全 文 ：收稿日期:2015-07-15; 修订日期:2015-11-18
基金项目:国家自然科学基金(No． 81302701);
安徽医科大学博士科研资助基金(No． XJ201226)
作者简介:李 增(1985-)，男(汉族)，安徽颍上人，安徽医科大学基础医
学院讲师，博士学位，主要从事肿瘤药学研究工作．
枸橘苷抑制血管生成作用的研究
李 增，陈灵芝，刘 晨
(安徽医科大学，安徽 合肥 230032)
摘要:目的 研究传统中药枸橘主要成分之一枸橘苷对血管生成的抑制及初步的作用机制。方法 用四甲基偶氮唑盐
(MTT )法、黏附抑制试验、迁移抑制实验及体内鸡胚绒毛尿囊膜法(CAM 法)研究枸橘苷体外抗血管生成作用;用逆转录
聚合酶链反应(ＲT － ＲCＲ)方法检测枸橘苷对肿瘤细胞血管内皮生长因子 A (VEGF － A )mＲNA 表达的影响。结果 枸
橘苷对血管内皮细胞增殖表现出良好的抑制作用，IC50值为(27． 8 ± 0． 2)μmol·L
－1，优于其抑制肿瘤细胞增殖的能力
［IC50≥(33． 8 ± 0． 1)μmol·L
－1］;在体外该化合物能够明显抑制内皮细胞的黏附和迁移作用，同时体内实验显示该化合
物在 30μg剂量浓度时能够显著抑制鸡胚绒毛尿囊膜新生血管形成;ＲT － ＲCＲ实验显示枸橘苷在 12． 5 μmol·L －1和 25
μmol·L －1剂量时显著抑制 A549 细胞的 VEGF － A mＲNA表达，且结果具有显著的差异。结论 枸橘苷具有抑制新生血
管形成作用，其作用机制可能与与抑制血管内皮细胞增殖以及降低肿瘤细胞表达 VEGF的量有关。
关键词:枸橘苷; 血管生成; 抑制作用; VEGF
DOI标识:doi:10． 3969 / j． issn． 1008-0805． 2016． 02． 008
中图分类号:Ｒ285． 5 文献标识码:A 文章编号:1008-0805(2016)02-0277-03
The experimental study on the anti － angiogenic effects of poncirin
LI Zeng，CHEN Ling-zhi，LIU Chen
(Anhui Medical University，Hefei 230032，China)
Abstract:Objective This s tudy was to investigate the inhibitory effects and the mechanism of action of poncirin on angiogene-
sis． Methods MTT assay was used to research the effect of poncirin the proliferation of HUVECs(human umbilical vein endotheli-
al cells)and some human cancer cells． Adhesion inhibition experiment，migration inhibition experiment and chick embryo chorio-
allantoic membrane (CAM)assays were testas models of angiogenesis． VEGF － A (vascular endothelial growth factor A)mＲNA
expression was detected by ＲT － PCＲ (reverse transcriptase polymerase chain reaction)assay． Ｒesults Poncirin inhibited cell
proliferation in some tumour cells，and the IC50 was much lower in HUVECs (27． 8 ± 0． 2μmol·L
－1)than that in tumor cells
(IC50≥33． 8 ± 0． 1μmol·L
