全 文 ：※分析检测 食品科学 2013, Vol.34, No.22 119
苦丁冬青苦丁茶中咖啡酰奎尼酸类物质的
分离纯化和高效液相色谱法分析
王晴川，张 鑫，张文芹，孙昕祈，胡 冰，孙 怡*，曾晓雄
(南京农业大学食品科技学院，南京 210095)
摘 要：以苦丁冬青苦丁茶为研究材料，通过柱层析和半制备色谱分离纯化得到6种咖啡酰奎尼酸(CQA)类物质产
品，并采用TSKgel ODS-80 TsQA色谱柱和二极管阵列检测器(DAD)，建立一种便捷、灵敏的分析苦丁冬青苦丁茶
中CQA类物质的高效液相色谱分析方法。结果表明，通过半制备色谱可分离得到纯度95%以上的6种CQA类单体物
质：3-CQA、4-CQA、5-CQA、3,4-diCQA、3,5-diCQA和4,5-diCQA。色谱条件：TSKgel ODS-80 TsQA色谱柱，流
动相为水-甲醇-5‰甲酸体系，梯度洗脱，流速0.5mL/min，柱温40℃，检测波长326nm。该方法在一定范围内有良
好线性，相关系数为0.9992～0.9999，平均加标回收率为96.34%，相对标准偏差均小于3%。
关键词：苦丁茶；苦丁冬青；咖啡酰奎尼酸；纯化；高效液相色谱
Purification and HPLC Analysis of Caffeoylquinic Acids from Kudingcha Made from Ilex kudingcha C.J. Tseng
WANG Qing-chuan，ZHANG Xin，ZHANG Wen-qin，SUN Xin-qi，HU Bing，SUN Yi*，ZENG Xiao-xiong
(College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)
Abstract：Six caffeoylquinic acid (CQA) derivatives were separated by column chromatography and semi-preparative
high performance liquid chromatography (HPLC) from the crude extract of Ilex kudingcha C.J. Tseng. An HPLC method
with DAD and TSKgel ODS-80 TsQA column was developed for the simultaneous determination of CQAs in Kuding-
cha made from Ilex kudingcha C.J. Tseng. The results demonstrated that six CQA derivatives with 95% purity, 3-CQA,
4-CQA, 5-CQA, 3,4-diCQA, 3,5-diCQA and 4,5-diCQA, could be obtained through the purification of Ilex kudingcha
C.J. Tseng by semi-preparative high performance liquid chromatography (HPLC). The chromatographic conditions were
determined as follows: oven temperature set at 40 ℃, gradient elution with methanol/formic acid (5‰) with a flow rate
0.5 mL/min, and detection at a wavelength of 326 nm. As results, good linearity was observed with correlation coefficients of
0.9992–0.9999, the average recovery of the CQA derivatives from spiked samples was 96.34%, with relative standard
deviations (RSD) less than 3% (n = 3).
Key words：Kudingcha；Ilex kudingcha C.J. Tseng；caffeoylquinic acids；purification；high performance liquid chro-
matography (HPLC)
中图分类号：TS201.4 文献标志码：A 文章编号：1002-6630(2013)22-0119-04
doi:10.7506/spkx1002-6630-201322024
收稿日期：2013-01-16
基金项目：国家自然科学基金面上项目(31171666)；江苏高校优势学科建设工程资助项目
