全 文 ：作者简介:程华，男，博士 研究方向:天然产物与香精香料 * 通讯作者:王昊，男，博士 研究方向:分析化学 Tel /Fax: (027)
83371057 E-mail:wanghaokinger@ 163． com
岩黄连培养细胞的高效液相色谱法指纹图谱研究
程华1，齐伟1，周红审1，杨俊鹏1，王昊1* ，余龙江2(1. 湖北中烟工业有限责任公司技术研发中心，武汉 430040;2. 华中科技大学
生命科学与技术学院，武汉 430074)
摘要:目的 建立岩黄连培养细胞的高效液相色谱法( HPLC) 指纹图谱质量控制方法，测定主要生物碱的含量。方法 采用
高效液相色谱法，色谱柱为 Dikma Diamonsil C18柱( 4. 6 mm × 250 mm，5 μm) ，流动相为乙腈和水体积比为 40∶ 60，每升流动相
加 3. 4 g磷酸二氢钾和 1. 7 g SDS，检测波长 345 nm，流速 1 mL·min －1，柱温 25 ℃。结果 在线性范围内，脱氢卡维丁和小檗
碱的浓度与色谱峰面积呈良好的线形关系，回归方程分别为 Y = 3 645. 2X + 47. 61( r = 0. 998 9) 和 Y = 4 172. 7X + 73. 52 ( r =
0. 999 2) ，加样回收率分别为 97. 9%和 98. 2%，RSD均在 3%以内。结论 该方法准确、可靠，能有效分离和测定岩黄连培养
细胞中脱氢卡维丁和小檗碱含量，所建立的指纹图谱相似度评价和方法学考察结果良好，可用于质量控制和定量分析。
关键词:高效液相色谱法;脱氢卡维丁;岩黄连;指纹图谱
doi: 10. 11669 /cpj. 2013. 14. 006 中图分类号:R284. 1 文献标志码:A 文章编号:1001 － 2494(2013)14 － 1157 － 04
HPLC Fingerprint of Cultured Corydalis saxicola Bunting Cells
CHENG Hua1，QI Wei1，ZHOU Hong-shen1，YANG Jun-peng1，WANG Hao1* ，YU Long-jiang2(1. Technology R＆D
Center，China Tobacco Hubei Industrial CO.，LTD，Wuhan 430040，China;2. College of Life Science and Technology，Huazhong Uni-
versity of Science and Technology，Wuhan 430074，China)
ABSTRACT:OBJECTIVE To establish a method of HPLC fingerprint to determine the contents of primary alkaloids in Corydalis
saxicola Bunting cells. METHODS The determination was performed on a Dikma Diamonsil C18 column (4. 6 mm × 250 mm，5
μm)． The mobile phase was acetonitrile and water (40∶ 60)supplemented with 3. 4 g·L －1 KH2PO4 and 1. 7 g·L
－1 SDS. The chro-
matogram was monitored at 345 nm. The flow rate was 1 mL·min －1，and the column temperature was kept at 25 ℃. RESULTS
The linear regression equations for dehydrocavidine and berberine were Y = 3 645. 2X + 47. 61 (r = 0. 998 9)and Y = 4 172. 7X +
73. 52 (r = 0. 999 2) ，and the average recoveries were 97. 9% and 98. 2%，respectively. The intra-and inter-day RSDs of these alka-
loids were lower than 3%. CONCLUSION An effective method with good precision was established for the determination of the alka-
loids in cultured C. saxicola cells. The results of resemblances evaluation of the fingerprints were satisfactory. This method can be used
as the quality and quantity control of C． saxicola cells.
