全 文 ：网络出版时间:2015 － 8 － 20 16:47 网络出版地址:http:/ /www． cnki． net /kcms /detail /34． 1073． Ｒ． 20150820． 1647． 012． html
苦瓜子有效成分 ＲNA酶 MC2 抑制肝癌细胞生长
苏曙光1，王晓华2，赵 震1，郭经锋3
摘要:目的 探讨苦瓜子有效成分 ＲNA酶MC2(ＲNase MC2)在肝癌细胞生长中的作用及其机制。方法 应用MTT、克隆形成
和体内裸鼠成瘤实验研究 ＲNase MC2 对肝癌细胞增殖的影响，流式细胞技术检测 ＲNase MC2 对肝癌细胞周期的影响，电镜检
测 ＲNase MC2 诱导的细胞自噬，Western blot 法检测 ＲNase MC2 作用引起的蛋白变化。结果 体内外实验结果显示 ＲNase
MC2 显著抑制肝癌细胞增殖;上调 p53 和 p21 蛋白表达导致 G2 /M 期阻滞;增加 Beclin-1 和 LC3-Ⅱ蛋白表达诱导细胞自噬。
ＲNase MC2 在体内外均能增强 Sorafenib对肝癌细胞的杀伤能力。结论 苦瓜子有效成分 ＲNase MC2 可能通过细胞周期阻
滞、诱导细胞自噬而显著抑制肝癌细胞的生长，并可增强 Sorafenib对肝癌细胞的治疗效果。
关键词:肝肿瘤;ＲNase MC2;细胞周期;细胞自噬
中图分类号:Ｒ 735． 7 文献标志码:A 文章编号:1001 － 7399(2015)08 － 0890 － 05
doi:10． 13315 / j． cnki． cjcep． 2015． 08． 012
ＲNase MC2 manifests antitumor effects towards human hepatocellular carcinoma
SU Shu-guang1，WANG Xiao-hua2，ZHAO Zhen1，GUO Jing-feng3
(1Department of Pathology，2Department of Nephrology，3Department of Oncology，Hexian Memorial Hospital Affiliated to Southern
Medical University，Guangzhou 511400，China)
Abstract:Purpose To determine the effect of ＲNase MC2 purified from momordica charantia on cell growth of hepatocellular carcino-
ma (HCC)and its underlying mechanism． Methods MTT，colony formation and nude mice model were used to examine the activity
of ＲNase MC2 in cell proliferation． Cell cycle analysis was done by flow cytometry． Autophagy induced by ＲNase MC2 treatment was
observed via transmission electron microscope． Western blot was performed to detect the ＲNase MC2-mediated changes of proteins． Ｒe-
sults In vitro and in vivo data showed that ＲNase MC2 markedly inhibited HCC cell proliferation，arrested cells at G2 /M phase by in-
creasing expression of p53 and p21，induced autophagy via upregulating Beclin-1 and LC3-Ⅱ． Furthermore，combination of ＲNase
MC2 and Sorafenib exerted enhanced lethal effect on HCC cells． Conclusion ＲNase MC2 manifests significant antitumor activities
and enhances the killing effect of Sorafenib in HCC via inducing cell cycle arrest and autophagy．
Key words:liver neoplasms;ＲNase MC2;cell cycle;autophagy
收稿日期:2015 － 03 － 03
基金项目:广州市番禺区科技计划(2013-Z03-20)
作者单位:南方医科大学附属何贤纪念医院1 病理科、2 肾内科、3 肿