作者简介：王晴川(1989—)，女，硕士，主要从事食品生物技术研究。E-mail：sunyi01@njau.edu.cn
*通信作者：孙怡(1966—)，女，讲师，博士，主要从事食品营养化学与功能性食品开发研究。E-mail：sunyi01@njau.edu.cn
苦丁茶是我国南部和东部地区人民长期饮用的一种
代用茶，也是传统的药用植物，目前用于加工苦丁茶的
植物原料有6个科11种之多，如冬青科的苦丁茶冬青、大
叶冬青、枸骨和木犀科的女贞等，但主要原料为冬青科
的苦丁茶冬青、大叶冬青和枸骨[1]。据报道，苦丁茶富
含三萜及皂苷类、黄酮、氨基酸等活性物质，具有抗氧
化、降脂、减肥、降血压等多种药理功能[2-4]。
最近刘丽香等[5-6]分析了苦丁冬青苦丁茶的多酚含量
和抗氧化活性，结果表明苦丁茶具有较高的多酚含量和
较强的抗氧化能力；孙怡等[7]利用半制备高效液相色谱
(high performance liquid chromatography，HPLC)从苦丁冬
青苦丁茶中分离纯化得到4种咖啡酰奎尼酸(caffeoylquinic
acid，CQA)类化合物，即绿原酸(5-CQA)、4,5-O-二咖啡
酰奎尼酸(4,5-diCQA)、3,5-O-二咖啡酰奎尼酸(3,5-diC-
QA)和3,4-O-二咖啡酰奎尼酸(3,4-diCQA)。CQA类化合物
是一类由奎尼酸和不同数目的咖啡酸缩合而成的酚酸类
120 2013, Vol.34, No.22 食品科学 ※分析检测
天然化合物[8]，广泛存在于金银花、苍耳、山楂、苹果、
咖啡等植物中[9-10]，从植物中提取得到的CQA及其衍生
物被证明具有不同程度的生理、药理功能，如抗氧化活
性、抗炎活性、酶抑制作用、肝细胞保护作用等[11-16]。因
此基于前期的工作基础，本实验以苦丁冬青苦丁茶为原
料纯化与制备各种CQA物质，并建立一种简单、准确测定
苦丁茶中CQA类物质含量的HPLC方法，为苦丁茶的质量
管理、药理作用及开发利用提供技术支撑。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
苦丁冬青苦丁茶和大叶冬青苦丁茶分别由海南椰仙
生物科技有限公司、浙江大学茶学系提供；四川女贞苦
丁茶购自南京龙鸣茶叶店。
Folin-Ciocalteu试剂 日本Fluka公司；绿原酸
美国Sigma公司；HP-20树脂 日本三菱化学公司；无
水乙醇、甲酸、甲醇 南京化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
BL-220H分析天平 日本岛津公司；Heidolph
Laborota 4000 真空旋转蒸发仪 德国Heidolph公司；
Alpha 1-2型冷冻干燥机 美国Labconco公司；1100
高效液相色谱仪(包括G1328B手动进样器、G1311A四
元泵、G1379A真空脱气机、G1316A柱温箱和化学工
作站) 美国Agilent公司；TSKgel ODS-80 TsQA色谱
柱(4.6mm×250mm) 日本Tosoh公司；YMC-PACK
ODS-A色谱柱(10mm×250mm，5μm) 日本YMC公
司；AKTA Purifier蛋白纯化系统 美国通用电气公
司；HH-4数显恒温水浴锅 江苏国华电器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 粗提物的制备
称取适量粉碎过筛的苦丁冬青苦丁茶粉末，加入料
液比为1:10的沸水并于95℃水浴中浸提30min，5000×g
离心10min，上清液经浓缩、冷冻干燥得到粗提物。
1.3.2 初步分离纯化
将粗提物用去离子水配制成10g/L的溶液，上样
(5mL)于HP-20大孔树脂层析柱(5cm×30cm)，层析柱用
纯水与70%乙醇各洗脱3个柱床体积，流速1.0mL/min，
紫外与HPLC检测，收集相应的洗脱液，并浓缩、冷冻干
燥，得到F-1和F-2组分。
1.3.3 CQA单体的制备
F-1和F-2分别用去离子水配制成5g/L的溶液，
经0.22μm微孔滤膜过滤后，采用AKTA纯化系统制
备各CQA单体。色谱柱为YMC-PACK ODS-A色谱柱
(10mm×250mm，5μm)；检测波长为280nm；进样量为
500μL，每管收集3mL；F-1的洗脱条件为20%甲醇，流速
2.0mL/min；F-2的洗脱条件为40%甲醇，流速1.2mL/min。
根据紫外检测器的实时监测收集洗脱液，多次上样，将
出峰时间相同的物质富集起来，浓缩并冷冻干燥，制备
得到的化合物进行氢谱和质谱分析。
1.3.4 HPLC检测
称取适量的粗提物、F-1和F-2，分别用去离子水溶
解，定容至100mL，0.45μm微孔滤膜过滤，滤液即为
HPLC分析液。
色谱条件：TSKgel ODS-80 TsQA色谱柱；柱温
40℃；进样体积20μL；采用梯度洗脱，流动相A为
水、流动相B为甲醇、流动相C为5‰甲酸溶液，流速为