－1)． And poncirin showed a remarkable inhibitive effect against the migration，adhesion of HUVEC
and significant anti － angiogenesis activities in CAM assay． Also poncirin at 12． 5μmol·L －1 and 25μmol·L －1 inhibited signifi-
cantly inhibited VEGF － A mＲNA expression in cultured A549 cells． Conclusion Poncirin could inhibit angiogensis through in-
hibiting endothelial cells proliferation and VEGF expression in tumor cells．
Key words:Poncirin; Angiogenesis; Inhibitory effects; VEGF
肿瘤是威胁人类生命健康重大的疾病之一。目前抗肿瘤药
物研究呈现出多元化发展的趋势。其中以肿瘤血管生作为靶点，
开发血管新生抑制剂，已经成为抗肿瘤研究中一个重要的领域。
肿瘤血管生成是血管内皮细胞在已有的血管系统中进行分化、迁
移从而形成新的微血管过程，其基本步骤包括:(1)血管基底膜、
基质的降解及血管通透性的增加;(2)血管内皮细胞脱离血管发
生迁移和增殖，发育成血管芽;(3)在内皮细胞血管芽生的基础
上，单个血管芽管腔化，相互融合成血管网;(4)内皮细胞继续迁
移并包绕血管网形成血管结构［1］。这一过程涉及多种细胞增
殖、凋亡及细胞外基质降解和重塑等，因此，通过干预血管形成过
程中的一些关键环节，可以有效的破坏或抑制肿瘤血管的新生，
达到抑制肿瘤生长的目的。
早在 1971 年，哈佛大学 Folkman 博士就提出了肿瘤生长和
转移为血管依赖性的理论，并认为阻断肿瘤血管生成是抗肿瘤治
疗的有效策略［2］。近些年来，科学家们已经将研究的热点集中
在寻找安全有效的血管生成抑制剂上，并取得了一定的成效。其
中贝伐单抗已于 2004 年 2 月获美国 FDA批准用于临床，成为第
一个获得批准上市的抑制肿瘤血管生成的药物［3］。重组人血管
内皮抑素也于 2005 年 9 月得到 SFDA 的批准［4］。自此，抗肿瘤
的抗血管生成治疗理论从实验室走入临床阶段。
图 1 枸橘苷的结构式
枸橘苷(Poncirin)(结构如图 1 所示)是中国传统中药枸橘
的重要成分之一，属于黄酮类化合物［5］。研究证实具有抗肿瘤、
抗病毒、抗自由基、松弛血管、抑制脂质过氧化等广泛的药理活
性。但尚未见在异甘草苷抗肿瘤血管生成方面的研究。经化学
·772·
LISHIZHEN MEDICINE AND MATEＲIA MEDICA ＲESEAＲCH 2016 VOL． 27 NO． 2 时珍国医国药 2016 年第 27 卷第 2 期
结构分析我们发现异甘草苷具有新生血管小分子抑制剂的结构
特征［6 ～ 8］:(1)有两个或两个以上的芳香基团;(2)芳香基团上有
多个可以形成氢键的受体或配体;(3)芳香基团间有 linker 键连
接。因此我们推断该化合物可能通过抑制肿瘤血管生成而达到
抗肿瘤的作用。本研究通过多个方面综合评价了异甘草苷的抗
血管形成作用。
1 材料与方法
1． 1 材料 枸橘苷(批号:p114052)购自 Aladdin －阿拉丁试剂
(上海)有限公司;受精鸡蛋购自合肥市金利养鸡场;人脐静脉内
皮细胞(HUVEC)、人淋巴细胞性白血病 CEM 细胞、人前列腺癌
PC － 3 细胞、人肺癌 A549 细胞株、人肝癌 HepG2 细胞株作为实
验细胞株来自于安徽医科大学微生物实验室;四甲基偶氮唑盐
(批号:206 － 069 － 5)购自阿拉丁试剂有限公司;PCＲ 引物由上
海生工公司合成，PCＲ 试剂盒、Taq 酶、逆转录试剂盒购自上海
生工公司。
1． 2 实验方法
1． 2． 1 细胞增殖抑制实验 将对数生长期细胞接种于 96 孔板，
