全 文 ：化学学报 AC ]队 CH ][ MI 以S I NI C AI 望用 ,肠 , 1 35 一 n 4
苦瓜子蛋白的分离纯化及其性质研究
叶国杰 “
顾梓伟
钱瑞卿
金善炜
卢保元 ’
{汪 酬
(中国科学院上海有机化学研究所 上海 加田32
摘要 从苦瓜种子的粗提物苦瓜子蛋白丙酮分级沉淀干粉中 ,用 c M 一 阮phad e x C 一 50 和 跳户耐 e x
G 一 75 分离得到了两个核糖体失活蛋白 , 。 一 苦瓜子蛋白 ( a 一
~
ha ` n , a 一 MM )C 和 召一 苦瓜子
蛋白 (月一
~
11a ir n
,月一 M MC ) ,其等电点分别为 9 . 10( a 一 MM C ) , 9 . 32 (口一 MM C ) . 用 叹 一 Ms 和
M AIO -I 功F 一 MS 测定它们的分子量 ,分别为2562 5 ( 口 一 M M c ) , 29价 6 (月一 M MC ) ( + N a , 29 09 9 ) ; , 28
795 (
a 一 MM )C
,
29 a7 4
.
7( 夕一 M M )C . 它们都是糖蛋白 . 其生物活性的分析测定表明 ,都属于 RN A N
一 糖昔酶 . 本文重点对 尹一 苦瓜子蛋白的分离纯化及其性质进行详细报道 ,并对其 N 一 端部分的氨
基酸顺序进行了测定 .
关键词 苦瓜子蛋 白 ,核搪体失活蛋 白 , NR A N 一 糖普酶 ,分离纯
天 花粉 蛋 白 ( irT e hosan ht i
n ,
CT S )是从葫芦科植物 ( C u e u山 iact ea )括楼 属 ( 乃交彻s 。瓜九郎
“ 月肠叨￡i M压石m )的块根中提取出的一种蛋白质 [’ 〕 . 由于其特殊的生理 、药理和免疫性质 ,对它的
研究和应用已经相当的系统和深人〔2 一 6 1 . 特别是发现 v[] 天花粉蛋 白具有抗艾滋病病毒 H IV 一 1
的活性之后 ,对从植物中分离筛选具有类似生物活性的蛋 白质的研究 ,更引起了人们广泛的兴
趣 [ 8 一 10」.
由于天花粉蛋 白的强抗原性等引起的临床副反应 , 限制 了它 的更广泛与重复使用 . 为寻找
既具有与天花粉蛋 白类似生物活性 ,又不存在与它有交错免疫反应的物质 , 我们在天花粉蛋 白
工作的基础上 ,对其它类属植物中具有与天花粉蛋 白类似性质 的蛋 白质也开展 了深人的结构
与功能研究 .
苦瓜为葫芦科 (uC e u 山iact ea )苦瓜属 ( oM lon 由滋a cl 浓ar nt 么 L
.
)植物 ,广泛生长于亚热带地
区 . 在我国民间长期作为药材用于治疗痢疾 、皮疮 、 中毒 〔川 、 以及降低血糖治疗糖尿病〔’ 2 一 ’ 4〕 .
印 年代 , 对苦瓜的果汁降血糖作用的研究 中 , 已有初步结果提示苦瓜可能含有引产活性成
分 I’ 2 一 ” 〕 . 1984 年
,
h 阴 g 等 [’ 6〕报道从苦瓜的种子中分离得到 了其中的二个引产活性成分 , 称
之为 口 一 ,夕一 苦瓜子蛋白 ( 。 ,月一
~
hiar
n , 。 ,月一 M M )C . 其后 ,及 n g 等〔` 7〕在其苦瓜胰蛋 白
酶抑制剂的研究工作中 ,也成功地分离得到了这两个蛋 白质 . 从 1986 年开始 , 叶国杰在其硕士
论文 〔’幻和博士论文 f ’ 9〕期间 ,对 。 一 ,夕一 苦瓜子蛋白的分离纯化 、理化性质和生物 活性进行 了
比较系统的研究 ,并基本完成了 夕一 苦瓜子蛋白的一级结构 的测定 .
