全 文 ：＊基金项目:广西科学研究与技术开发计划项目(编号:桂科攻
0718002-3-13)
1.南宁壮都生物科技有限公司
收稿日期:2009-02-16
HPLC法测定岩黄连中不同部位脱氢卡维丁的含量＊
陆　益　黄其春　黎远冬　黄　耿1 　梁宁生
(广西医科大学附属肿瘤医院　南宁　530021)
摘要　目的:建立岩黄连中不同部位脱氢卡维丁的高效液相色谱定量测定方法。方法:采用 Zo rbax ODS C18(250 mm×4.6
mm , 5 μm)色谱柱 ,以乙腈-0.05 mol/ L磷酸二氢钾溶液(用 10%KOH 调 pH 至 5.0)(85:15)为流动相 , 流速 1.0 mL/ min ,检
测波长为 347 nm , 柱温为室温。结果:脱氢卡维丁在 2.51～ 75.36 μg/m L(r=0.999 99 , n =7)范围内线性关系良好 ,平均回
收率为 99.86%, RSD为 0.58%。结论:该法简单 、快速 、重现性好 ,适用于岩黄连中脱氢卡维丁的定量分析。
关键词　高效液相色谱法;不同部位;岩黄连;脱氢卡维丁
中图分类号:R927.2　　　文献标志码:A　　　文章编号:1005-930X(2010)01-0018-03
HPLC DETERMINATION OF THE CONTENTS OF DEHYDROCAVIDINE IN DIFFERENT
PARTSOF CORYDALIS SAXICOLA BUNTING
Lu Yi , Huang Qichun , Li Yuandong , et al.(A ffi lia ted Tumo r Hospital of Guangxi M edical University ,
Nanning 530021 China)
Abstract　Objective:To establish the HPLC method fo r dete rmination of the contents of dehydrocavidine in
dif ferent parts of Corydalis saxicola Bunting.Methods:Using Zorbax ODS C18 column(250 mm 4.6 mm ,
5μm), acetonit rile-solut ion of po tassium pho sphate(0.05 mol/L , adjust pH to 5.0 w ith 10%KOH)(85:15)
as mobile phase.Flow ra te w as 1.0 mL/min and detecting w aveleng th w as 347 nm.Results:The calibration
curve for dehydrocavidine w as linear in the concentration range of 2.51 ～ 75.36 μg/mL (r =0.999 99 ,
n =7).The average recovery w as 99.86% with RSD=0.58%.Conclusion:This method is simple , rapid
and w ith bet ter reproducibi li ty fo r dete rminat ion of content of dehydro cavidine in Corydalis saxico la Bun-
ting.
Key words　HPLC;different parts;co rydalis saxico la bunting;dehydrocavidine
　　岩黄连(Co rydalis saxicola Bunting)为紫堇科紫堇属多
年生草本植物[ 1 ～ 3] 。分布于我国广西 、云南 、贵州 、四川等[ 4] ,
生长于石灰岩山区 ,属于石山特有种[ 3] 。传统药用部位是全
草 ,具有显著的抗菌 、消炎 、镇痛和安定作用 , 常用于治疗肝
炎 、肝硬化 、肝癌等疾病[ 2 , 5] 。 岩黄连的成分有卡维丁 、脱氢
卡维丁(岩黄连碱)、小檗碱 、右旋白蓬叶碱等等 , 其中以脱氢
卡维丁含量最高 , 是岩黄连的主要有效成分[ 5] 。 目前 , 对于
岩黄连的研究主要在岩黄连总生物碱的成分分析 、含量测
定 、引种栽培和临床应用[ 2 , 3 ,6 ～ 9] 。本研究采用高效液相色谱
法对岩黄连全草及其根 、茎 、叶 、花 、果各部位中的脱氢卡维
丁进行含量测定 ,对控制岩黄连质量 、合理采收 、确保疗效具
有重要意义。
1　仪器与试药
高效液相色谱仪(10Avp 日本岛津公司):包括 LC-
10A tvp 泵 , SPD-10Avp 紫外检测器;威玛龙色谱数据工作站
(南宁市威玛龙色谱科技有限公司)。 岩黄连干燥的全草 、
根 、茎 、叶为种植 , 由广西一心药业股份有限公司提供(批号
20060301), 产地:广西都安县 , 经广西中医学院刘寿养教授
鉴定。脱氢卡维丁对照品(中国药品生物制品检定所 , 批号
111667-200401),乙腈为色谱纯 , 其它试剂为分析纯。水为重
蒸馏水。
2　方法与结果
2.1　色谱条件:色谱柱为Zo rbax ODS C18(250 mm×4.6 mm ,
5 μm);流动相为乙腈—0.05 moL/ L 磷酸二氢钾溶液(加入