KEY WORDS:HPLC;dehydrocavidine;Corydalis saxicola Bunting;fingerprint
岩黄连(Corydalis saxicola Bunting)紫堇科紫堇
属植物［1-2］，多年生草本;其活性成分主要是生物碱，
如脱氢卡维丁(dehydrocavidine)、小檗碱(berberine)
等［1-3］;具有显著的抗菌、消炎、镇痛和强安定作用，是
桂西北山区常用于消炎、止痛、排毒，治疗急慢性肝炎
和肝硬化等疾病的一种中草药［1-2］。岩黄连细胞培养
是利用现代生物技术开发植物资源的重要手段之一，
是一种可持续开发利用岩黄连资源的重要措施，同
时，为大规模反应器培养和工业化生产提供依据。目
前已获得岩黄连培养细胞［4-7］，并确定其中含有活性
生物碱成分脱氢卡维丁和小檗碱［5］。为了监测培养
细胞的质量稳定性，采用 HPLC测定岩黄连细胞中脱
氢卡维丁和小檗碱的含量，并建立其 HPLC 指纹图
谱，用于质量控制和定量分析。
1 材料与方法
1. 1 仪器与试剂
Waters高效液相色谱仪，包括 510 泵及其控制
器、486 检测器(美国 Waters公司) ，N2000 色谱工作
站(浙江大学智达信息工程有限公司) ，AE100S 型
分析天平(上海梅特勒-托利多仪器有限公司) ，
PHS －2C酸度计(上海梅特勒-托利多仪器有限公
司) ，KQ －100DB超声波清洗器(江苏昆山市超声仪
器有限公司)。
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中国药学杂志 2013 年 7 月第 48 卷第 14 期 Chin Pharm J，2013 July，Vol. 48 No. 14
岩黄连体外培养细胞参考文献［5-7］，采用 250
mL三角瓶培养，每瓶装 100 mL 培养基(B5 + 0. 5
mg·L －12，4-D +2 mg·L －1 6-BA + 3%蔗糖) ，细胞
接种密度为 10% (FW /V) ，接种后(25 ± 1)℃条件
下暗培养。脱氢卡维丁标准品(中国生物制品检定
所，批号:111667-200401) ，小檗碱标准品(Sigma 公
司，美国，批号:119H0687) ，乙腈为色谱级，磷酸二
氢钠为分析纯，SDS 为化学纯，纯水，其他试剂均为
国产分析纯。
1. 2 色谱条件
色谱柱:Dikma Diamonsil C18柱(4. 6 mm × 250
mm，5 μm) ;流动相为乙腈-水(40∶ 60) ，每升流动相
加 3. 4 g 磷酸二氢钾和 1. 7 g SDS;检测波长 345
nm;流速 1 mL·min －1，柱温:25 ℃;灵敏度:0. 08
AUFS;进样量为 10 μL。
1. 3 对照品溶液的制备
分别精密称取在 105 ℃干燥至恒重的小檗碱和
脱氢卡维丁对照品 5 mg，置于 10 mL 量瓶中，加甲
醇至刻度，摇匀，得到质量浓度为 500 μg·mL －1的
对照品溶液。
1. 4 样品准备
取处于生长平台期的细胞，烘干研磨成粉末后
过 40 目筛，精确称取 100 mg，加 5 mL 体积分数
75%乙醇(含 1%盐酸) ，室温下超声提取 3 次，每次
1 h，过滤去沉淀，滤液用氨水调至 pH 9. 0，然后用 5
mL三氯甲烷萃取 3 次，加少量无水硫酸钠，过滤，滤
液减压蒸干，加入 0. 1 mL 甲醇溶解。用 0. 45 μm
微孔滤膜滤过，取滤液备用。
2 结果与分析
2. 1 HPLC分离结果
在“1. 2”色谱条件下，细胞中生物碱以及标准
品的色谱图见图 1。从图 1 中可以看出，脱氢卡维
丁和小檗碱的保留时间分别为 17. 4 和 24. 1 min。
细胞中生物碱达到完全分离，分离效果较好，1 和 2
号峰的保留时间与对照品相一致。
2. 2 线性关系考察
分别取小檗碱标准品溶液 20，50，100，200，400
和 800 μL;脱氢卡维丁标准品溶液 20，50，100，250，
500，800 μL 于 1 mL 量瓶中定容，分别取 10 μL 进
样。以生物碱质量浓度(μg·mL －1)和峰面积进行
回归分析，得到 2 条回归曲线见表 1，确定检测线性
范围为 0. 1 ～ 4. 0 μg。
图 1 生物碱成分的液相色谱图
A －细胞;B －对照品;C －阴性对照;1 －脱氢卡维丁;2 －小檗碱
Fig. 1 HPLC chromatograms of alkaloids
A － cells;B － standard substances;C － negative control;1 － dehydrocavidine;2 －
berberine
表 1 生物碱的标准曲线 . n = 6
Tab. 1 Regression equations of alkaloids. n = 6
Alkaloid Regression equation Linear range /μg r
Dehydrocavidine Y =3 645. 2X +47. 61 0. 1 － 4. 0 0. 998 9
Berberine Y =4 172. 7X +73. 52 0. 1 － 4. 0 0. 999 2
2. 3 加样回收率测定
取同一批样品(06CD01)研磨过 40 目筛，精确
称取 6 份 0. 5 g 样品，精密加入脱氢卡维丁和小檗