198 0 年 u 等〔刘从苦瓜子中分离得到二个凝集蛋白 ( u 称之为 F皿 it on l 和 FarC it on 11) ,从
, 男 , 28 岁 , 博士 , ` ’ 肠 v le r V圃 伍 Ico lo群 l j 山江卜e U in v碱 yt of 伽 c卿 , gl 0 E 58 ht S切 e t hiC 加粤〕 , IL 以拓 37 , U . S . A
收稿日期 : 1卯7 一 10 一 13
1 1 6 3化学学报 AC A TC印 M l以 SI NI以19 8
其报道的 N一 端7 2个氨基酸顺序比较发现 ,与我们所得 的 。 一 , 月一 M M C 的测定结果是完全
一致的 ,但其所测分子量和氨基酸组成与我们的结果有较大的差异 , 也没有进一步的生物活性
方面的报道 .
目前 , 对 。 一 ,月一 MM c 的研究在国内外也相 当的活跃 , 对它们的分子量 〔’ 7 , lz] 、 氨基酸组
成 〔川 、二 级结构「川 以生物 活性 , 如 引产 、 抗肿瘤【川 、 抑制艾 滋病病毒 H vl 一 1 的感染 和复
$J[ 洲 、脱氧核糖核酸酶 〔洲等活性的研究结果均 已逐渐报道 . 对 。 一 MM c 的一级结构 〔27, 洲以及
晶体结构方面的研究〔州也有沐同的报道 .而对 月一 M M c , 自熊建平等「刘对其晶体结构的初步
分析结果报道以来 , 尚未见有更进一步的研究报道 .
本文报道了本实验室 自 19 86 年开始的对苦瓜子蛋 白的分离纯化 、 主要的理化性质及生物
活性方面比较系统的研究结果 ,以及利用 E SI 一 M S , MA DL I 一 m F 一 M S 对 。 一
,月一 MM C 的分析
测定结果 . 与天花粉蛋白不同 , 。 一 ,月一 MM C 都是具有 RN A N 一 糖昔酶活性的糖蛋白 . 本文重
点对 月一 MM c 的性质进行了深人研究 ,关于 月一 MM C 一级结构 以及 月一 M M C糖链部分结构的
研究结果将另行报道 .
1 实验
1
.
1 材料和仪器
苦瓜子系每年 7 月至 9 月于上海市郊 (七宝乡和虹桥附近 )新鲜采集而得 . 竣 甲基葡聚糖
凝胶 C 一 50 ( CM 一 阮p h a d e x C 一 50) ,磺酸丙基葡聚糖凝胶 C 一 25 ( SP 一 曳p h a d e x C 一 25 )和葡聚糖
凝胶 G 一 75( eS p h a d e x G 一 75) 等为 外~ a c i a 产品 ;丙烯酞胺
,
N
,
N’ 一 亚甲基双丙烯酞胺 , sD s
为 BDH 产品 ;用于 S D S 一 聚丙烯酞胺凝胶电泳的标准蛋白系 R ecr e 和 is 目皿a 产品
. 用于 NR A N
一 糖昔酶活性测定的 RN A 提取用的苯酚为分析纯并新鲜蒸馏 ,苯胺为分析纯并经新鲜蒸馏后
立即充氮气分装 , 封管后 一 20 ℃保存 . irT s ,月一 丙氨酸 ,甘氨酸购 自上海伯奥生物科技公司 . 其
余未经注明试剂皆为分析纯试剂 .
高压液相 仪为 w a t e o 4 84 Hp LC 勿s emt ; 毛 细管 电泳仪为 ecB k n l出 1 P/ A c E vsS emt 550型 ; 电喷雾电离质谱仪器为英 国 V G uQ at tID GC / MS / MS , 采用美国知目尹ic 电 喷雾离子源 和
M ax
c咖ex 公司软件 . 气相顺序仪为 A pp l ied iB , sy emt Mdoe l 47 o A型 .
1
.
2 实验方法
1
.
2
.
1 苦瓜子蛋 白的分 离纯化 新鲜采集的苦瓜子去壳取仁后 , 称取湿重为 50 9 的苦瓜子
仁以预冷的 1《x x〕rnL O
.
