全 文 ：现代医药卫生2007年23卷第17期
种现象已在许多类型恶性肿瘤中得到验证,有可能成为评估肿
瘤风险、制定预防策略、获得早期诊断、跟踪肿瘤预后的指标及
作为肿瘤化疗、抗内分泌治疗的生物学标志[6]。ER能作为依赖
雌激素的生长因子,如它能在ER阴性细胞中恢复表达,就能通
过其他抑制因子基因再表达从而达到抑制肿瘤细胞生长。因
此,DNA甲基化抑制物出现是乳腺癌治疗的又一前景[4]。DNA
去甲基化可以诱导乳腺癌ER-β表达增强或再表达,对于提高
乳腺癌的内分泌治疗疗效和指导新辅助化学治疗有重大意义。
但DNA去甲基化恢复ER再表达的机制尚待进一步探讨。
参考文献:
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收稿日期:2007-04-20
断血流片是由断血流浸膏制成的片剂,具有凉血止血之功
效。主要用于功能性子宫出血,月经过多,产后出血,子宫肌瘤
出血,尿血,便血,吐血,咯血,鼻出血,单纯性紫癜,原发性血小
板减少性紫癜等。本品收载于《中国药典》(2005版),其质量标
准中含量测定采用液液萃取以除去杂质成分,但操作过程复杂
费时。我们采用固相萃取法(SPE)纯化断血流片的样品液,再用
高效液相色谱法(HPLC)法测定片中醉鱼草皂苷Ⅳb的含量。该
方法比较简单快速,重现性好,具有良好的重复性和回收率,可
用于改善该制剂的质量标准。
1 仪器与试药
1.1 仪器:戴安高效液相色谱仪 (P680A四元低压梯度泵,
PDA-100二极管阵列检测器,TCC-100柱温箱,Chromeleon色谱
工作站);HSE-12固相萃取装置 (天津恒奥科技发展有限公
司);固相萃取小柱(BesepSPEColumn,C18,500mg/6ml);瑞士
Precisa电子天平(XR205SM-DR);CQX25-06超声波清洗器(上
海必能信超声有限公司,功率250W,频率25kHZ)。
1.2 对照品:醉鱼草皂苷Ⅳb(110782-200301),中国药品生物
制品检定所提供。在选定色谱条件分离后按面积归一化法计算
含量为98.36%,符合含量限度要求,故含量以100%计算。
1.3 试药:甲醇为色谱纯,其余试剂均为分析纯水为重蒸馏水。
1.4 样品:断血流片,安庆乘风制药有限公司,批号:0504081,
【摘要】目的:建立固相萃取-高效液相色谱法测定断血流片中醉鱼草皂苷Ⅳb的含量。方法:色谱柱DikmaKromasilC18柱(5
μm,250mm×4.6mm),流动相甲醇–水(80∶20),流速0.8ml/min,检测波长250nm,柱温40℃。结果:醉鱼草皂苷Ⅳb在0.7715～6.136
μg范围内具有良好的线性关系(r=0.9999),平均回收率为98.57%,RSD为0.56%(n=9)。结论:该方法简便、快速、有效、灵敏、准确,具
有良好的重复性和回收率,可作为该制剂的定量分析方法。
【关键词】固相萃取法;高效液相色谱法;断血流片;醉鱼草皂苷Ⅳb;含量测定
文章编号:1009-5519(2007)17-2534-02 中图分类号:R9 文献标识码:A
DeterminationofthecontentofbuddlejasaponinsⅣbinduanxueliutabletbyHPLC
ZHANGLei,HEBing
(LuzhouMedicalColege,Luzhou646000,China)
【Abstract】Objective:ToestablishamethodforthecontentdeterminationofbuddlejasaponinsⅣbinduanxueliutabletbysolid
phaseextractionandHPLC.Methods:TheseparationwascariedoutonaDikmaKromasilC18column(5μm,250mm×4.6mm);Themo-
bilephasewasmethanol-water(80∶20);Theflowratewas0.8ml/min;Thedetectivewavelengthwassetat250nm;Thecolumntempera-
turewas40℃.Results:Thecalibrationcurveshowedgoodlinearityovertherangeof0.7715～6.136μg(r=0.9999).Theaveragerecovery
was98.57%withRSD0.56%(n=9).Conclusion:Thismethodwassimple,rapid,eficient,sensitiveandaccurate,withgoodrepeatability
andrecovery,itcouldbeusedasaquantitativeanalysismethodforthispreparation.