0.5%三乙胺溶液 , 用 10%KOH 调 pH 至 5.0)(85∶15), 检
测波长 347 nm;流速 1.0 m L/ min ,柱温室温。
2.2　溶液的制备
2.2.1　对照品溶液:精密称取脱氢卡维丁标准品 6.28 mg ,
·18· 广 西 医 科 大 学 学 报JOURNAL OF GUANGXI MEDICAL UNIVERSIT Y　2010 Feb;27(1)
DOI :10.16190/j.cnki.45-1211/r.2010.01.066
置于 25 mL 棕色容量瓶中 ,加乙腈溶解并定容到刻度 ,摇匀 ,
作储备液。精密吸取储备液 5.0 mL 置于 25 mL 棕色容量瓶
中 ,加流动相溶解并定容到刻度 , 摇匀 , 对照品溶液(50.24
mg/ L)。
2.2.2　供试品溶液:分别将样品置于粉碎机中粉碎成细粉
(过 4 号筛),精密称取约 0.1 g , 置于索氏提取器中 , 加入无
水乙醇 150 m L ,加热回流至无色为止 , 放冷 ,移至 250 mL 容
量瓶中 ,再加入无水乙醇稀释至刻度 , 摇匀。微孔滤膜(0.45
μm)滤过 , 即得供试品溶液。
2.3　线性关系的考察:分别精密吸取脱氢卡维丁储备液
(251.2 mg/ L)0.25、0.5、1.0 、1.5、2.5 、5.0 、7.5 mL , 再各加
入流 动相稀释成 2.512、 5.024 、 10.048 、 15.072 、 25.12、
50.24 、75.36 mg/ L 不同浓度的标准工作液 , 摇匀 , 各进样
10.0 μL , 以相应组分的色谱峰面积(Y)对其浓度(C)进行线
性回归 , 其回归方程为Y =64 935.06C+8 571.42(r=
0.999 99 , n =7), 结果表明 , 脱氢卡维丁的浓度在 2.512 ～
75.36 mg/ L 范围内线性关系良好 , 见图 1。
图 1　HPLC 色谱图
A.脱氢卡维丁对照品　B.岩黄连样品　1.脱氢卡维丁
2.4　精密度实验:精密吸取标准曲线项下(含脱氢卡维丁
15.072 mg/ L)的溶液 , 10.0 μL 注入液相色谱仪 ,连续进样 5
次 ,根据峰面积计算 , RSD为 0.32%。
2.5　重复性实验:精密称定岩黄连全草样品 ,按供试品溶液
制备方法分别制备 5 份供试品溶液 , 进行重复性实验 , 结果
脱氢卡维丁含量的 RSD为 0.35%。
2.6　稳定性实验:取供试品溶液 ,每隔 2 h 测定 1 次 , 共测 7
次 ,结果脱氢卡维丁含量的 RSD 为 0.31%。表明在 12 h 内
稳定。
2.7　回收率试验:精密称取已知含量的岩黄连全草细粉 6
份 ,精密加入对照品储备液适量 , 按“ 2.2.2”项下方法处理 ,
在上述色谱条件下测定 ,计算平均加样回收率。 结果脱氢卡
维丁的平均回收率为 98.71%, RSD=1.26%(n =6), 见表
1。
2.8　样品含量测定:按“ 2.2.2”项下方法制备各样品的供试
品溶液 , 在色谱条件下测定 , 岩黄连的全草及其根 、茎 、叶 、
花 、果不同部位脱氢卡维丁的含量 , 见表 2。
表 1　加样回收率试验结果
样品中含量(m/ mg) 加入量(m / mg) 测得量(m / mg) 回收率(%) 平均值(%) RSD(%)
0.955 5 1.140 2.093 1 99.79
0.917 5 1.140 2.036 8 98.19
0.900 8 0.954 6 1.851 9 99.64 98.71 1.26
0.898 5 0.954 6 1.843 2 98.97
0.934 5 0.760 0 1.688 7 99.24
0.886 3 0.760 0 1.619 3 96.45
表 2　样品含量测定结果(n =3)
样品 脱氢卡维丁(%) RSD(%)
全草 1.858 5 2.83
根 3.294 0 2.29
茎 0.890 8 3.23
叶 2.143 1 2.21
花 0.910 9 1.95
果 1.951 2 2.17
3　讨　论
3.1　提取条件的选择:比较甲醇 、甲醇―盐酸(100∶1)、乙
醇 、乙醇―盐酸(100∶1)作提取溶媒 , 结果无差别。因此 , 实
验中选择无水乙醇作为提取溶剂。
3.2　流动相的选择:脱氢卡维丁中碱性氮原子与固定相酸
性硅醇基相互作用 , 导致色谱峰拖尾 , 在流动相中加入三乙
胺溶液竞争或部分阻断硅醇基的影响 , 可明显地改善峰形 ,
而且减少拖尾。
3.3　波长的选择:脱氢卡维丁有 2 个紫外吸收峰 ,最大吸收
峰在 274 nm , 次吸收峰在 347 nm 处。 检测波长为 274 nm
时 ,有杂质峰干扰脱氢卡维丁的检测;检测波长为 347 nm 时
无杂质峰干扰 , 且峰形较好 , 分离度和出峰时间也较理想。
故选择 347 nm 作为检测波长。
3.4　含量测定结果的分析:对同一采收期中脱氢卡维丁在
岩黄连植株不同部位的分布存在明显差异 , 以根部含量最
高 ,叶其次 , 茎最低 ,但是对于不同产地 、不同环境 、不同采收
期以及野生的脱氢卡维丁含量是否有差异 , 有待进一步研
究。
参考文献:
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2 746.