9% Nac l 溶液浸泡并机械捣烂 ,于 4℃放置过夜 . 离心 ( 170 x l o rp l l l , 4℃ ,
加而 n ) ,上清液以 0 . 8倍体积 的冰冷丙酮沉淀 , 离心后取上清液再以 1 , 2 倍体积冰冷丙酮沉
淀 , 同样条件下离心后沉淀部分以 轰刃 m工双蒸水浸泡 ,于 4℃置于透析袋中对蒸馏水透析 4h8 ,
离心 ,上清液冷冻干燥 ,得 8 一 10 9苦瓜子蛋 白丙酮干粉 .
取 so mg 苦瓜子蛋白丙酮干粉 ,溶于 IOmL pSH
.
0
,
0
.
05 mo F L 的磷酸盐缓冲液 (BP s) 中 ,离
心除去不溶物后 ,清液上 CM 一 阮 ph a d e x C 一 50 柱 (5 . sc m x 25 cm ) , 用 0 . 05 mO F L 的 BP S 缓冲液
平衡 , 以 120 mL 0
.
05 m
o F L 磷酸盐缓冲液 ( pH S . 0) 和 1 20 mL 0
.
05 m o F L 磷酸盐缓冲液 ( p H g . 0 ,
含 O . 30 n l o l/ L N aC )I 作线性梯度洗脱 . 分管收集 , 流速 11111/ 而 n , 每管收集 or mL ,用紫外 280 ln
检测 . 共得四个层析峰 ,分别命名为 CM 一 1 , c M 一 2 , CM 一 3 和 CM 一 4 , 峰 CM 一 1 , CM 一 4 的冻干
粉再分别以 阮p h a d e x G 一 75 层析柱 ( c3 m x 15c0 m )凝胶过滤 ,经 o . 05 onI F L 的 cA o H 洗脱 ,分别
化学学报 A C] 从 C刊M[ 1以 S IN I以 19 8 1 1 3 7
~
_二
可得 。 一 和尹一 MM c .
1
.
2
.
2 RP
一 HP LC 法纯化苦瓜子蛋白卿 〕 在 orP iet n c4 柱 ( v y d a c仪 , c at # 2 14仍4 )柱上进行
梯度洗脱 ,洗脱液为 : A , 0 . 1% TF A 一 玩。 ; B , 0 . 1% T FA 一 so % c玩 c N 一 玩。 ,梯度为 : o 一 20 一 35
一
45 而 n , 0 一 o 一 o 一 O B% . 检测波长为 23 0 ln .
1
.
2
.
3 毛细管电泳【3z] 在毛细管 75 脚 、 5 7 c m ( B ec k m an NI C . )上进行 . 洗脱液为
2X() mrn
o l/ L oB ir
o
cA 记 , PH or 一 10
.
2
.检测器 50 cm , UVZ 14mn ,工作电压 巧 kV , l o mA
,压力进样 .
1
.
2
.
4 苦瓜子蛋白分子量的测定 用 sE l 一 M s 方法【刘和 MA LD I 一 oT F 一 M s 方法〔到测定 .
1
.
2
.
5 等电点的刚定 按 Yagn 等【川报道的离子交换结合法测定
.
1
.
2
.
6 中性糖含量 的测 定 用 SD S 一 PA GE 电泳后 并经 过碘酸 一 品红 (几万od iC ac id -
s山 ted y e , PA )S 染色〔划定性测定 ,用硫酸 一 苯酚法 〔列定量测定中性总糖含量 . 以天花粉蛋 白作
阴性对照 ,鸡卵清白蛋白作阳性对照 .
1
.
2
.
7 生物活性的刚定 1 )引产活性的测定 ,试验动物为妊娠 12 天左右的小鼠 ,采用一次性
肌肉注射 ,两天后解剖并记录每只鼠的死胎数 (包括吸附点 )和活胎数 目 ,每只鼠的引产活性是
该鼠的死胎数与总胎数之比 . 总的引产活性为试验鼠数的平均值 . 重复进行两次试验 .
2) 蛋白质合成抑制活性的测定实验方法参见文献「3 8 ] .
3) RNA N
一 糖昔酶活性的测定依据 Edon 等【到报道 的方法并加 以改进
. 将鼠肝核糖体悬浮在
冷的 irT s 缓冲溶液 (25 ~ F LT
ir s 一 H CI
,
p7H
.
