%FBS 的α-M EM 培养液中培养 , 同时加
入 PT H(24nM)和不同浓度的待测样品。益钙宁(2U/ ml)被用
作阳性对照。每隔 3d 更换 1 次含有 PTH 和待测样品的培养
液。培养过程保持在 37℃, 5% CO2 和饱和湿度条件下进行。
培养 8d 后 , 附着于培养板孔表面的细胞用含有 10%福尔马林
的磷酸缓冲盐溶液(PBS , pH 7.4)固定 , 然后用乙醇-丙酮(1:1)
处理 1min。细胞用抗酒石酸酸性磷酸酶(tar trate-r esistant acid
pho sphatase , TRAP)染色溶液染色。 T RAP 呈阳性的含有 3 个
以上细胞核的多核细胞被识别为破骨样细胞 , 并计数。按下式
计算破骨样细胞形成百分率:
破骨样细胞形成百分率=样品组破骨样细胞数
PTH 组破骨样细胞数×100%
1.3.2　破骨样细胞形成可逆性检测
破骨样细胞形成可逆性检测方法如上所述 , 在培养的前
4d ,加入 PTH (24 nM)和不同浓度的待测样品 ,其后在培养的
后 4d ,培养液中只加入 PTH (24 nM)而不加入待测样品[ 7] 。
1.4　统计学方法
以 PTH 组做对照 ,计算每组破骨样细胞形成百分率 , 实验
结果以“均值±标准差”表示 , 采用统计学 t检验进行组间比较
分析 , P<0.05 为差异有统计学意义。所有的实验都重复 4 次。
2　结果
2.1　细胞形态观察
PT H 诱导分化后 , 骨髓细胞融合形成多核巨细胞 , 经抗酒
石酸酸性磷酸酶(TRAP ,破骨细胞的标志性酶)染色呈阳性的
多核细胞被识别为破骨样细胞。如图 1 所示 , 在 PTH 组中 , 大
量的 T RAP 阳性的多核巨细胞即破骨样细胞形成。而在益钙
宁存在条件下 , 破骨样细胞数量明显少于 PTH 组。 从牛膝根
中分离到的 7 个皂苷类成分的各浓度组 , 对破骨样细胞的形成
均有不同程度的抑制作用 , 其中在 2μM 浓度下 , 竹节参苷 IVa
和木鳖子皂苷 Ib 对破骨样细胞的形成显示了较强的抑制作用。
图 1　来源于骨髓细胞的多核细胞经 T RAP染色 , P TH 组(24
×10-9 M)(a)、elcatonin组(2U/ml)(b)和 chikusetsu-
saponin Iva 组(2μM)(c),图中线条长度为 100μm 。
2.2　对破骨细胞形成的抑制作用
为了检测牛膝中抑制骨吸收作用的活性成分 ,我们检测了
牛膝中三萜皂苷类成分对 PT H 诱导的破骨样细胞形成的影
响。在 PTH 存在条件下 , 骨髓细胞融合形成 T RAP 阳性的多
核细胞 , 这些细胞被识别为破骨样细胞 , 而这些破骨样细胞正
是在骨吸收过程中起重要作用的原始细胞。每组样品干预后 ,
破骨样细胞形成的百分率以相对于 PTH 组的比值来计算。 如
表 1 所示 , 在 2μM 浓度下 ,化合物 1 、2 、3、4、6 对破骨样细胞形
成显示了较强的抑制活性 , 强于阳性对照药 Elca tonin (2U/
m L)组。
表 1　牛膝中三萜皂苷对破骨样细胞形成的影响( x±s , n=4)
化合物 破骨样细胞形成百分率(%)
2μM 20μM 200μM
1 　15.9±12.2＊＊ 14.7±9.7＊＊ 1.2±2.5＊＊
2 　19.5±14.3＊＊ 11.0±7.3＊＊ 4.9±9.8＊＊
3 　23.2±18.9＊＊ 　18.3±17.5＊＊ 0.0±0.0＊＊
4 24.8±16.1＊ 14.4±11.7＊ 12.4±9.3＊＊　
5 36.6±28.0＊ 　22.0±19.7＊＊ 7.3±9.3＊＊
6 12.2±9.3＊＊ 　7.3±2.8＊＊ 0.0±0.0＊＊
7 29.2±8.9＊＊ 21.9±6.3＊＊ 0.0±0.0＊＊
Elcatonin
PT H
24.8±14.1＊＊(2U/mL)
100.0±22.1(24nM)
　　PT H 组:以P TH (24nM)培养;Elcatonin组:以 PTH (24nM)和 el-
cationin(2U/mL)培养;样品组:以 PTH (24nM)和不同浓度的样品溶
液培养。与 PTH 组相比:＊P<0.05 , ＊＊P<0.01。
2.3　对破骨细胞形成抑制作用的可逆性
为了考察牛膝中三萜皂苷类成分抑制破骨样细胞形成的
活性是否与细胞毒作用有关 , 我们检测了抑制活性强于阳性对
照 Elcatonin 组的 5 组化合物对破骨细胞形成抑制作用的可逆
性。如表 2 所示 , 用 2μM 的被测样品处理细胞 ,在第 4 天移除
被测样品 , 破骨样细胞形成的抑制作用被解除 , 表明在 2μM 浓
度下 , 被测样品的抑制活性不是由于细胞毒作用导致的。
表 2　牛膝中三萜皂苷抑制破骨样细胞形成作用的可逆性( x ±s, n=4)
化合物
破骨样细胞形成百分率(%) 破骨样细胞形成百分率(%)
0～ 8d 0～ 4d
2μM 20μM 2μM 20μM
