全 文 ：·方药研究 ·
高效液相色谱法测定金刚藤浸膏中薯蓣皂苷元的含量
黄嗣航 ,唐健新 ,黄苑红 ,欧阳燕茹 ,廖晓慧 ,陈颖婷
(广东药学院中药学院 ,广东 广州 510006)
[摘要 ] 目的:建立金刚藤浸膏中薯蓣皂苷元的测定方法。方法:采用 RP-HPLC测定薯蓣皂苷元的含量 , 色谱柱为
ODS-C18(4.6 mm×250 mm, 5 μm)不锈钢柱(Merck公司), 流动相为甲醇 , 检测波长为 203 nm, 峰面积外标法定量。采用正
交设计 , 考察乙醇浓度(A)、加醇量(B)、水解时间(C)3个因素对薯蓣皂苷提取 、水解的影响。 结果:薯蓣皂苷元在 14.7 ～
176.4μg/ml内具有良好的线性关系(r=0.9993, n=7),平均回收率为 99.98%, RSD% =0.76%(n=5)。采用 50%乙醇 180
ml, 索氏提取器中加热回流至提取液近无色 , 加入 20 ml盐酸 ,加热回流水解 2 h,可使金刚藤浸膏中薯蓣皂苷提取 、水解完全。
结论:RP-HPLC是一个简便 、快速 、准确度高的测定金刚藤浸膏中薯蓣皂苷元的方法;乙醇浓度对提取效率影响显著。
[关键词 ] 薯蓣皂苷元;金刚藤浸膏;正交设计;高效液相色谱法;含量测定
[中图分类号 ] R927.2 [文献标识码 ] A [文章编号 ] 1672-951X(2008)02-0069-02
RP-HPLCdeterminationofdiosgenininSmilaxchinaL.extract
HUANGSi-hang, TANGJian-xin, HUANGYuan-hong, etal
GuangdongPharmacyCollege, Guangzhou, China, 510006
[ Abstract] Objective:ToestablishamethodfordeterminingdiosgenininSmilaxchinaL.extract.Methods:AODS-C18(4.
6 mm×250 mm, 5μm)columnwasusedwithmethanolasthemobilephase.Thedetectionwavelengthwasat203nm.Anexternal
standardizationmethodwasused.Threefactorsondioscinhydrolysisandextraction, theconcentrationofalcohol(A), thecontentof
alcohol(B), zymolysistime(C)werestudiedbyorthogoraldesign.Results:Thelinearrangeof14.7 ～ 176.5μg/ml(r=0.9993, n
=7), andanaveragerecoveryof99.98%, RSD% =0.76%(n=5)wereobtained.Theoptimumhydrolyticandextractivecondi-
tionincludedSoxhletextractionwith50% alcohol180 mlbyextractnearlycolorless, hydrolysisfor2 hwith20 mlhydrochloricacid.
Conclusion:RP-HPLCisasimple, rapidandreliablemethodfordiosgenindeterminationinSmilaxchinaL.extract.Theconcentra-
tionofalcoholisthemostcriticalfactorontheextractionyieldofdiosgenin.
[ Keywords] Diosgenin;SmilaxchinaL.Extract;Orthogoraldesign;RP-HPLC
金刚藤胶囊是用金刚藤提取物(以下简称金刚藤浸膏)
制成的中成药。金刚藤为百合科植物菝葜(SmilaxchinaL.)