6
,
25
~
F L KC I
,
Sln
o F L M薛 b )中 , 以玻璃匀浆
器轻轻匀浆 , 再用 irT s 缓冲溶液稀释至 30 A、 mn 单位 / mL , 加人待测糖昔酶 活力的样品 10 -
l o gn ( 3 A姗unI 单位 / mL ) , 于 37 ℃保温 15 而 n
. 向反应体系中加人 0 . 1 倍体积 的 10 % SD (S 在
s o lnr
o l / L irT
” 一
CH I
,
p7H
.
6的缓冲溶液 中 ) , 再加 入等体积 7 0多水饱 和 的苯酚抽提 , 水层
再用等体积的氯仿 一 异戊醇 ( 24 : 1 , v/ v) 抽提一次后 , 以 3 倍体积的 95 % 乙醇 (含 1% KOA 。 )沉
淀 . 沉淀用 70 % 乙醇洗三次 ,真空干燥后溶于灭菌水中 , 经测 A , mn 值确定 r RN A量 ( I A~ 单位 = 叨拌 9 r RN A ) .
取 5鸿以上所得的 r RN A , 加灭菌水至 or 匹 ,再加人 or 拜L乙酸 一 苯胺缓冲溶液 ( 2 . o mol / L ,
p4H
.
5
,苯胺 : 乙酸 :水为 2 : 6 : 3 ) , 混匀后于 60 ℃水浴中避光保温 10 而 n , 置于干冰上以终止反
应 . 川四A 以乙醇沉淀回收 ,并以 2 . 5%丙烯酞胺 一 0 . 5% 琼脂糖复合胶进行电泳分析 .
1
.
2
.
8 。 一 M c
,夕一 M cM 的氛基酸组成分析〔创 约 0 . smg 的蛋白质样品 ( 一 18 rnU o l )置于硬
质水解试管中 , 加人 以刃拜L 恒沸盐酸 ( 5 . 7mo F L , 内含 0 . 02 % 苯酚 ) ,抽真空 , 充氮气后封管 , 于
1 10 ℃恒温水解 24 h . 开封后抽干反应液 ,残渣溶于 0 . ZmL pZH
.
2 柠檬酸缓冲液 , 离心后取 50 匹
溶液在氨基酸分析仪 ( L KB 神阅 )上进行分析 . 重复测定在 B ec kman 63 0 上进行
,并相互校正 .
蛋白质的场 残基是通过 比色法 [’l ]测定的 .
1
.
2
.
9 尹一 M M C 的 N 一 端部分氛基酸顺序的刚定 用 A lnP ied iB o sy emt M ed l 47 0A 型气相顺
序仪测定 .
2 结果与讨论
.2 l a
,声一 MM C 的分离纯化
图 1 给出苦瓜子蛋白丙酮干粉在 c M 一 enS had xe C 一 50 柱上的洗脱结果
,得到的四个层析
峰经 SD S 一 P AGE 显示 ,均含不均一的蛋白质混合物 ,其中 CM 一 1和 CM 一 4 的电泳主色带的位

化学学报 AC T AC 印M [C I AS I I N以 198 1 19 3
. 2 2P
一M MC 的I R .一 HI PJC 和 11PC E
夕一MMC 的 P R一 l H p刀 和 H pC E 结果分别如图 5 和图 6 所示 , 根据积分面积计算显示其纯
度为 97 % 以上 ,
.2 3 a
,夕一 MM C 分子 , 的测定
根据 SD S一 PAG E估计它们的分子量均为 2侧 I X) 左右 .用 E SI 一 M S方法测定它们的分子量
分别为 2 8625 和 2 90 7 6 ;用 M ALD I一 DT F一 M S方法测得 。 一 M M c 的精确分子量为 2 8 7 95 ,而 月-
M M C 的精确分子量为 办刃7 4 . 7 .
2
.
4 等电点的测定
测得 。 一 M M C ,月一 M M C 的等电点分别为 9 . 10 和 9 . 32 .
2
,
5 中性糖含 , 的测定
。 一 MM c J月一 MM c 经 sD s 一 PA GE 电泳后并经过高碘酸 一 品红染色 ,结果说明它们均为糖
蛋白 . 据硫酸 一 苯酚法测得 。 一 M M C ,夕一 MM C 的中性总糖含量分别约为 1 . 3% 和 1 . 5% ,而作
为对照的鸡卵清白蛋白的中性总糖含量为 1 . 6 % .
