全 文 ：第 34 卷 第 4 期
2013 年 7 月
内 蒙 古 农 业 大 学 学 报
Journal of Inner Mongolia Agricultural University
Vol． 34 No． 4
Jul． 2013
北沙柳 SSR － PCR反应体系优化及引物筛选*
张国盛1， 张 玮1， 李小龙2， 黄海广1， 曲 娜3， 冯玉军4， 王林和1
(1． 内蒙古农业大学林学院，呼和浩特 010019;2． 内蒙古自治区乌兰察布市林业局，集宁 010047;
3． 内蒙古林业科学研究院，呼和浩特 010010;4． 鄂尔多斯市乌审旗林业局，嘎鲁图 017300 )
摘要: 以 TIANGEN试剂盒法提取北沙柳嫩叶的 DNA 为模板，利用柳属和杨属的 SSR 引物，建立了北沙柳 SSR －
PCR反应体系，对反应体系中影响聚合酶链式反应(PCR)的因素进行了优化。结果表明，在 25μl 的 PCR 反应体系
中，DNA模板用量为 40ng，TaqDNA 聚合酶 0． 05U /μl，10 × PCR buffer(含 Mg2 +)2. 5mM，dNTP 0. 25mM，SSR 引物
0. 5μM，加 ddH2O补足至 25μl时结果最好。利用该体系初步筛选出 30 对适合北沙柳 SSR扩增的引物，并采用优化
筛选出的 12 对引物对 9 个产地的 270 个北沙柳无性系进行 PCR扩增，多态位点百分率达到 90. 4%，表明柳属和杨
属的 SSR引物可以在北沙柳上应用。
关键词: 北沙柳; SSR － PCR; 反应体系优化; 引物筛选
中图分类号: S722． 3 + 3 文献标识码: A 文章编号:1009 － 3575(2013)04 － 0059 － 05
OPTIMIZATION OF THE SSR － PCR SYSTEM AND
SELECTION OF PRIMERS IN Salix psammophila
ZHANG Guo － sheng1， ZHANG Wei1， LI Xiao － long2， HUANG Hai － guang1，
QU Na3， FENG Yu － jun4， WANG Lin － he1
(1． College of Forestry ，Inner Mongolia Agricultural University，Huhhot 010019，China;
2． Inner Mongolia Ulanqub Forestry Administration，JiNing 010047，China;
3． Inner Mongolia Academy of Forestry Science，Huhhot 010010，China;
4． Forestry Bureau of Ushen Banner in Erdos，GaLuTu 017300，China)
Abstract: Using the DNA which extracted from Salix psammophila with TIANGEN as template and the SSR of Salix and Populus as
primer，the factors of PCR in reaction system were optimized. The results indicated that，in the optimized PCR reaction system，the
most proper combination of 25μl reaction liquid is 40 ng template DNA，0. 05 U /μl Taq DNA polymerase，2. 5 mmol 10 × PCR buffer
(Mg2 +)，0. 25 mmol dNTP，0. 5μmol primer and enough ddH2O to eke out 25μl reaction liquid. With the help of this system，30
pairs of Salix psammophila SSR primers were selected. 270 Clones from 9 original areas were amplified by 12 primers. percentage of
polymorphic band is 90. 4% . It＇s proves that the SSR of Salix and Populus can be used in Salix psammophila.
Key words: Salix psammophila; SSR － PCR; optimization of reaction system; primer screening
北沙柳(Salix psammophila C. Wang et Ch Y.