瘤科，广州 511400
作者简介:苏曙光，女，硕士，主治医师。E-mail:574169886@ qq． com
肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是全
球常见的恶性肿瘤之一。由于目前治疗技术尚未取
得突破性进展，HCC 具有高度抗药性，病死率位居
癌症死亡的第 3 位［1］。已有的研究表明从天然植
物，特别是从中草药中提取有效成分筛选抗肿瘤药
物是治疗肿瘤的潜在可行途径之一，其中某些有效
成分能显著抑制 HCC 细胞的生长。如 Zhang 等［2］
发现二氢青蒿素(dihydroartemisinin)可以通过下调
Mcl-1 的表达抑制肝癌细胞的生长。Lin 等［3］证实
黄连种子(livistona chinensis seed)能有效抑制 HCC
的血管生成。ＲNA 酶 MC2(ＲNase MC2)是从饮食
苦瓜子中提取的一种核糖核酸酶，研究显示可通过
诱导细胞凋亡而抑制乳腺癌和 HCC细胞的生长［4］。
本文应用细胞和动物模型，进一步探讨 ＲNase MC2
对 HCC细胞生长的影响及其可能的机制，为 HCC
的治疗提供理论依据。
1 材料与方法
1． 1 材料 人类 HCC 细胞株(QGY-7703 和 Bel-
7402)购 买 于 American Type Culture Collection
(ATCC，Manassas，VA)。ＲNase MC2 由中山大学
附属肿瘤医院张志毅博士提供，用纯水溶解成 5. 0
mmol /L储存液。Sorafenib 购自 Sigma 公司，用纯水
溶解成 5 mmol /L储存液。
1． 2 方法
1． 2． 1 细胞培养 人类 HCC细胞株(QGY-7703 和
Bel-7402)培养在 CO2 培养箱中，条件:培养基为加
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入 10% 胎牛血清的 DMEM(Gibco，Gaithersburg，
MD) ，5%CO2，95%湿度和 37 ℃。
1． 2． 2 MTT 法 细胞活性经 MTT 法测定。8 000
个细胞在 96 孔板中培养 24 h，加入不同浓度(即 0、
0. 3、0. 6、1. 2、2. 5、5、10、20 μmol /L)的 ＲNase MC2，
继续孵育 48 h。然后每孔加入 100 ml的MTT溶液，
作用 2. 5 h。去除上清液后，每孔加入 100 ml 的
DMSO溶液，晶体充分溶解后在分光光度计中读取
570 /630 nm数值，最后进行统计分析。
1． 2． 3 克隆形成实验 100 个 HCC 细胞培养于 6
孔板中，7 天后加入含有 2. 5 或 5. 0 μmol /L ＲNase
MC2 的培养基，继续孵育 7 天。甲醇固定集落后用
0. 05%结晶紫染色 5 min，后计算集落数量。
1． 2． 4 细胞周期检测 ＲNase MC2 作用 HCC 细胞
不同时间后，预冷 PBS 洗涤细胞后，用 70%的乙醇
在 4 ℃冰箱中固定过夜。预冷 PBS 洗涤 3 次，加入
含有 50 mg /ml PI 和 50 mg /ml ＲNase A 的 PBS，黑
暗处放置 30 min。流式细胞仪检测处于不同细胞周
期的细胞数量。
1． 2． 5 Western blot 法 ＲIPA 提取细胞总蛋白，加
入 SDS上样缓冲液，沸水中作用 10 min后进行 SDS-
PAGE。随后，利用湿转将蛋白转移至 PVDF 膜上，
5%脱脂奶粉室温封闭 1 h，加入一抗后，4 ℃过夜。
TBST洗涤 PVDF 膜 3 次，每次 5 min，加入二抗，室
温孵育 1 h，TBST洗涤 3 次，每次 10 min。加入 ECL
后，暗室显影。
1． 2． 6 裸鼠成瘤实验 1 × 107 HCC 细胞用 PBS 悬
浮后注射进裸鼠右背部，待肿瘤形成后，隔天测量肿
瘤大小。裸鼠被随机分为 3 组(每组 6 头雄性 4 周
龄裸鼠) :对照组给予生理盐水;单独组给予 1 mg /
kg鼠重 ＲNase MC2 或 30 mg /kg 鼠重 Sorafenib，每
周 5 次;联合组给予 0. 5 mg /kg 鼠重 ＲNase MC2 和
30 mg /kg鼠重 Sorafenib，每周 5 次。给药 28 天后，
处死裸鼠并取出肿瘤称重。
1． 3 统计学方法 采用 SPSS 16. 0 软件进行统计
学分析。One-way ANOVA 或 Student t 检验数据间
的差异。P ＜ 0. 05 为差异有统计学意义，数据均以珋x
± s表示。
2 结果
2． 1 ＲNase MC2 抑制 HCC 细胞的增殖 本组用
不同浓度 ＲNase MC2(0 ～ 20 μmol /L)处理 HCC 细
胞株(QGY-7703 和 Bel-7402)24 h 后，HCC 细胞株