广西医科大学学报　2010 Feb;27(1)
＊基金项目:广西科学基金资助项目(No.桂科基 0448069)
■通信作者
收稿日期:2009-01-13
转基因树突状细胞瘤苗诱导的 CTL 对肿瘤细胞的靶向性杀伤作用＊
吴继宁　匡志鹏　谢裕安■　杨　帆　罗小玲　李媛媛
(广西肿瘤防治研究所　南宁　530021)
摘要　目的:观察 mAFP基因转染的树突状细胞(DC)瘤苗诱导的靶向性细胞毒性 T 细胞(以下简称靶向性 CTL)对肿瘤细胞
的杀伤作用。方法:用构建的 mAFP基因转染的 DC 瘤苗免疫 C57BL/6 小鼠 , 取免疫小鼠脾细胞诱导 CTL , LDH 非放射性细
胞毒性试验检测其对不同肿瘤细胞的杀伤作用。用 ELISA 法检测 C TL 诱导过程中 TNF-α和 IFN-γ分泌变化规律。结果:
AFP基因转染的 DC 瘤苗免疫小鼠后能诱导具有较高抗肿瘤活性的靶向性 CTL , 这种靶向性 CT L对 AFP分泌性肿瘤细胞具
有更强的杀瘤活性 ,且在 C TL诱导过程中 TNF-α和 IFN-γ分泌水平明显增高 , 与对照组比较差异有统计学意义(P <0.05)。
结论:AFP 基因重组腺病毒修饰的 DC 瘤苗免疫 C57BL/6J 小鼠 , 能诱导出针对 AFP 抗原的靶向性 CTL ,并也能通过分泌
TNF-α和 IFN-γ实现对 AFP分泌性肿瘤细胞的特异性杀伤。
关键词　甲胎蛋白;树突状细胞;靶向性 CT L;抗肿瘤作用
中图分类号:R730.3　　　文献标志码:A　　　文章编号:1005-930X(2010)01-0020-03
THE CYTOLYTIC EFFECT OF TARGETING CYTOTOXIC TLYMPHOCYTE INDUCED BY
TRRANSGENICDENDRITIC CELLS TUMOR VACCINE
Wu Jining , Kuang Zhipeng , Xie Yuan , et al.(Guangx i Cancer Insti tute , Nanning 530021 China)
Abstract　Objective:To investig ate the cy toly tic ef fect o f target ing cy totoxic T lymphocy te induced by
transgenic dendrit ic cel ls(DC)tumor vaccine.Methods:C57BL/6 mice w ere inoculated w ith DC tumo r vac-
cine w hich w as enginee red wi th murine alpha fetoprotein (mAFP)gene.Targeting cy to to xic T lympho-
cytes(CT L)was induced from spleen cel ls of ino culated mice and cy tolyt ic ef fect w as tested by LDH non-
i rradiated cy totoxic test.TNF-αand IFN-γsecre tion level w ere detected w i th ELISA method.Results:The
ta rg eting CTL which w as induced by AFP antigen has mo re ef fective cytoly tic effect against AFP-secreting
tumo r cells than the control g roup , and there w as remarkably significance for TNF-αand IFN-γsecretion
level of the experimental group than the contro l g roup.Conclusion:Target ing CTL could be induced by
transgenic DC tumo r vaccine w hich w as engineered wi th mAFP gene and specifically kill the tumor cells
wi th AFP-secre ting , i ts cy tolitic ef fect i s also rela ted to higher level o f TNF-αand IFN-γsecretion.
Key words　alpha fetopro tein;dendri tic cells;target ing CTL;cy toly tic effect
　　肝癌免疫治疗的关键是寻找肿瘤特异性抗原。目前认
为甲胎蛋白(AFP)是肝癌最为特异的相关抗原 , 它在 80%以
上的肝细胞癌中高表达 , 尽管荷瘤机体可能对该抗原产生免
疫耐受 ,但文献报道经过修饰的树突状细胞(DC)仍能诱导机
体产生针对该抗原的特异性抗肿瘤免疫反应[ 1] 。 因此从肝
癌细胞中克隆 AFP基因作为靶向性分子导入 DC 刺激机体
产生特异性的抗肿瘤免疫反应应是行之有效的途径。
·20· 广西医科大学学报　2010 Feb;27(1)