密度约为 5000 个细胞 /孔。培养 24 h 后，将枸橘苷分别稀释至
100，50，25，12． 5，6． 25μmol·L －1加入到 96 孔板中，每孔加 100
μl量，每个浓度平行设 3 个孔，并设空白孔和对照孔，继续培养
48 h。然后每孔加入 MTT 溶液(5g·L －1)20μl，37℃孵育 4 h，吸
去培养基，每孔加入 100μl DMSO，振荡混匀。用酶标仪在 492
nm 处测 OD 值，记录结果，所有结果均重复 3 次。以细胞存活率
对剂量作图求 IC50值
［9］。
1． 2． 2 细胞黏附抑制实验 用无菌醋酸溶(0． 006mol·ml －1)液
将鼠尾胶原蛋白 I型(5g·L －1)的稀释至 0． 012g·L －1备用。在
96 空板的每孔中加 50μl(含 2μg)胶原蛋白鼠尾胶原蛋白溶液，
并设空白，晾干，PBS 洗涤后每孔加入 0． 2%的胎牛血清 PBS 溶
液，37℃温箱孵育 2h，阻断非特异性结合位点。随后用 PBS 洗 3
次，加入内皮细胞悬浮液(2 × 105)50μl 每孔，同时加入 50μl 浓
度为 15 μmol·L －1和 30 μmol·L －1化合物的培养基，设置阴性
对照。置于培养箱培养 3h。培养结束，PBS 洗 3 次，结晶紫染色
10min，冲洗，晾干。随后每孔加入 2% SDS溶液，在 570 nm处用
酶标仪测 OD值［10］。
结果计算:黏附率(%)=(加化合物细胞 OD 值 －空白组细
胞 OD值)/(阴性对照组细胞 OD 值 － 空白组细胞 OD 值)×
100%;抑制率(%)=(1 －黏附率)× 100%。
1． 2． 3 细胞迁移抑制实验 HUEVCs在 6 孔板中长满单层后，用
无菌细胞刮刮去一条直线。吸去培养基，PBS 洗涤 3 次。加入用
DMEM稀释的化合物(30，20，10 μmol·L －1)各 2ml，各浓度平行
设 3 个孔，同时设置 3 个对照孔，37℃培养箱培养 24 h，吸去培养
基，PBS洗 3 次。倒置显微镜下拍照，计算内皮细胞由刮除边缘
细胞向刮除区迁移到距离［11］。
1． 2． 4 鸡胚绒毛尿囊膜血管生长的影响 实验在孵化 9d的鸡胚
气室端开一个的正方形窗(1cm × 1cm)，暴露出鸡胚绒毛尿囊膜，
随后将已制备好的含 30mg 的枸橘甙的小纸片(直径 5mm)贴在
血管较少的部位，无菌封口膜封窗后继续孵化。3 d后将实验鸡
蛋放入 4℃冰箱低温冻存 24h。剥离 CAM(Chick chorioallantoic
membrane)膜，以纸片为中心，剪取直径 3cm CAM膜，平铺，拍照。
用固定液(甲醇∶ 丙酮，1∶ 1)固定 30 min，烘干保存［12］。
1． 2． 5 逆转录多聚酶链反应(ＲT － PCＲ )实验 取对数生长期
的人肺癌 A549 接种于 24 孔培养板，培养 24 h后加不同剂量枸
橘苷继续培养 24 h后抽提 ＲNA，收集进行逆转录。VEGF － A 正
向引物:5 ＇ － GCAGAATCATCACGAAGTGG － 3 ＇，逆向引物:5 ＇ －
GCATGGTGATGTTGGACTCC － 3 ＇，B － actin 正向引:5 － ＇AGGC-
CAACCGCGAGAAGATGACC － 3 ＇;逆 向 引 物:5 ＇ － GAAGTC-
CAGGGCGACGTAGCAC － 3＇。
反应条件:95℃ 5 min;95℃变性 30 s，56℃退火 30 s，72℃
延伸 1 min，VEGF － A 35 个循环，Bactin25 个循环;随后 72℃延
伸 7 min。PCＲ 产物凝胶电泳，紫外线灯下观测，计算条带的灰
度值，以 β － actin作内对照矫正作图计算相对灰度值。相对灰
度值 =(待测条带的灰度值 /B － actin 的灰度值) ×待测条带的
灰度值［13］。
2 结果
2． 1 枸橘苷对 HUVEC 细胞具有良好生的抑制作用 MTT 实验
结果显示，枸橘苷对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)株、、人淋巴细