0.5mL/min，洗脱梯度如表1所示。
表 1 HPLC检测的洗脱梯度
Table 1 Scheme of elution gradient for HPLC analysis
时间/min 流动相体积分数配比/%
A B C
0 60.0 20.0 20.0
8 54.2 25.8 20.0
10 53.3 26.7 20.0
12 50.0 30.0 20.0
14 49.6 30.4 20.0
16 49.2 30.8 20.0
18 37.9 42.1 20.0
20 37.5 42.5 20.0
22 36.2 43.8 20.0
24 35.0 45.0 20.0
42 35.0 45.0 20.0
1.3.5 标准曲线的绘制
精确称取分离纯化得到的单体3-CQA、4-CQA、
5-CQA、3,4-diCQA、3,5-diCQA和4,5-diCQA各1.0mg，
溶解于1.0mL水中，配制成1.0g/L的母液，再依次稀释成
100、75、50、25、12.5、6.25mg/L和1.25mg/L的标准溶
液，进行HPLC分析，绘制标准曲线，计算回归方程。
2 结果与分析
2.1 CQA类物质的分离纯化
苦丁冬青苦丁茶粉末经浸提、过滤、浓缩、干燥得
到多酚粗提物，其中多酚含量为27.2%。粗提物经大孔树
脂HP-20分离纯化，得到F-1和F-2两个组分，多酚类物质
的回收率为83.9%。经HPLC分析，F-1和F-2分别为单取
代咖啡酰奎尼酸的混合物和二取代咖啡酰奎尼酸的混合
物，这可能是由于HP-20大孔树脂对单取代咖啡酰奎尼酸
类物质和二取代咖啡酰奎尼酸类物质的吸附特性不一样
引起的。
利用AKTA蛋白纯化系统和YMC-PACK ODS-A色谱
柱分别对F-1和F-2进行分离纯化，F-1与F-2经纯化分别得
到3个组分，收集各组分，经浓缩、冷冻干燥得到化合物
※分析检测 食品科学 2013, Vol.34, No.22 121
1～6。化合物1～6经HPLC分析，峰形清晰、单一，纯度
均在95%以上；经NMR和ESI-TOF-MS分析与参照文献
[7,17-20]，化合物1～6分别为3-CQA、4-CQA、5-CQA、
3,4-diCQA、3,5-diCQA和4,5-diCQA。
2.2 苦丁冬青苦丁茶的HPLC分析
苦丁冬青苦丁茶用沸水在95℃的条件下浸提30min，
重复两次，收集提取液，经100倍稀释，0.45μm微孔滤膜
过滤，按1.3.4节进行HPLC分析。从图1可见，采用TSK-
gel ODS-80 TsQA色谱柱和甲醇-5‰甲酸为流动相，分离
效果良好，峰形对称、清晰。6个主要色谱峰的保留时
间分别为14.409、21.415、22.027、31.486、32.650min和
38.269min，根据分离纯化得到的CQA类物质的保留时间
及紫外全扫描图谱[21]，可以确定1～6个主要色谱峰依次
为3-CQA、4-CQA、5-CQA、3,4-diCQA、3,5-diCQA和
4,5-diCQA。
2
ᯊ䯈/min
1
3
4
6
m
A
U
0 5 10 15 20 25 30 4035
1600
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
5
图 1 苦丁冬青苦丁茶提取液的HPLC色谱图
Fig.1 HPLC-DAD chromatogram of extract from Kudingcha made
from Ilex kudingcha C.J. Tseng
2.3 HPLC检测方法的建立
2.3.1 咖啡酰奎尼酸标准曲线的绘制与线性范围
分别配制6种单体物质不同质量浓度的标准溶液，以
各组分质量浓度(X，mg/L)为横坐标、色谱峰峰面积Y为
纵坐标作图，得线性回归方程，各回归方程呈良好的线
性关系(表2)。
表 2 6种咖啡酰奎尼酸物质的线性回归方程(n=3)
Table 2 Linear of calibration curvers of six caffeoylquinic acid (CQA)
derivatives (n = 3)
咖啡酰奎尼酸
类物质单体
保留时
间/min 回归方程 相关系数
线性范围/
(mg/L) 检出限/ng
3-CQA 14.409 Y = 33.312X－53.776 0.9992 1.25～100 10
4-CQA 21.415 Y = 35.146X－49.374 0.9995 1.25～100 8
5-CQA 22.027 Y = 45.035X－38.254 0.9999 1.25～100 12
3,4-diCQA 31.486 Y = 47.954X－87.963 0.9996 1.25～100 10
3,5-diCQA 32.650 Y = 13.077X－21.539 0.9998 6.25～100 8
4,5-diCQA 38.269 Y = 96.433X－81.774 0.9995 1.25～100 14