Yang)别名沙柳，为杨柳科柳属落叶丛生灌木，毛乌
素沙地特有种［1］，是重要的防风固沙树种，也是纤维
板、刨花板、纺织、造纸等产业的重要原料。北沙柳
具有平茬复壮的特性，通常 3 ～ 5 年内生长迅速，以
后逐渐缓慢，甚至停止，平茬后又能迅速恢复生长，
具有轮伐期短的特点。所以，利用好平茬后的北沙
柳枝条，将会为北沙柳造纸和纤维板产业提供一个
新兴产业链。北沙柳枝条绵、软、细长，去皮后洁白
并具有光泽，为编制和出口柳编的优良原料，其嫩树
* 收稿日期: 2012 － 12 － 17
基金项目: 国家自然科学基金(31160167)，教育部高等学校博士点基金(20091515110005)
作者简介: 张国盛(1960 －)，教授，主要从事林木遗传改良、种群生态学研究．
鲜叶营养价值高，是牲畜的好饲料，叶可供压绿肥，
它的枝杆易燃，生长迅速，是干旱地区的良好薪材。
同时，北沙柳的树皮还可提取鞣料制革，皮与根则均
可入药。因此，开展北沙柳种质资源保护及定向选
育是十分必要的。
SSR 标记又称简单重复序列(Simple Sequence
Repeats，SSR)，是指普遍存在于真核生物基因组中
的由 1 ～ 6 个核苷酸组成的串连重复结构，SSR 长度
较短，广泛分布于基因组的不同位置，这类序列的重
复长度具有高度变异性。一般认为，SSR 序列中重
复单位数目高度变异的原因是由于在 DNA 复制或
修复过程中的分子滑动或不等交换所致。利用 PCR
技术，扩增每个位点的微卫星 DNA 序列，通过电泳
可以分析核心序列的长度多态性。SSR 分析具有①
多态性丰富，②为共显性标记，③高质量的信息，④
可通过 PCR扩增，即所需 DNA 样品量少，⑤引物具
有通用性等优点。SSR 标记技术已广泛用于基因定
位、遗传作图、多态性分析、构建 DNA 指纹图谱
等［2 － 8］各个领域。SSR标记虽具有试验程序简单等
优点，但因其扩增过程中有诸多因素的影响，给研究
工作带来不便。目前，SSR 技术已在望天树［9］、树莓
［10］、悬铃木［11］、杨树［12］、花生［13］、光萼荷属植
物［14］、结缕草属植物［15］、光皮桦［16］、胡桃［17］等标记
研究中进行了反应体系建立与优化，并得以应用，但
尚未见到有关北沙柳 SSR体系建立的相关报道。本
实验旨在通过筛选反应体系中各因素的最佳组合，
并进行引物筛选检验，建立适合北沙柳基因组 SSR
－ PCR扩增反应体系，并为北沙柳的定向选育、基因
定位及品种鉴定等研究奠定基础。
1 材料与方法
1． 1 试验材料
实验材料采自位于鄂尔多斯达拉特旗造林总场
沟心召分场北沙柳种质资源保存库。2010 年 4 月上
旬在该种质资源保存内，每个产地采集 30 个无性
系，对 9 个产地的北沙柳枝条进行了采集，采集的枝
条，带回实验室进行水培，待嫩叶展开后，采集嫩叶
备提取 DNA之用。
1． 2 方法
1． 2． 1 DNA 的提取及检测 将从取各无性系样品
的新鲜嫩叶约 0. 2g在液氮中研磨成粉末后，采用可
以结合特异性 DNA 的吸附膜和独特的缓冲液系统
的 TIANGEN试剂盒法，从北沙柳叶片中提取模板
DNA，提取的模板 DNA，用 1%琼脂糖凝胶电泳检测
质量，置于 － 20℃冰箱中保存，用于 PCR扩增。
1． 2． 2 PCR反应体系的优化 PCR 反应体系优化
时，参照已经发表的柳属其它植物的 PCR 反应体
系，对反应体系中的 4 个主要影响因素在 4 个水平
上进行优化(表 1)。优化试验的模板 DNA 用量暂
定为 30ng，试验重复 2 次。
1． 2． 3 PCR扩增产物的检测 扩增产物用 1. 5%琼
脂糖凝胶电泳检测，用核酸染料染色，用 DL3000
Marker进行标记，80V 恒定电压下，在 1 × TBE 缓冲
液中电泳 1h左右，在 G:BOX 凝胶成像系统下观测
并且照相，确定扩增产物重复性好、特异性条带清
晰、杂带少的反应体系为最优反应体系。
1． 2． 4 引物退火温度梯度试验 PCR反应中，退火