1 23.7±14.6＊＊17.5±6.4＊＊　 99.1±56.8 52.6±49.1
2 24.8±14.2＊＊18.6±5.4＊＊　 84.6±41.2 72.2±27.0
3 26.8±17.1＊＊21.7±10.7＊＊ 63.0±31.6 29.9±14.0
4 24.8±16.1＊＊14.4±11.7＊＊ 64.0±23.2 38.2±22.8
6 13.4±1.8＊＊　 5.2±8.9＊＊ 91.6±10.0 72.6±15.6
　　0～ 8d:骨髓细胞同 PTH(24nM)和各组样品共培养 8d。 0～ 4d:骨
髓细胞同 PTH(24nM)共培养 8d , 同各组样品培养 4d。与 PTH 组相
比:＊P<0.05 , ＊＊P<0.01。
(下转第 13 页)
10 Chines e J T rad Med T raum &Orthop , Nov 2011 , Vol 19 , No 3
经运动纤维传出 ,从而导致腓肠肌收缩[ 4] 。从 H 反射的原理来
看 ,在选择性脊神经后根切断术中各后根束作电生理检测 , 以
H 反射为检测指标有其病理生理依据 , 具有一定的可行性[ 5] 。
H 反射可评估近端和椎间神经节段 , 因而在评估神经根和神经
丛病变时特别有用[ 6] 。 H 反射潜伏期的异常与腰腿痛患者的
症状体征基本相符 ,它可提示骶神经根受损的程度 ,对指导临床
治疗及判断预后非常有用[ 7] 。M 波的出现是检测 H 波的必要
条件。神经传导异常不仅出现在末端 ,而且在近端也可以出现 ,
可以用 F 波 、H 反射以及腓肠神经传导测出 , 其中 F 波可用于
鉴别周围神经病是脱髓鞘还是轴索损害 , 尤其是累及近端的损
害[ 8] 。神经切断后 ,近端神经轴突也会有部分发生凋亡 , 使神经
轴突再生难以达到正常状态。利用 H 反射测量肌伸张反射通
路的兴奋性 ,除了刺激强度外 , 常用 M 波波幅作为有效刺激强
度恒定指标 ,即 M 波波幅变化时就拒斥该次扫描。 Leana rd 等
提出腓肠肌 H 反射的 M 波波幅变化大于平均值±10%则放弃
该次记录;Brooke 等的标准是在线性分析时以 M 波预期最大
波幅±5%为区间 , M 波超过此区间则拒斥[ 9] 。 10 周时 , 超强刺
激维生素组即有 20%出现 M 形波 , 而空白组则没有任何一只
鼠出现 M 形波;14 周时 ,超强刺激维生素组出现 M 形波的比率
达 80%、空白组出现 M 形波的比率达 20%。 维生素组有促进
Aα神经纤维生长 ,促进神经干功能恢复的作用。
总结 , 运动神经传到检测神经再生的意义主要表现在波幅
上更为客观 , 而神经传导速度和潜伏期误差较大。在 10周时超
强刺激出现 M 波 ,M 波的出现率有助于判断神经再生。
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(收稿日期:2010-11-01)
(上接第 10 页)
3　讨论
普遍认为破骨细胞来源于造血系统 , 首先是单核巨噬细胞
系的前体细胞分化为具有抗酒石酸酸性磷酸酶 (tar trate-r e-
sistant acid pho sphatase , T RAP)阳性的多核细胞 , 经过进一步
的细胞成熟 、极化 , 位于骨吸收面的细胞内形成肌动蛋白环 , 细
胞膜形成微皱褶 , 并与骨表面形成封闭区 , 从而发挥骨吸收的
作用。随后分化了的破骨细胞有一个比较短暂的细胞周期 , 然
后凋亡性死亡。破骨细胞的凋亡进程被几种信号分子所控制 ,
包括 T RAF6、S rc、P I3K/Akt 、ERK 和 NF-κB 通路 , 并且被细胞
因子 、生长因子和激素正性和负性调节[ 8] 。
目前骨质疏松症的防治主要以抑制骨吸收为主 , 在以往的
研究中我们发现 , 牛膝可以用于骨质疏松症的防治 , 因此本研
究考察了牛膝中 7 个三萜皂苷类成分对破骨细胞形成的影响。
研究发现竹节参苷 IVa(1 , chikuse tsusaponin IVa)、竹节参苷
IVa 丁酯(2 , chikusetsusaponin IVa butyl ester)、竹节参苷 IVa
甲酯(3 , chikusetsusaponin IVa methyl e ster)、竹节参苷 V(4 ,
chikusetsusaponin V)、木鳖子皂苷 I b(6 , momordin Ib)在 2μM
浓度下均能可逆性抑制破骨细胞分化且强于阳性对照药 El-
catonin(2U/ mL)组。其中竹节参苷 IVa和木鳖子皂苷 Ib 作用
最强 ,且其抑制作用具有可逆性 , 提示其可能作为骨吸收抑制
剂用于骨质疏松症的防治。
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(收稿日期:2010-10-25)
13中国中医骨伤科杂志 2011年 3月第 19卷第 3期