【Keywords】SPE;HPLC;DuanxueliuTablet;BuddlejasaponinsⅣb;Contentdetermination
SPE-HPLC测定断血流片中醉鱼草皂苷Ⅳb的含量
张 雷,何 兵
(泸州医学院药学院,四川 泸州646000)
图5 PCR电泳图
注:M为Marker(600bp),1为内参基因β-actin,2为目的基因ER-β(从左至右的顺
序是MDA-MB-231,药物干预后的 MDA-MB-231,MCF-7。
表1 乳腺癌细胞中ER-βmRNA的表达差异
细胞株
MDA-MB-231
MCF-7
药物干预前
不表达
0.54±0.44
药物干预后(48小时)
0.32±0.11
0.76±0.53
P值
<0.05
<0.05
2534
现代医药卫生2007年23卷第17期
0505102,0506181。
2 方法与结果
2.1 色谱条件:色谱柱DikmaKromasilC18(5μm,250mm×4.6
mm),流动相甲醇–水(80∶20),检测波长250nm,柱温40℃,流
速0.8ml/min,进样量10μl。
2.2 试液的制备
2.2.1 对照品溶液:取经五氧化二磷减压干燥至恒重的醉鱼草
皂苷Ⅳb对照品适量,精密称定,加流动相制成每1ml含60μg
的溶液,即得。
2.2.2 供试品溶液:取重量差异项下的本品20片,除去包衣,精
密称定,研细,取约0.3g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入
40%甲醇25ml,超声10分钟,使其溶解,离心,过滤,并通过预处
理好的C18小柱,用50%甲醇10ml洗脱,弃去洗脱液,再用4ml甲
醇洗脱,收集洗脱液,用甲醇定容到5ml,摇匀,以0.45μm的滤
膜过滤,即得。
2.2.3 阴性对照溶液:取按处方比例及制备工艺制得不含断血
流浸膏的阴性对照样品,按供试品溶液的制备方法制成阴性对
照溶液。
2.3 系统适应性试验:分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液、
阴性对照溶液各10μl,注入高效液相色谱仪,记录色谱图,结
果见图1。从图中可见,阴性对照在醉鱼草皂苷Ⅳb峰处无干扰,
即本试验条件下醉鱼草皂苷Ⅳb与其它组份分离完全,与相邻
色谱峰的分离度大于1.5,拖尾因子为0.99,理论塔板数以醉鱼
草皂苷Ⅳb峰计为8620。
2.4 线性关系考察:分别精密吸取醉鱼草皂苷Ⅳb对照品贮备
液(0.3086mg/ml)2.5、5、10、15、20μl,注入高效液相色谱仪,按
上述色谱条件测定峰面积,以峰面积值A对进样量C(μg)进行
回归,得回归方程:A=38.9612C+0.0246,r=0.9999。结果表明,醉
鱼草皂苷Ⅳb在0.7715～6.136μg范围内,峰面积值与进样量有
良好的线性关系。
2.5 精密度试验:精密吸取“2.2.2”项下的同一供试品溶液10
μL,按上述色谱条件连续进样5次,记录醉鱼草皂苷Ⅳb的峰面
积,其RSD为0.12%。表明仪器精密度良好。
2.6 稳定性试验:取“2.2.2”项下的供试品溶液,分别于制备后
0、2、4、6、8、10、12、24小时精密进样10μl,记录醉鱼草皂苷Ⅳb
的峰面积,其RSD为0.68%,表明供试品溶液在24小时内稳定。
2.7 重复性试验:取同一批样品,照“2.2.2”项下方法,制得5份
供试品溶液,分别精密进样10μl,记录醉鱼草皂苷Ⅳb的峰面
积,其RSD为0.97%。表明本方法重现性良好。
2.8 加样回收试验:精密称取已知含量的本品细粉9份,每份
约0.3g,分成3组,每组3份,分别精密添加醉鱼草皂苷Ⅳb对照
品贮备液(0.3086mg/ml)2、3、4ml,照“2.2.2”项下方法制备供试
品溶液,按上述色谱条件测定,并计算回收率。结果见表1。试验
结果表明,本法具有良好的回收率。
2.9 样品测定:分别精密量取对照品溶液和供试品溶液10μl,
按上述色谱条件测定并计算醉鱼草皂苷Ⅳb的含量,结果见表2。
3 讨论
3.1 断血流制剂中,醉鱼草皂苷Ⅳb的纯化方法,文献报道有
采用液液萃取[1,2],中性氧化铝[3],大孔树脂[4]等,但各种方法操作
过程均较复杂费时,损失较大,纯化效果也不是很理想,我们首
次采用SPE纯化断血流片的提取,纯化效果比药典法及文献法
更好。
3.2 本研究采用SPE-HPLC测定断血流片中主要有效成分醉
鱼草皂苷Ⅳb的含量,结果准确可靠,精密度,重复性好,可用于
改善该制剂质量控制。
参考文献:
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收稿日期:2007-04-24
表1 样 品 回 收 率 试 验 测 定 结 果 (n=9)
1
2
3
4
5
6
7
8
9
0.3005
0.3018
0.3006
0.3014
0.3008
0.3015
0.3002
0.3012
0.3008
测定
次数
取样量
(g)
0.9207
0.9247
0.9210
0.9234
0.9216
0.9237
0.9198
0.9228
0.9216
样品含量
(mg)
0.6172
0.6172
0.6172
0.9258
0.9258
0.9258
1.2344
1.2344
1.2344
添加对照品量
(mg)
1.5270
1.5334
1.5269
1.8377
1.8392
1.8451
2.1328
2.1303
2.1391
测出量
(mg)
回收率
(%)
98.57
平均回收率
(%)
0.56
RSD
(%)
98.24
98.63
98.18
98.76
99.12
99.52
98.27
97.82
98.63
表2 断血流片中醉鱼草皂苷Ⅳb含量测定结果(mg/片,n=3)
批 号
0504081
0505102
0506181
醉鱼草皂苷Ⅳb含量
0.92
1.02
0.83
RSD
0.57
0.81
0.61
A B
C
图1 醉鱼草皂苷ⅣbHPLC色谱图
A:对照品溶液
B:供试品溶液
C:阴性对照溶液
2535