碱对照品适量。按“2. 2”项下方法提取和测定，计
算回收率，脱氢卡维丁和小檗碱的回收率分别是
97. 9%和 98. 2%，RSD分别为 1. 43%，1. 75%。
2. 4 精密度和稳定性检验
取标准品溶液，12 h内连续测定 5 次，根据峰面
积值计算 RSD值(n = 5) ，得到脱氢卡维丁和小檗碱
的 RSD分别是 1. 41%和 1. 80%，2 d 内间隔进样的
RSD值(n = 5)分别是 2. 76%和 2. 93%。说明样品
检测精密度较高，2 d内结果稳定性较好。
2. 5 重复性实验
取同一批样品(06CE02) ，分别制备 5 份供试品
溶液，按“2. 2”项下方法进行测定，结果为 0. 573
mg·g －1，RSD为 2. 3%。
2. 6 样品测定
对培养的 10 批处于生长平台期的岩黄连细
胞进行 HPLC 测定，脱氢卡维丁和小檗碱的定量
分析结果见表 2。细胞中脱氢卡维丁和小檗碱的
平均含量为 0. 564 和 0. 306 mg·g － 1，RSD 分别
为 4. 5%和 3. 4%。
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2. 7 指纹图谱评价
采用“2. 2”项下色谱条件和方法，对 16 批岩
黄连培养细胞进行分离测定，得到 HPLC 指纹图
谱(图 2)。运用药典委员会提供的中药指纹图
谱相似度软件，将实验数据导入后，按照保留时
间进行谱峰自动匹配，得出标准模板 S。将 16 批
样品和标准模板进行相似度评价，结果见表 3。
数据结果表明，此 16 批岩黄连细胞的 HPLC 指纹
图谱相似度较高。
表 2 样品测定结果
Tab. 2 Results of quantification of alkaloids in samples
Sample No. ρ(dehydrocavitine)/mg·g － 1 ρ(berberine)/mg·g － 1
1 0. 541 0. 290
2 0. 596 0. 312
3 0. 534 0. 308
4 0. 579 0. 302
5 0. 571 0. 310
6 0. 589 0. 295
7 0. 573 0. 317
8 0. 520 0. 297
9 0. 558 0. 323
10 0. 581 0. 301
图 2 岩黄连培养细胞的 HPLC指纹图谱
Fig. 2 HPLC fingerprints of 16 samples of C. saxicola cells
表 3 16 批岩黄连培养细胞相似度评价
Tab. 3 Evaluation of resemblance among 16 samples
Sample
No.
Evaluation of
resemblance
Sample
No.
Evaluation of
resemblance
S1 0. 912 S9 0. 926
S2 0. 931 S10 0. 989
S3 0. 950 S11 0. 901
S4 0. 963 S12 0. 893
S5 0. 984 S13 0. 932
S6 0. 894 S14 0. 943
S7 0. 943 S15 0. 974
S8 0. 937 S16 0. 890
3 讨 论
脱氢卡维丁和小檗碱，结构类似，为极性较
强的生物碱类化合物，在 C18柱 HPLC 系统容易拖
尾。曾试用甲醇-水和乙腈-水流动相系统进行分
析，峰形较差，拖尾严重，色谱峰重叠无法得到有
效分离。改用乙腈-磷酸二氢钾-SDS 系统后，分
离效果明显改善，峰形较好(图 2)。表明在流动
相中加入反离子试剂形成离子对，能有效抑制拖
尾，改善峰形，增加在柱子上的保留［8］，该结果与
Abourashed 的结果相一致［9］。根据溶质电离理
论，当流动相的 pH≈pK 时，保留时间随 pH 的微
小变化而灵敏变化，会带来色谱分离的重复性不
好;pH ＞ pK ± 2 时，保留时间稳定，即色谱分离有
较好的重复性［10］。脱氢卡维丁和小檗碱的 pK
为 2. 4 左右，因此，离子对试剂以外的 pH 一般不
宜选在 2. 4 附近，实验中加入少量磷酸二氢钾，
能起到调节 pH 的作用，经测定流动相的 pH 为
4. 5。脱氢卡维丁在 350 nm 波长附近有较强的
吸收峰［8］。小檗碱的紫外吸收非常稳定，常选用
的检测波长有 265 和 345 nm，其中，阴性对照显
示以 345 nm 干扰低，而 265 nm 干扰较高［8］。因
而选择 345 nm 可以同时检测 2 种物质，减少干
扰。测定结果表明，岩黄连离体培养细胞中脱氢
卡维丁的含量较小檗碱含量高，约为 1. 9 倍。
植物细胞在离体传代培养的过程中，并不能无
限增殖，多次传代后会出现退化或者变异现象，因而
有必要建立其质量控制方法，监测离体培养细胞的
质量状况和次生代谢产物合成能力。本实验对 16
批岩黄连细胞样品进行 HPLC分离测定，建立 HPLC
指纹图谱，其相似度高，说明这 16 批岩黄连细胞质
量可靠，合成生物碱能力稳定。建立的 HPLC 测定
脱氢卡维丁和小檗碱含量，可以有效将 2 种成分分
离，峰形好，定量结果满意，检测方法准确可靠，具有
重现性好、精密度高等优点。建立的指纹图谱在定
性定量方面既有具体指标的定量测定，又有整体相
似度的评价，能对岩黄连细胞中主成分含量及整体
质量进行质量控制。