胞性白血病 CEM 细胞株、、人前列腺癌 PC － 3 细胞株、人肺癌
A549 细胞株、人肝癌 HepG2 细胞株的半数抑制剂量分别为
(27． 8 ± 0． 2)、(33． 8 ± 0． 1)、(46． 8 ± 0． 2)、(34． 3 ± 0． 3)和 ＞
100μmol·L －1，说明枸橘苷具有优先的抑制血管内皮细胞增殖
的作用。同时这一结果也说明枸橘苷对于肿瘤细胞增殖具有一
定的抑制能力。
2． 2 枸橘苷对内皮细胞细胞外基质黏附的抑制作用 枸橘苷对
在脐静脉内皮细胞(HUVEC)共同作用 3h 后结果显示出良好的
抑制内皮细胞在细胞外基质胶原蛋白上的黏附作用。当化合物
浓度为 15μmol· L －1 抑制率为 38． 4%;而化合物浓度达到
30μmol·L －1时，抑制率增长到 44． 4%。
2． 3 枸橘苷对内皮细胞迁移表现出良好的抑制作用 枸橘苷在
10 ～ 30μmol·L －1时对 HUVEC的迁移有一定的抑制作用，如图 2
所示。10，20，30 μmol·L －1的枸橘苷对 HUVEC迁移数目的抑制
率分别为 22． 4%、35． 2%、42． 76%，不同剂量的枸橘苷组间有显
著差异。
A －阴性对照组;B － 10μmol·L －1组;
C － 20μmol·L －1组;D －30 μmol·L －1组
图 2 枸橘苷对内皮细胞迁移的抑制作用
2． 4 枸橘苷对鸡胚尿囊膜血管新生的抑制作用 枸橘苷作用 9
日龄鸡胚尿囊膜 72 h后，表现出明显的抑制鸡胚尿囊膜上血管
生成能力。如图 3 所示，枸橘苷(30μg)组在载样滤纸片周围表
现出血管网分布稀少、分叉程度低的结果，显示出异甘草苷经过
载样滤纸片的缓慢扩散后，形成了一个抑制鸡胚尿囊膜(CAM)
血管生成的作用圈，而阴性对照组的血管网表现出血管分布均
·872·
时珍国医国药 2016 年第 27 卷第 2 期 LISHIZHEN MEDICINE AND MATEＲIA MEDICA ＲESEAＲCH 2016 VOL． 27 NO． 2
匀、粗大、形成多级分叉的现象;除此之外，测试物滤纸片周围血
管颜色鲜红，说明测试物没有影响原有的血管的活性。结果说明
枸橘苷在体内能显著抑制血管的生成。
图 3 枸橘苷对鸡胚 CAM新生血管的抑制作用
2． 5 枸橘苷下调人肺癌 A549 细胞 VEGF － A mＲNA的表达 枸
橘苷 0 ～ 25μmol·L －1作用 A549 细胞 24 h 后，可见该化合物能
够明显下调 A549 细胞 VEGF － A mＲNA 表达，并且呈剂量相关
性，其中 12． 5μmol·L －1和 25μmol·L －1两个剂量表现出良好的
实验结果，P值分别小于 0． 05 和 0． 01，具有显著性差异(图 4)。
结果说明枸橘苷可能通过抑制 VEGF 的表达，从而有效抑制肿
瘤血管的生成。
图 4 枸橘苷对 A549 细胞 VEGF － A mＲNA表达的影响
3 讨论
肿瘤血管的生成在肿瘤的生长过程中起到至关重要的作用。
它既给肿瘤提供营养和氧，而且还决定着肿瘤的病理生理、侵袭、
转移和对各种治疗的反应等特性。通过抑制肿瘤血管及其周边
血管的生成，在一定程度上可以阻断肿瘤的发生、发展、浸润及转
移［14］。随着肿瘤新生血管形成机制的深入研究及解析，抗肿瘤
血管生成这一疗法给恶性肿瘤患者带来了新的希望。但目前临
床应用的各类血管生成抑制剂，大多数价格昂贵，对于我国绝大
多数肿瘤患者来说难以承担，使这一治疗方案难以得到推广和临
床应用。中药是我国重要的资源，各种道地药材成分的分析及药
理活性研究对新药的发现具有重要的意义，应用现代科技研制、
开发中药材成分的抗血管生成作用，在一定程度上可以缓解上述
矛盾，并且能够极大促进我国传统中医药的发展。
本研究结果表明，中药枸橘主要成分之一异枸橘苷对人淋巴
细胞性白血病 CEM细胞、人前列腺癌 PC － 3 细胞、人肺癌 A549
细胞、人肝癌 HepG2 细胞均有不同强度的细胞毒性作用，其中，
对人肺癌 A549 细胞的增殖抑制作用最为明显。同时研究发现
相对于肿瘤细胞毒性的实验结果，枸橘苷具有优先的抑制血管内