的细胞活性被 2. 5 μmol /L 以上浓度的 ＲNase MC2
显著抑制(P ＜ 0. 05) (图 1A) ，而 48 h 后，更低浓度
的 ＲNase MC2(0. 6 μmol /L)能有效抑制 Bel-7402
细胞增殖(图 1B)。根据上述结果，选取 2. 5 和 5. 0
μmol /L两种浓度的 ＲNase MC2 进行后续实验。克
隆形成结果显示，ＲNase MC2 作用能明显降低 HCC
细胞的克隆形成能力，其中，在 2. 5 μmol /L ＲNase
MC2 作用下，HCC细胞形成的集落数量减少约 50%
(图 1C)。裸鼠成瘤实验中，腹腔注射 1. 0 mg /kg
ＲNase MC2 能显著抑制肿瘤生长，用药 3 周后，肿瘤
基本停止生长(图 1D)。
图 1 ＲNase MC2 抑制 HCC细胞的增殖:A．不同浓度作用 HCC 细胞 24 h后，MTT法检测细胞活性;B．不同浓度 ＲNase MC2 作用 HCC 细胞
48 h后，MTT法检测细胞活性;C． HCC细胞在 2. 5 和 5. 0 μmol /L ＲNase MC2 作用下的克隆形成数量统计;D． HCC细胞 Bel-7402 注射入裸鼠皮
下生长 1 周后，隔天腹腔注射 1. 0 mg /kg ＲNase MC2 并记录肿瘤生长情况;* P ＜ 0. 05;#P ＜ 0. 01
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2． 2 ＲNase MC2 诱导 G2 /M期阻滞 流式细胞技
术结果发现 ＲNase MC2 作用 HCC 细胞 24 h 后，细
胞发生 G2 /M 期阻滞(图 2A)。以 2. 5 μmol /L 为
例，G2 /M期的 QGY-7703 和 Bel-7402 的细胞百分比
分别为(29. 85 ± 3. 65)%和(36. 87 ± 5. 26)%，而对
照组中的细胞数量百分比为(17. 65 ± 4. 58)% 和
(23. 41 ± 3. 58)%，差异有统计学意义(P ＜ 0. 05)。
Western blot 法结果显示 ＲNase MC2 处理后，HCC
细胞中 p53 和 p21 的表达发生明显上调，而 Cyclin
A和 Cyclin E的表达变化不明显(图 2B)。
图 2 ＲNase MC2 诱导 G2 /M期阻滞
A． ＲNase MC2 处理 HCC 细胞 24 h 后，流式细胞术检测细胞周
期情况，* P ＜ 0. 05;#P ＜ 0. 01;B． Western blot 法检测 p53、p21、Cyc-
lin A、Cyclin E的蛋白水平
2． 3 ＲNase MC2 诱导细胞自噬 利用四甲吖啶
(acridine orange，AO)染色，进一步观察 ＲNase MC2
诱导的细胞质内酸性自噬泡(acidic vesicular organ-
elles，AVO) (图 3A)。统计结果表明 ＲNase MC2 处
理后的 HCC细胞中，AVO数量明显增多(P ＜ 0. 01，
图 3B)。电镜结果显示，ＲNase MC2 作用后的 HCC
细胞中可见多个自噬小体形成(图 3C)。同时，Bec-
lin-1 和 LC3-Ⅱ表达上调提示细胞自噬的发生(图
3D)。
图 3 ＲNase MC2 诱导细胞自噬
A． 2. 5 μmol /L ＲNase MC2作用 24 h后，AO染色显示细胞质内酸
性自噬泡形成;B．柱状图显示 AVO 数量并统计分析(#P ＜ 0. 01) ;C．
电镜结果显示 ＲNase MC2诱导自噬小体形成(* 指示位置) ;D． West-
ern blot法检测 Beclin 1和 LC3-Ⅱ的表达变化;GAPDH为内参基因
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2． 4 ＲNase MC2 增强 Sorafenib 杀伤 HCC 细胞
能力 在 HCC 细胞株中单独使用 1. 0 μmol /L
ＲNase MC2 或 5 μmol /L Sorafenib 不能降低肿瘤细
胞活性，但同时联合使用两种药物 24 h 后，HCC 细
胞活性显著下降(P ＜ 0. 05，图 4A)。体内实验结果
显示联合使用 0. 5 mg /kg ＲNase MC2 和 30 mg /kg
Sorafenib显著抑制 HCC 细胞体内成瘤能力(图
4B)。给药 28 天后处死裸鼠，其中对照组、Sorafenib
组、ＲNase MC2 组和联合给药组的鼠重差异无显著
性。肿瘤重量分别为(3. 51 ± 0. 15)、(2. 34 ±
0. 10)、(2. 36 ± 0. 09)和(1. 51 ± 0. 08)g。以上结
果表明联合使用 ＲNase MC2 和 Sorafenib 能显著抑
制肿瘤生长。
图 4 ＲNase MC2 增强 Sorafenib杀伤 HCC细胞能力