的根茎 , 味甘 , 微苦涩。主要具有祛风除湿 、解毒散瘀等功
效 [ 1] 。有研究表明 , 金刚藤胶囊治疗慢性盆腔炎疗效显著 ,
治疗 92例患者 ,总有效率达 96%[ 2] 。金刚藤中主要含有甾
体皂苷元及其苷 , 黄酮类和生物碱类成分 [ 3] 。其中 ,皂苷类
成分是其重要活性部位 [ 4] , 其质量控制是确保金刚藤胶囊安
全有效的手段。本实验探索了金刚藤浸膏样品预处理的最
佳提取 、水解条件 ,以及 RP-HPLC测定条件 ,实现了对金刚
藤浸膏中薯蓣皂苷元的准确分析 ,为金刚藤浸膏的质量控制
提供了手段。
1 仪器与试药
1.1 仪器 Waters2695高效液相色谱仪 , 2996紫外检测
器 , 微孔滤膜(0.45 μm)。
1.2 试药 薯蓣皂苷元对照品(中国药品生物制品检定所 ,
批号:1539-200001),甲醇(色谱纯), 其他试剂均为分析纯。
2 实验方法
2.1 色谱条件 色谱柱:ODS-C18 (4.6 mm×250 mm,
5 μm)不锈钢柱(Merck公司), 流动相:甲醇 , 流速:1 ml·
min-1 , 柱温:30 ℃, 检测波长:203nm, 进样量:20 μl。
2.2 溶液的配制
2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取 105 ℃干燥 2 h的薯
蓣皂苷元对照品 14.7mg,置 50 ml量瓶中 , 加甲醇溶解并稀
释至刻度 , 摇匀 ,即得含薯蓣皂苷元 294 μg/ml的对照品溶
液。
2.2.2 供试品溶液的制备 准确称取 2g金刚藤浸膏粉末 ,
滤纸包裹 , 置于索氏提取器中乙醇浸渍过夜。加热回流至提
取液近无色 , 回收溶剂约 100 ml, 加入 20 ml盐酸 ,加热回流
水解 2 h, 冷却 , 加入石油醚(60 ～ 90 ℃)萃取 4次 , 每次
40 ml,合并萃取液蒸干 , 残渣用甲醇溶解并转移至 10 ml容
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第 14卷第 2期 中 医 药 导 报 2008年 2月
Vol.14 No.2 GuidingJournalofTCM February.2008
DOI :10.13862/j.cnki.cn43-1446/r.2008.02.030
量瓶中 , 甲醇定容至刻度。 0.45 μm微孔滤膜过滤 , 即得供
试品溶液。对照品溶液与供试品溶液均进样 20 μl, 记录峰
面积 , 按外标法计算含量。
3 结 果
3.1 正交试验法对浸膏粉中薯蓣皂苷元提取条件的优选
选定乙醇浓度 、加醇量 、水解时间作为考察因素 ,每个因素各
取 3个水平 , 以薯蓣皂苷元含量(峰面积)为评价指标 , 应用
L
9
(34)正交表安排试验。因素水平表(见表 1), 结果(见表
2、3)。
表 1 因素水平表
水平 因素A(乙醇浓度)/% B(加醇量)/mlC(水解时间)/h
1 50 100 1
2 70 140 2
3 90 180 3
表 2 正交试验结果
实验号
因素
A
(乙醇浓度)
B
(加醇量)(空)
C
(水解时间)
结果
1 1 1 1 1 106.00
2 1 2 2 2 149.05
3 1 3 3 3 182.58
4 2 1 2 3 109.51
5 2 2 3 1 110.07
6 2 3 1 2 137.21
7 3 1 3 2 25.46
8 3 2 1 3 12.12
9 3 3 2 1 15.51
K1 437.63 240.97 255.33 231.58
K2 356.79 271.24 274.07 311.72
K3 53.09 335.3 318.11 304.21
R 384.54 94.33 62.78 80.14
表 3 方差分析表
方差来源 离差平方和 自由度 均方 F P
A 27404.4 2 13702.2 39.57 ﹤ 0.05
B 1546.5 2 773.2 2.23 ﹥ 0.05