-o月Y-o刊叫
t 反 12 . s m i n
保留时间 /m in
t 反 3 7
.
l m i n
保留时间 / m in
图 5 月一 MM C 的 RP 一 Hp LC 分析图
柱 : c4 一 P刚 e in V yd aC 伽~ ( o
.
s cm
x 30 c m ) ;
洗脱液 : A : 0 . 1% 1下A ;
B : so % C玩 CN 一 珑 O 一 0 . 1% T下A ;
梯度 : 0 一 20 一 30 一 35 一 45 ~ O一 印 一 印 一 O 一 OB % ;
检测波长 : U V 28 0unY
2
.
6 生物活性的测定
2
.
6
.
1 引产活性的刚定 平均试验结果列于表
圈 ` 夕一 MM C 的 1开℃E 图
毛细管 : 75脚 x 57 cm , B 即b l 切 。 p ;
洗脱液 : 2印~ F L硼酸
,
p H or 一 10
.
2 ;
工作电压 : 巧vk ;纸速 : 0 . 25 e . 丫~ ;
进样方式 :压力进样 ;进样时间 : ls ;
检测波长 : U’V 1Z 4 n l

化学学报 A C ]队 C扣 [ M ICA SP叮 CA I卯8 1 14 1
大鼠肝核糖体 (A 3姗单位/ m L)与不同量 (0 1一l on g)的 R P I在 3 7℃处理 巧而n , 抽提其
出四A 并用盐酸苯胺于 印℃处理 巧而 n ,再用 5% 丙烯酞胺 一 0 . 5 %琼脂糖复合凝胶 电泳分析
澳 乙锭显 色 . 各泳道 的川四A样 品分别来 自经下 述 R IP 处 理 过 的核糖体 : L川 e l , 2一 CT S ,
L川 e 3一s 一 MM e (小分子 一 MM e ) , I刀 l e 4 , 5一月一 M M e , I泊旧e 6一 a 一 M M C ; 其 中 L川 e l , 5
的 川四A样品未经盐 酸 一 苯胺处理 , L m e Z , 3 , 4 , 6的样 品经盐酸 一 苯胺处理 . 箭头表示从 28 5
出四A 经盐酸苯胺处理后释放的 RN A 片段 .
2
.
7 a 一 加卫以C .口一 MM C 的氨基酸组成分析
。 一 M MC ,月一 M MC 的氨基酸组成分析测定结果如表 3 所示 .
表 3 a 一 M M C , p 一 h 皿城C 的氮基酸组成 (残墓数目 )
氨基酸 a 一 M MC 月一 M MC
26
.
5( 27 )
15
.
2 ( 15 )
16
.
4 ( 16 )
抖 . 7( 25 )
12
.
2 ( 12 )
15
.
3 ( 15 )
2 3
.
1 (23 )
(
一
) ( 0 )
15
.
5 ( 16 )
1
.
7 ( 2 )
18
.
3 ( 18 )
.
7 (27 )
.
3 ( 13 )
.
4 ( 10 )
.
7 ( 3 )
.
4 ( 10 )
.
6 ( 16 )
92 ( l )
27
.
7( 28 )
2()
.
9 ( 2 1 )
16
.
1 ( 16 )
23
.
3( 23 )
9
.
2 ( 9 )
8
.
3 ( 8 )
2
.
2( 2 )
(
一
) ( 0 )
15
.
6 ( 16 )
(
一
) ( 0 )
18
.
3 ( 18 )
24
.
3( 24 )
15
.
4 ( 15 )
15
.
6 ( 16 )
3
.
9 ( 4 )
15
.
7 ( 16 )
11
.
2 ( 1 1)
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娜饭erSluGoPy枷vsCVaMtle腼介阮蹦L纯
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、`ù.
8 5 ( l )
总计
` 饰 以比色法测定 .