皮细胞增殖的作用，在较低的非凋亡剂量，能够抑制 HUVEC 的
迁移、粘附作用，这一差异细胞毒性及能干扰内皮细胞功能的特
性，符合现代医药抗血管生成药物筛选的标准。枸橘苷抑制血管
生成的作用在鸡胚绒毛尿囊膜实验中进一步得到验证，实验结果
显示化合物对 CAM血管生成具有良好的抑制作用。初步的机制
研究发现枸橘苷能够抑制肿瘤细胞 VEGF mＲNA 表达，鉴于
VEGF是肿瘤血管形成的关键因子，这一结果说明枸橘苷可能通
过影响 VEGF表达实现其抗肿瘤与抑制血管生成的作用。本研
究是对枸橘苷抗血管生成活性的初步探讨，为抗肿瘤药物的研发
开启了一个新的思路，后续研究还需进一步通过一系列实验在体
内验证实验结果，并深入研究其抗肿瘤血管生成的具体机制。
参考文献:
［1］ Hanahan D，Folkma J． Patterns and emerging mechanisms of the angio-
genic switch during tumorigenesis［J］． Cell，1996，86(3):353．
［2］ Folkman J． Tumor angiogenesis:Therapeutic implications［J］． N Eng
J med． 1971，285(18) :1182．
［3］ 陈万灵． 新药贝伐单抗的临床应用进展［J］． 中国肿瘤，2010，19
(8):534．
［4］ 尚立群，赵 皆，王 伟，等． 重组人血管内皮抑素对非小细胞肺
癌淋巴管生成的抑制及对循环肿瘤细胞的影响［J］． 中国肺癌杂
志，2014，17(10):722．
［5］ 张元梅，周志钦，孙玉敬． 高效液相色谱法同时测定柑橘果实中
18 种类黄酮的含量［J］． 中国农业科学，2012，45(17):3558．
［6］ Zhong H，Bowen JP． Antiangiogenesis drug design:multiple pathways
targeting tumor Vascula ture［J］． Curr Med Chem，2006，13(8) :
849．
［7］ 陈 娇，徐为人．抗肿瘤血管新药的研究进展［J］． 现代药物与临
床，2012，27(1):1．
［8］ 郭晓川，张婷婷，苏 丹，等．抗肿瘤血管生成药物及血管生成相关
因子的研究进展［J］． 肿瘤防治研究，2013，40(10):1001．
［9］ 李鹏翀，赵博新，梁倩莹，等． MTT 法检测非小细胞肺癌对紫杉醇
的敏感性［J］．药学研究，2014，33 (1):1．
［9］ Isaacs JT，Pili Ｒ，Qian DZ，et al． Identification of ABＲ － 215050 as lead
second generation quinoline － 3 － carboxamide anti － angiogenic agent
for the treatment of prostate cancer［J］． Prostate，2006，66(16) :
1768．
［10］ 洪 敏，唐小卿，何 葵．硫化氢对人结肠癌细胞增殖和迁移的影
响［J］．南方医科大学学报，2014，34(5):699．
［11］ Domenico Ｒ． The chick embryo chorioallantoic membrane as a model for
tumor biology［J］． Exp Cell Ｒes，2014，328 (2) :314．
［12］ 蔡 劲，任大宏，杨 静． 舌鳞癌组织中 HIF － 1α 和 VEGF 表达
及与肿瘤血管生成的关系［J］． 实用医学杂志，2013，8(29):
1215．
［13］ Folkman J． Clinical applications of research on angiogenesis［J］． N
Eng J Med，1995，333(26) :1757．
·972·
LISHIZHEN MEDICINE AND MATEＲIA MEDICA ＲESEAＲCH 2016 VOL． 27 NO． 2 时珍国医国药 2016 年第 27 卷第 2 期