C 1305.9 2 652.9 1.88 ﹥ 0.05
空白 692.4 2 346.2
直观分析和方差分析表明:因素中乙醇浓度 A对薯蓣皂
苷元的提取效率影响差异有统计学意义(P<0.05)。经过分
析 , 优化后的最佳条件为 A1B3C2 , 即从金刚藤浸膏粉末中提
取薯蓣皂苷元的最佳条件为:2g粉末以滤纸包裹 ,加入 50%
乙醇 180 ml,索氏提取器中浸渍过夜 , 加热回流至提取液近
无色 , 回收溶剂约 100 ml, 加入 20 ml盐酸 , 加热回流水解 2
h。
3.2 系统适应性实验 按 “ 2.1”色谱条件分别进样 20 μl
对照品溶液和供试品溶液 , 薯蓣皂苷元峰的保留时间为
7.8 min左右 , 主成分与相邻杂质峰得到良好的分离 , 分离度
大于 2,对照品和供试品的色谱图(见图 1)。
图 1 薯蓣皂苷元对照品和样品色谱图
a-薯蓣皂苷元对照品 b-样品 1-薯蓣皂苷元
3.3 线性关系考察 精密称取薯蓣皂苷元对照品 14.7 mg,
置 50ml量瓶中 ,加甲醇溶解并稀释至刻度 , 摇匀 ,精密移取
0.5, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 6.0 ml至 10 ml量瓶中 , 用甲醇
定容至刻度 , 摇匀 , 按 “ 2.1”色谱条件进样 , 以对照品浓度
(μg/ml)为横坐标(X),主峰面积为纵坐标(Y)作图 , 一元线
形回归方程为 Y=6365.2X-7567.7, r=0.9993,线形范围
为 14.7 ～ 176.4 μg/ml。
3.4 精密度实验 取上述薯蓣皂苷元对照品溶液连续进样
5次 ,每次 20μl,测得各次峰面积的 RSD%为 0.21%。结果
表明 , 此分析方法精密度良好。
3.5 稳定性实验 将同一对照品溶液在室温下考察 5 d,测
得日内与日间精密度(RSD%)分别为 0.57%, 1.21%。结果
表明 , 薯蓣皂苷元的甲醇溶液在 5 d内稳定。
3.6 重复性实验 取同一批号样品 5份 ,按 “ 2.2.2”项下操
作 , 测得薯蓣皂苷元的含量为 0.0861 mg/g, 测定结果 RSD%
为 1.01%。
3.7 加样回收率实验 精密称取已测含量的金刚藤浸膏粉
末 1 g,精密加入对照品溶液 0.5 ml,按 “2.2.2”项下操作 ,测
定其含量 , 计算加样回收率 , 结果平均回收率为 99.98%,
RSD%为 0.76%(n=5)。 (见表 4)
表 4 金刚藤浸膏粉中薯蓣皂苷元加样回收率试验结果
(n=5)
n 加入对照品量(mg)
测定量
(mg)
平均回
收率
RSD
(%)
1 0.147 0.2348
2 0.147 0.2330
3 0.147 0.2328 99.98% 0.76
4 0.147 0.2353
5 0.147 0.2333
3.8 样品含量的测定 按 “ 2”项下的有 (下转第 75页)
70
第 14卷第 2期 中 医 药 导 报 2008年 2月
Vol.14 No.2 GuidingJournalofTCM February.2008
值为 827143, RSD% =1.15%。结果表明 , 供试品溶液在 16h
内稳定。
3.9 重复性试验 取同一样品(批号 070312)5份 ,分别按
上述含量测定方法测定其淫羊藿苷含量 , 平均含量为
8.590μg/ml, RSD%=0.44%。结果表明 , 本法重现性良好。
3.10 回收率试验 精密量取已知含量的供试品 25ml各 9
份(批号:070606, 含量:8.582μg/ml), 分别精密加入浓度为
52.5 μg/ml的对照品溶液 3.2, 3.2, 3.2, 4.0, 4.0, 4.0, 4.8,
4.8, 4.8 ml, 在水浴上蒸至约 10 ml, 加水 20 ml, 照 3.3项下
供试品溶液制备方法同法操作 ,按上述色谱条件测定淫羊藿
苷含量 , 得淫羊藿苷平均回收率为 98.39%, RSD%为
1.93%。结果表明本方法加样回收率好。 (见表 1)
