全 文 ：全和新药开发提供更翔实的实验数据。
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收稿日期:2008-05-26;　修订日期:2008-07-30
基金项目:云南省教育厅科学研究基金(No.07Y41419);
民族药资源化学重点实验室开放课题基金(No.MJY07016)
作者简介:杨海英(1975-),女(汉族),云南保山人 ,现任云南民族大学化
学与生物技术学院讲师 ,硕士学位 ,主要从事天然产物化学及仪器分析研
究工作.
高效液相色谱法测定
旱莲草中木犀草素和芹菜素的含量
杨海英 , 王雪梅 , 杜　刚 , 王建平 , 李光军 , 高云涛
(云南民族大学化学与生物技术学院·民族药资源化学重点实验室 ,云南 昆明　650031)
摘要:目的 建立了同时测定旱莲草中木犀草素和芹菜素含量的高效液相色谱(HPLC)法。方法 采用 Shim-packCLC
-ODS色谱柱(150mm×6mm, 5 μm), 流动相为乙腈 -2%的醋酸水溶液 (体积比为 30∶70),流速 1.0ml· min-1 , 检测
波长 340nm, 柱温为 40℃。结果 在上述条件下 , 木犀草素和芹菜素的质量浓度分别在 0.003 ～ 0.24mg· ml-1和 0.002 5
～ 0.20 mg· ml-1时与色谱峰面积之间的线性关系良好 , 两者的平均加标回收率分别为 100.6%和 102.5%。结论 该方
法快速 、简便 、准确 , 可用于旱莲草中木犀草素和芹菜素的 HPLC测定。
关键词:旱莲草;　木犀草素;　芹菜素;　高效液相色谱法
中图分类号:R284.1　　文献标识码:A　　文章编号:1008-0805(2008)12-2994-02
HPLCDeterminationofLuteolinandApigenininHerbaEcliptae
YANGHai-ying, WANGXue-mei, DUGang, WANGJian-ping, LIGuang-jun, GAOYun-tao
(TheSchoolofChemistryandBiotechnology, YunnanNationalitiesUniversity, KeyLaboratoryofChemistryin
Ethnic-medicineResources, MinistryofEducation, Kunming, 650031 China)
Abstract:ObjectiveToestablishanHPLCmethodforcontentdeterminationofluteolinandapigenininHerbaEcliptae.Meth-
odsHPLCseparationwascarriedoutinaShim-packCLC-ODScolumm(150mm×6 mm, 5μm)withacetonitrile-2% ace-
ticacid(30∶70, v/v)asmobilephaseataflowrateof1.0ml· min-1.Thedetectionwavelengthwas340nmandthecolumn
temperaturewasmaintainedat40℃.ResultsThereweregoodlinearrelationshipsbetweenthemassconcentrationsandthepeak
areasofluteolinandapigeninintherangesof0.003 ～ 0.24 mg· ml-1 and0.0025 ～ 0.20 mg· ml-1 , respectively.Therecovery
rateswere100.6% and102.5%, respectively.ConclusionThismethodisrapid, accurateandreproduciblefordeterminationof
luteolinandapigenininHerbaEcliptae.