A． 单独或联合 1. 0 μmol /L ＲNase MC2 或 5 μmol /L Sorafenib作
用 HCC 细胞 24 h 后，MTT 测定细胞活性;B． 单独或联合使用 0. 5
mg /kg ＲNase MC2 和 30 mg /kg Sorafenib腹腔注射裸鼠后，隔天测量
肿瘤大小并进行统计分析;* P ＜ 0. 05
3 讨论
中药可以减轻化疗药物的副作用，改善生活质
量，延长患者生存期。研究表明中药可以有效减轻
化疗药物对机体功能的损害，增加化疗药物的敏感
性［5，6］。因此，从中药中提取有效成分对抗 HCC，可
能是寻找治疗突破的一种方式。本组研究发现，从
苦瓜子中提取有效成分 ＲNase MC2，能显著抑制
HCC细胞增殖和增强抗癌药物 Sorafenib 的治疗效
果。我国南方地区苦瓜很受欢迎，具有很重要的药
用价值。其有效成分不仅可治疗炎症［7］，越来越多
的研究表明苦瓜有效成分可有效治疗肿瘤［8］。
ＲNase MC2 属于核糖核酸酶，是一种可将 ＲNA
水解成小分子组成的核酸酶，可分为内切核糖核酸
酶(endoribonuclease)与外切核糖核酸酶(exoribonu-
clease)。最新研究表明 ＲNA 酶不仅可以作为肿瘤
标志物［9］，同时具有抗肿瘤的功能，而对基因组不
产生毒性［10］，因此，ＲNA 酶类成为了第二类抗癌药
物。豹蛙酶(ranpirnase，又名 Onconase) ，一种产生
在豹蚊蛙的早期胚胎和未受精的卵母细胞的两栖动
物 ＲNA酶，已经进入了Ⅲ期临床试验，对不能进行
手术的间皮瘤进行治疗，并取得了良好的效果［11］。
Fang 等［12］发现 ＲNase MC2 可以激活 MAPK 和
Caspase通路诱导乳腺癌细胞凋亡。本组实验中，
ＲNase MC2 上调 p21 诱导 G2 /M 期阻滞，上调 Bec-
lin-1 诱发细胞自噬，并在体内外显著抑制 HCC细胞
增殖。相类似的，Fang 等［13］发现 ＲNase MC2 能显
著抑制 HepG2 细胞生长。不同的是，Fang 指出
ＲNase MC2 下调肝母细胞瘤细胞 HepG2 中 p21 表
达，诱导 S 期阻滞。p21 是调控细胞周期的重要蛋
白，在不同细胞周期中均扮演重要角色，其表达上调
能诱导 G1、G2 /M 期阻滞。本组实验中ＲNase MC2
诱导HCC细胞QGY-7703和 Bel-7402 中 p21 的表达，
并发生 G2 /M期阻滞。
自噬是真核细胞用于清除细胞内聚物及损伤的
细胞器，从而维持内环境稳态的一种蛋白质降解途
径。自噬是一种在正常细胞和病理状态细胞中普遍
存在的生理机制，是一种通过溶酶体(lysosome)的
降解路径。自噬在细胞的生理、病理过程中发挥了
重要作用，尤其在恶性肿瘤细胞中，自噬作为细胞代
谢压力的适应性反应发挥着重要的作用。然而，过
度上调的自噬也可引起自噬性细胞死亡，又称Ⅱ型
程序化细胞死亡，是一种不同于凋亡的细胞程序性
死亡途径。Kim等［14］研究发现 Ｒaloxifene 通过激活
AMPK 诱导细胞自噬，最终导致乳腺癌细胞死亡。
Fiorini等［15］报道 Onconase 激活 Akt /mTOＲ 诱导细
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胞自噬，从而增强胰腺癌细胞对 Gemcitabine 的敏感
性。段振玲等［16］发现在卵巢癌细胞中过表达 Bec-
lin-1 可诱导细胞自噬，从而显著抑制细胞生长。本
组实验结果表明 ＲNase MC2 能上调 Beclin-1 诱导细
胞自噬，并增强 Sorafenib 对 HCC 细胞的杀伤能力，
但这种自噬在 ＲNase MC2 导致的细胞死亡中作用
机制尚未清楚，将在未来进行深入的研究。
Sorafenib主要用于治疗晚期 HCC 患者［17］，但
也可用于治疗肾癌患者［18］。Sorafenib 是目前美国
FDA批准的 HCC治疗的唯一化疗药物，但是其并未
给大多数患者带来受益［19］。多个临床试验正在寻
找与 Sorafenib联合治疗 HCC的药物，并且研究数据
表明 Sorafenib 疗效得到了提高［19，20］。本组实验发
现 ＲNase MC2 能明显增强 Sorafenib 对 HCC 细胞活
性的抑制，裸鼠模型中联合 ＲNase MC2 与 Sorafenib
能显著抑制肿瘤生长，但具体机制尚未清楚。
综上所述，本组实验结果提示 ＲNase MC2 能通
过上调 p21 诱导 G2 /M 期阻滞，上调 Beclin-1 诱发
细胞自噬，显著抑制 HCC 细胞增殖。在体内外，
ＲNase MC2能明显增强化疗药物Sorafenib的治疗效
果。这些数据表明苦瓜子有效成分ＲNase MC2可能
是潜在的抗肿瘤药物。
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