表 1 淫羊藿苷回收率试验结果
编
号
取样量
(ml)
样品中含淫羊
藿苷量(μg)
加入淫羊藿苷
的量(μg)
测定量
(μg)
回收率
(%)
平均回收
率(%)
RSD
(%)
1 25 214.55 168 381.70 99.49
2 25 214.55 168 378.12 97.36
3 25 214.55 168 383.52 100.58
4 25 214.55 210 415.71 95.79
5 25 214.55 210 424.70 100.07 98.39 1.93
6 25 214.55 210 418.00 96.88
7 25 214.55 252 468.52 100.78
8 25 214.55 252 461.92 98.16
9 25 214.55 252 457.42 96.38
3.11 样品测定 按上述条件和方法测定 3批样品中淫羊
藿苷的含量。 (见表 2)
4 讨 论
处方中安络小皮伞干菌丝复合物为君药 , 其中含蛋白
质 , 有报导用 UV法测定其含量 , 但方中绞股蓝等也含多量
蛋白质 , 故选择臣药淫羊藿作为含量控制对象。经试验采用
HPLC法测定淫羊藿中淫羊藿苷的含量 , 准确性好 , 灵敏度
高。
表 2 淫羊藿苷的测定结果 (n=3)
批号 淫羊藿苷平均含量(μg/ml) RSD(%)
070312 8.590 0.43
070606 8.582 0.60
070621 8.636 0.89
检测波长的确定:用淫羊藿苷对照品溶液在 230 ～
300nm范围内进行紫外光谱扫描测定 , 结果在 268.8 nm波
长处有最大吸收 ,故确定其检测波长为 270 nm。
以上结果表明 ,本方法专属性强 、重现性好 , 精密度高 ,
回收率满意 , 因此可作为安蓝风湿液的质量控制方法。
参考文献:
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(收稿日期:2007-09-11 编辑:朱民)
(上接第 70页)关方法测定不同批号的金刚藤浸膏粉末中
薯蓣皂苷元含量 , 测定结果。 (见表 5)
表 5 金刚藤浸膏粉中薯蓣皂苷元的含量 (n=3)
样品编号 薯蓣皂苷元的含量(mg/g) RSD(%)
1 0.0878
2 0.0861 0.99
3 0.0867
4 讨 论
薯蓣皂苷是金刚藤的重要活性成分 , 但薯蓣皂苷本身无
紫外吸收 , 检测前处理较为复杂 , 所以大多数金刚藤制剂都
以薯蓣皂苷元作为指标性成分监测其制剂的质量。为测定
其含量 , 本文通过对薯蓣皂苷元进行全波长扫描 , 确定其最
佳吸收峰在 203 nm。同时 , 试用了不同流动相 , 最后选用甲
醇。其原因是:纯甲醇的保留时间约 8 min, 比乙腈(保留时
间约 15 min)要短 , 而且主峰与相邻峰分离度大于 2, 已达到
色谱分离的要求。
金刚藤浸膏中薯蓣皂苷元的测定关键在于薯蓣皂苷的
水解与提取。因此 , 本文设计了正交试验对提取所需的乙醇
浓度 、加入的乙醇量和水解时间 3个因素进行考察。结果乙
醇浓度对薯蓣皂苷的水解和提取十分关键 , 其原因可能是:
金刚藤中皂苷类成分主要以皂苷 ,而不是以皂苷元的形式存
在。所以 , 低浓度的乙醇由于极性较高 , 更能够将薯蓣皂苷
提取完全 , 然后经过酸水解得到薯蓣皂苷元。通过本实验 ,
得到了最佳的前处理工艺 , 按这个工艺 , 金刚藤浸膏中的薯
蓣皂苷基本提取完全 , 水解为薯蓣皂苷元 , 从而保证了分析
的准确性。
参考文献:
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(收稿日期:2007-10-15 编辑:朱民)
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第 14卷第 2期 中 医 药 导 报 2008年 2月
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