2.3.2 稳定性
以苦丁冬青苦丁茶的提取液为供试品，分别在0、
2、4、8、12、24、30h用HPLC法测定提取液中各组分的
含量。结果表明样品在0～12h内保持良好的稳定性，24h
后样品含量变化明显，30h时样品含量发生较大变化。因
此，样品应该在12h内处理分析完毕。
2.3.3 重复性和精密度
以苦丁冬青苦丁茶的提取液为材料，重复进样5
次，进行HPLC分析，分别以峰面积和保留时间作为考
察。3-CQA、4-CQA、5-CQA、3,4-diCQA、3,5-diCQA
和4,5-diCQA峰面积的RSD值分别为1.77%、0.95%、
2.97%、2.81%、0.88%和1.69%；保留时间的RSD值分别
为0.43%、0.435、1.81%、0.29%、0.11和0.53%。
2.3.4 加标回收率实验
将准确称取的6种咖啡酰奎尼酸类物质单体标准品加
入到苦丁冬青苦丁茶的提取液中，按照1.3.4节的色谱条
件进行加标回收率的测定，平均回收率达到96.34%。
表 3 回收率实验结果(n=3)
Table 3 Recovery of the method (n = 3)
成分 含量/(mg/L) 加入量/(mg/L)检测量/(mg/L) 回收率/% RSD/%
3-CQA 16.02 3.28 19.03 91.6 0.61
4-CQA 79.67 52.08 134.47 105.2 1.29
5-CQA 6.41 5.27 11.23 91.4 0.80
3,4-diCQA 45.84 19.37 63.07 89.0 1.32
3,5-diCQA 246.80 27.08 273.24 97.7 0.76
4,5-diCQA 51.08 20.00 71.71 103.2 2.80
2.4 不同苦丁茶中咖啡酰奎尼酸含量的比较
表 4 苦丁冬青苦丁茶和大叶冬青苦丁茶中咖啡酰奎尼酸类物质的含量
Table 4 Caffeoylquinic acid content in Ilex kudingcha C.J.Tseng and
Ilex lartifolia Thunb
样品 含量/(mg/g)3-CQA 4-CQA 5-CQA 3,4-diCQA 3,5-diCQA 4,5-diCQA 总量
苦丁冬青苦丁茶 3.98 3.90 13.20 19.06 36.87 42.94 119.95
大叶冬青苦丁茶 5.25 5.05 12.47 9.15 41.82 31.10 104.84
14
.4
09
21
.4
15
22
.0
27 3
1.
48
6
32
.6
50
38
.2
69a
ᰦ䰤/min
0 5 10 15 20 25 30 35 40
27
.6
26 28
.3
46
30
.8
31
31
.1
65
31
.6
61 3
4.
53
9
38
.5
53
b 3
5.
87
5
ᰦ䰤/min
0 5 10 15 20 25 30 35 40
图 2 苦丁冬青苦丁茶(a)和四川女贞苦丁茶(b)的HPLC色谱图(326nm)
Fig.2 Typical HPLC chromatograms at 326 nm for Kudingcha made
from Ilex kudingcha C.J. Tseng (a) and Ligustrum lucidum (b) respectively
122 2013, Vol.34, No.22 食品科学 ※分析检测
以苦丁冬青苦丁茶、大叶冬青苦丁茶和四川女贞苦
丁茶为材料，按1.3.4节中的分析方法对3种苦丁茶中的咖
啡酰奎尼酸类物质的组成和含量进行分析、比较。结果
表明苦丁冬青苦丁茶与大叶冬青苦丁茶的CQA类物质组
成相同，但各CQA物质的含量有差异(表4)，CQA类物质
含量分别为119.95mg/g和104.87mg/g。四川女贞苦丁茶的
HPLC图谱与苦丁冬青苦丁茶的相比(图2)，保留时间为
31.165、31.661min和38.553min的色谱峰与苦丁冬青苦丁
茶的二取代咖啡酰奎尼酸类物质的相近，但对3个色谱峰
进行全波长扫描图后，发现它们的紫外光谱图有较大差
异，表明它们是不同于CQA的物质，其结构有待于进一
步的研究。
3 结 论
根据苦丁冬青苦丁茶中咖啡酰奎尼酸类化合物特性
的不同，本实验采用大孔树脂HP-20柱层析和半制备型
HPLC从苦丁冬青苦丁茶中分离纯化得到6种咖啡酰奎
尼酸单体，即3-CQA、4-CQA、5-CQA、3,4-diCQA、
3,5-diCQA和4,5-diCQA。该方法简便易行，分离效果良
好，纯化率高，可用于CQA类单体的大量制备。采用
HPLC-DAD和TSKgel ODS-80 TsQA色谱柱，建立了一种
快速检测和分析茶叶中CQA类物质的HPLC方法，具有稳
定性高、重复性好的优点，并有望用于不同种类苦丁茶
的初步鉴定。
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