Keywords:HerbaEcliptae;　Luteolin;　Apigenin;　HPLC
　　旱莲草 (HerbaEcliptae)别名墨旱莲 、金陵草 、莲子草 、旱莲
子 , 为菊科鳢肠属植物的全草 , 主产于江苏 、浙江 、江西 、湖北等
地 , 资源丰富。中医用其滋补肝肾 , 凉血止血 , 乌须发等 [ 1] 。旱
莲草的化学成分主要有三萜皂苷 、噻吩类 、香豆草醚类 、黄酮类化
合物等 [ 2] 。报道研究表明旱莲草中的黄酮类成分具有免疫调节
作用和明显的抗自由基及体内抗氧化功能 [ 3 , 4] , 近年来以木犀草
素和芹菜素为代表的天然黄酮的药理药效作用也受到日益广泛
的关注 [ 5, 6] 。王自军等 [ 7]用紫外 -可见分光光度法测定旱莲草
中总黄酮含量 , 刘翔等 [ 8]报道用 HPLC法检测旱莲草中的木犀
草素含量。为了更准确地反映旱莲草药材中黄酮苷元的含量 ,本
实验建立了 HPLC法同时检测旱莲草药材中的木犀草素和芹菜
素含量。结果表明 , 该方法简便 、准确可靠 ,为更好地开发利用旱
莲草药材资源提供了理论依据。
1　仪器与试剂
日本岛津 SPD-10AT高效液相色谱仪 (LC-10ATvp泵 ,
SPD-10Avp检测器 , SIL-10AP自动进样器 , CTO-10ASVP柱
温箱 , CBM-20A控制器);超纯水器(arium 611UF, Sartorius);超
声波清洗器(AS3120A, 天津瑞森特);电子天平(AdventurerTM,
AR2140,上海奥豪斯公司);旋转蒸发仪(R-200,瑞士 Buchi)。
乙腈为色谱纯;实验用水为超纯水 , 蒸馏水自制 ,其它试剂均
为国产分析纯试剂。木犀草素和芹菜素对照品购自成都欧康植
化科技有限公司(纯度≥98%)。旱莲草药材购自云南省西双版
纳药材公司 (经云南中医学院杨礼攀副教授鉴定为正品)。
2　方法和结果
2.1　色谱条件 色谱柱:Shim-packCLC-ODS柱(150 mm×6
mm, 5μm),流动相:乙腈 -2%的醋酸水溶液(30∶ 70), 流速:1
ml· min-1 ,检测波长:340 nm,柱温:40℃, 进样量:20 μl。
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时珍国医国药 2008年第 19卷第 12期 LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH 2008VOL.19NO.12
2.2　对照品溶液的制备 分别称取经 40℃减压干燥至恒重的木
犀草素和芹菜素对照品适量 , 精密称定 , 甲醇溶解 ,制成每毫升含
木犀草素 0.48 mg,芹菜素 0.40 mg的对照品混合溶液 ,置于 4℃
的冰箱中保存。取对照品混合溶液适量 , 加甲醇制成含木犀草素
0.003, 0.006, 0.030, 0.12, 0.24 mg· ml-1 , 芹菜素 0.0025,
0.005, 0.025, 0.10, 0.20 mg· ml-1的系列对照品混合溶液。
2.3　供试品溶液的制备 取干燥旱莲草药材粉末(过 80目筛)
约 2.0 g, 精密称定 , 置于圆底烧瓶中 ,加入 25 ml石油醚加热回
流浸提 1 h, 过滤后药渣用 40 ml85%的乙醇提取两次 , 每次加热
回流提取 2 h,过滤 , 合并提取液 , 向提取液中加入 0.6 ml浓盐
酸 , 在水浴 80℃下水解 1h。冷却 ,用 5.0 mol· L-1的氢氧化钠溶
液调至 pH约中性。用旋转蒸发仪浓缩近干 ,将浓缩液转移至 10
ml容量瓶中 , 用甲醇定容 , 摇匀 , 经 0.45 μm滤膜过滤 , 即得。
色谱图见图 1。
2.4　线性关系 分别精密吸取 “ 2.2”项中系列对照品混合溶液
20 μl, 按照上述色谱条件测定 , 以峰面积(Y)为纵坐标 ,浓度(X)
为横坐标 , 绘制标准曲线 ,得标准曲线回归方程。木犀草素:Y=
1E+07X-4 411.8 , r=0.999 7, 线性范围:0.003 ～ 0.24 mg·
ml-1;芹菜素:Y=2E+07X– 24 144, r= 0.999 5, 线性范围:
0.002 5 ～ 0.20 mg· ml-1。
2.5　精密度实验 取含木犀草素 0.12 mg· ml-1 , 芹菜素 0.10
mg· ml-1的对照品混合溶液(“ 2.2”项下制备), 连续进样 5次 ,
木犀草素 RSD=1.92%, 芹菜素 RSD=2.16%, 表明仪器的精密
度良好。
a-对照品　b-样品　 1.木犀草素　2.芹菜素
图 1　HPLC图
2.6　稳定性实验 样品试液(“ 2.3”项方法配制)放置 0, 2, 4, 18,
24 h,分别按 “ 2.1”项色谱条件测定 , 测得木犀草素的峰面积 RSD
为 1.80%, 芹菜素的峰面积 RSD为 0.92%, 表明样品放置 24 h
稳定。
2.7　回收率实验 称取已知含量的旱莲草药材粉末 5份 , 每份
1.0 g, 精密称定 , 精密加入每毫升含木犀草素 1 mg, 芹菜素 0.1
mg的混合对照品溶液 1 ml,按 “ 2.3”项方法进行样品处理 , 在上
述色谱条件下进行分析测定 , 计算木犀草素和芹菜素的回收率 ,
结果分别为 100.6%, 102.5%, RSD分别为 2.01%, 3.10% (n=
5)。
2.8　样品的测定 按 “ 2.3”项方法制备的样品溶液 , 采用上述色
谱条件进行分离 , 经测定 , 旱莲草药材样品中木犀草素的含量为
0.791mg· g-1 ,芹菜素的含量为 0.064 1 mg· g-1(n=3)。 (mg
· g-1即 1 mg黄酮苷元相当于 1g药材)。
3　讨论
3.1　检测波长的选择 据文献报道 [ 9]木犀草素和芹菜素在 340
～ 360 nm之间有较大吸收峰 , 木犀草素的最大吸收波长为 350
nm, 芹菜素在 340 nm处吸收峰达最大 , 考虑到样品中芹菜素含
量很低 ,最后选定 340nm作为检测波长。
3.2　提取溶剂的选择 本文分别考察了水 、乙醇 -水(85∶15)
混合溶剂作为提取溶剂对提取效果的影响。结果显示采用水作
为提取溶剂时 , 色谱图中未检测到芹菜素峰 ,且木犀草素含量相
对较低 。因此选择乙醇 -水(85∶15)混合溶剂作为提取溶剂。
3.3　水解条件的确定 为了准确测量旱莲草中木犀草素和芹菜
素的含量 , 我们考察了盐酸浓度和水解时间对提取样品中所含黄
酮苷元含量的影响。在上述提取条件下 , 考察盐酸浓度为 0.08,
0.16, 0.24, 0.32 mol· L-1对黄酮苷元含量的影响 , 结果当盐酸
为 0.24mol· L-1时 ,测得的黄酮苷元含量最高。然后考察了提
取液在 0.24mol· L-1盐酸中水解 0.5, 1, 2 h对黄酮苷元含量的
影响 , 结果水解 1 h以上 ,黄酮苷水解基本完全。实验结果表明 ,
最佳水解条件是提取液在 0.24 mol· L-1盐酸中水解 1 h。
3.4　提取物中木犀草素和芹菜素的存在形式 黄酮类化合物在
植物中大多以糖苷的形式存在 [ 10 , 11] , 为考察提取物中木犀草素
和芹菜素的存在形式 ,本文对以下提取方法和 “ 2.3”项提取法所
得样品溶液的测定结果进行比较。
称取样品约 2.0 g, 精密称定 , 置于圆底烧瓶中 , 加入 25 ml
石油醚浸提 1 h, (加热温度:80℃), 过滤后药渣用 40 ml85%的
乙醇提取两次 ,每次加热回流提取 2 h,过滤 , 合并提取液 , 用旋
转蒸发仪浓缩近干 ,将浓缩液转移至 10 ml容量瓶中 , 用甲醇定
容 , 摇匀 ,经 0.45μm滤膜过滤 ,即得。
按此提取方法提取所得样品溶液用 HPLC在相同的色谱条件
检测 ,发现在保留时间为 10.5 min和 20.1 min时没有任何峰出
现 , 说明未经酸水解的提取物中不含木犀草素和芹菜素。由此可
以判定提取物中木犀草素和芹菜素几乎全部以糖苷的形式存在。
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LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH 2008VOL.19NO.12 时珍国医国药 2008年第 19卷第 12期