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(收稿日期:2012-09-19)
基金项目:国家自然科学基金资助项目(81001688) ;国际科技合作项目(2011DFA32630) ;“重大新药创制”科技重大专项(2012ZX09103201-
035) ;山西省基础研究青年科技研究基金(2011021007-1) ;山西省高等学校中青年拔尖创新人才支持计划资助
作者简介:郭秉荣，女，硕士研究生 研究方向:生药学 * 通讯作者:高晓霞，女，副教授 研究方向:中药药代动力学，中医药代谢组学
研究 Tel /Fax:(0351)7011202 E-mail:gaoxiaoxia@ sxu. edu. cn
慢性不可预知温和应激配合孤养抑郁模型大鼠海马的代谢组学研究
郭秉荣a，b，杨岚a，b，刘佳丽a，b，秦雪梅a，高晓霞a* (山西大学，a. 中医药现代研究中心，b. 化学化工学院，太原 030006)
摘要:目的 采用 GC-MS代谢组学技术分析慢性不可预知温和应激配合孤养抑郁大鼠的海马组织，寻找海马中与抑郁症相关
的代谢产物，为阐明抑郁症发病机制提供依据。方法 采用慢性不可预知温和应激配合孤养进行造模，以大鼠体重，糖水偏
爱实验和旷场实验评定大鼠行为学的变化，同时采集海马组织进行 GC-MS代谢组学分析并寻找生物标志物。结果 行为学
数据显示，与空白组相比，模型组大鼠的体重显著降低( P ＜ 0. 05) ，糖水偏爱率显著降低( P ＜ 0. 05) ，在旷场实验中模型组大鼠
的穿格数和直立次数显著降低( P ＜ 0. 05) ，显示了抑郁状态。代谢组学分析结果显示，散点图中空白组与模型组明显以 T1 轴
分开，通过载荷图寻找出了慢性不可预知温和应激配合孤养抑郁模型大鼠海马组织中谷氨酸( Glu) 、天冬氨酸( Asp) 、甘氨酸
( Gly) 、γ-氨基丁酸( GABA) 、N-乙酰天门冬氨酸( NAA) 等 10 种潜在生物标志物。结论 运用 GC-MS代谢组学技术分析慢性
不可预知温和应激配合孤养抑郁模型大鼠的海马，寻找到了海马中与抑郁症相关的代谢产物，说明抑郁症的发病机制与能量
代谢、氨基酸代谢和脂代谢相关。
关键词:慢性不可预知温和应激; GC-MS代谢组学技术分析;海马;代谢组学
doi: 10. 11669 /cpj. 2013. 14. 007 中图分类号:R965 文献标志码:A 文章编号:1001 － 2494(2013)14 － 1160 － 05
Hippocampus Metabonomic Study Using a CUMS Rat Model of Depression
GUO Bing-ronga，b，YANG Lana，b，LIU Jia-lia，b，QIN Xue-meia，GAO Xiao-xiaa* (a. Modern Research Center for Traditional
Chinese Medicine，b. College of Chemistry and Chemical Engineering，Shanxi University，Taiyuan 030006，China)
ABSTRACT:OBJECTIVE To analysis the regulation of biomarkers by an metabonomic investigation of chronic unpredictable mild
stress (CUMS)rats. To provide a clue for elucidate the mechanism of depression. METHODS CUMS induced rat animal depression
model，the behavioral changes of rats were observed;meanwhile，hippocampus samples were obtained and subjected to GC-MS analysis
to find potential biomarkers of depression. RESULTS Body weight，sucrose intake in the sucrose preference ，ambulationn number
and rearing number in open-field test of the CUMS rats decreased significantly after 21 d compared with those of the control groups.
Metabonomics analysis showed that the model group separated the control group from T1. Ten potential biomarkers are identified from
the loading plot between control and model group. CONCLUSION Ten biomarkers are identified among the detected compounds.
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