.2 8 尹一 M M C
用 A耐 ied
的 N 一端部分氮基酸顺序的测定
iB os ys emt M ed el 47 0A 型气相顺序仪测得 月一 M MC 的 N - 端部分氨基酸顺序为 :
20
A即 一租 一 A曰 1 一 伟 e 一 灿p 一 L以 1一 阮 ` 1l l r 一 枷 一 卫止 一恤 一咖 - 叨比 一 yrT = n叹 一 srL 一 Phe 一 珑 一 luG 一 A男 , -
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外 e 一 A电 一 川 a 一 n l r 一 】云 . 一 P功 一 P卜e 一 悦 r 一 珑卜伽 一 Val 一今 一 ASP 一 ne 一 1恤〕 一 1戏 . 一 1戏 l一 T尹一
a 一 M M C ,夕一 M MC 是二个大小非常相近 (月一 MM C 稍大一些 )的碱性糖蛋 白 . 它们具有非
常类似的理化性质和生物活性 . 夕一 M M C 的引产活性要较 a 一 MM C 的低一些 ,这也有可能因为
月一 MM C 较易变性之故 . 在 RN A N 一 糖昔酶活性测定中发现 , a 一 M M C ,夕一 MM C 均具有 NR A
N 一 糖昔酶活性 ,它们与天花粉蛋白一样 , 能在鼠肝核糖体 285 r RN A 上产生一个 “ 苯胺 一 敏感
位点 ” ( inA h娜 一汕le is et ) ,这可以从 285 川NL A 经苦瓜子蛋白修饰并经苯胺处理后产生的一个
约含 50 个碱基的 RN A 片段 (如图 7 箭头所示 )看出 .
o bir g 等〔侧曾认为 ,核糖体失活蛋 白可能含有的核糖核酸酶活性也许与核糖体失活机制
有关 . 在图 7 中我们也发现 , 核糖体经 夕一 M M C作用后但未经苯胺处理的 出四A 抽提物经电泳
1 12 4 化学学报 A ] C陕 C刊 M [1 以 S I N】以19 8
后也显示有一约 50 碱基的 R NA片段 ,这也说明至少是 夕一 M MC 具有 RN A 酶的活力 ,而天花
粉蛋白则未发现这种情况 ,这说明天花粉蛋 白是一种专一性较苦瓜子蛋白更强 的 RN A N 一 糖
昔酶 .
a 一 M M C ,月一 M M C 的质谱法所测得的分子量说明 , 月一 MM C 要较 。 一 M M C 大 . a 一 MM C 中
糖部分的结构研究 阐明〔列 ,其糖链部分含有 Z lG c N HA c , IM an , I uF c , l xlr
,其分子量为 862 . 依据
MA L D I 一 m F
一 M S所测得 的 a 一 M M C分子量 2 8 7 9 5 ,减去糖链部分的贡献 ,则 a 一 MM C中蛋 白
部分的分子量为 27 93 . 04 ,刚好与 H。 等仁刘所报道的 。 一 MM c 氨基酸序列减去 c 一 末端部分
13 个残基后计算所得的分子量 27 9 29 非常吻合 , 这说明 a 一 M M C 应含有 25 0 个残基而不是 26 3
个残基 . 这似乎与 FnU as tu 等〔洲报道的结果更吻合些 .
我们用比色法测得 月一 M M c 含有一个色氨酸 . 而 iM n厕 等〔4 〕19 2 年报道 ,月一 MM c 含有
两个色氨酸 . 后来我们又重复比色法测定 , 显示 尹一 M M C 仅含有一个色氨酸 ;另外 ,我们又采
用 B N飞 一 S k a to le 降解 夕一 M MC ,对降解产物分析后证实 月一 MM C 只含有一个色氨酸 (另文发
表 ) ; x 衍射实验也证实了这一点 [如 .
对 月一 M MC C 一 端部分的氨基酸序列 , 我们曾重复多次地进行了 月一 M M C 的狡肤酶 A 的
降解试验 ,但一直无明显的结果 , 几乎不酶解 . 这说明 月一 MM C 的 C 一 端部分氨基酸残基是一
些对竣肤酶 A 不敏感的残基 . 月一 MM C 的狡肤酶 Y 降解后相当复杂 , 但可以判断出它的 C -
末端不是碱性氨基酸如崛 , 场 s 或 iH s 等 .
致谢 中国科学院上海生物化学研究所刘望夷教授 、 张劲松同学协助测定了 NR A N 一 糖昔酶
活性 ;中国科学院上海细胞生物学研究所熊用周教授帮助测定了蛙卵试验 ;沈阳市计划生育研
究所刘国武教授帮助测定了引产活性 ;复旦大学柴常新教授协助进行了氨基酸序列测定 ,在此
谨致谢意 .
凡业护解邢
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反苗. U . S . A , 1如 9 , 邵 , 2争抖 .
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