温度的高低是直接影响引物与模板的特异性结合的
重要因素，因此本试验采用 PCR 梯度模式，分别在
每对引物的 Tm 值上下设置 12 个梯度的退火温度
(表 2)，以选出每对引物的最佳退火温度。
1． 2． 5 PCR扩增程序 SSR － PCR扩增反应在博日
科技公司生产的 LifePro TC PCR 扩增仪上进行。反
应程序为:94℃预变性 5min;然后 94℃变性 50s，50
～ 57℃退火 50s，72℃延伸 1min，30 个循环;最后
72℃延伸 7min;于 4℃下保存。
1． 2． 6 SSR 引物筛选 本试验根据 SSR 标记的引
物可用于近缘类群，标记位点可能在属内种间，甚至
在科内属间可以通用这一特点，通过查阅文献，选取
已经发表的未有过序列共 45 对，由上海捷瑞生物工
程有限公司合成。
2 结果与分析
2． 1 DNA模板质量检测
对所提取 DNA质量，用 1%琼脂糖凝胶电泳进
行检测，检测结果表明，试验提取的 DNA 条带清晰，
无降解，质量好(图 1)。
图 1 部分参试材料的电泳检测图
Fig． 1 Electrophoresis of genomic DNA for some tested samples
2． 2 北沙柳 SSR反应体系的建立
根据正交试验设计的 16 个反应体系进行体系
06 内 蒙 古 农 业 大 学 学 报 2013 年
优化，依照 SSR － PCR 扩增结果中(图 2)条带强弱，
认为 2、4、5、6、9、10、12 反应体系均能扩增出比较清
晰的条带，进一步后，最后认为最佳反应体系为体系
4。利用反应体系 4，对 DNA模板量进行了单因素梯
度(20ng、40ng、60ng、80ng)试验，根据电泳结果(图
3)表明，DNA浓度不同，对扩增产物电泳的基本带
型不受影响，只是在带的强弱与亮度上会有一定的
影响。模板 DNA浓度从 20ng 到 60ng，随着 DNA 用
量的增加，扩增条带逐渐变粗，变亮，更加清晰，而
DNA用量的增加到 80ng时，条带又逐渐变细。在所
设置的 4 个 DNA 浓度梯度中，20ng 的条带较弱，
40ng和 60ng 2 个浓度下条带均较清晰，因此，在该
反应体系中模板 DNA 浓度在 40ng ～ 60ng 均可。结
合 SSR － PCR 反应体系以及模板 DNA 浓度测定结
果，确定北沙柳 SSR － PCR 反应体系的总体积为
25μl，即 TaqDNA 聚合酶 0. 05U /μl，10 × PCR buffer
(含 Mg2 +)2. 5mM，DNA 模板 40ng，dNTP0. 25mM，
SSR引物 0. 5μM，加 ddH2O补足至 25μl。
2． 3 北沙柳 SSR引物筛选及最佳退火温度的确定
应用本试验建立并优化后的 SSR － PCR 扩增体
系，从柳属和杨属的 45 对 SSR引物中初步筛选出 30
对可用于北沙柳的 SSR 引物，占全部引物的
66. 7%，并对其中的 12 对引物，采用 PCR 梯度模式
进行了退火温度的检测，筛选出 12 对引物的最佳退
火温度(表 3)。这些引物在北沙柳基因组扩增的条
带清晰，重复性好，通过 PCR 反应体系的优化和扩
增循环数的改变，能够获得可靠清晰的条带，可用于
北沙柳种质资源的遗传多样性检测。
2． 4 优化体系在北沙柳中的应用
采用筛选出的 12 对引物和优化后的反应体系，
对 9 个产地的 270 个北沙柳无性系的 DNA 进行了
SSR － － PCR扩增，共扩增出 73 条带，即 73 个位点，
其中有 66 个位点是多态性的，多态位点百分率变化
幅度为 50% ～ 100%，总多态位点达到 90. 4%。12
对引物扩增位点的变化幅度为 2 个 ～ 18 个，平均每
对引物的扩增位点数为 6. 08 个，平均多态位点数为
5. 5 个(表 4)。
表 1 SSR － PCR正交试验设计表［L16(4
4)］
Tab． 1 Orthogonal design for SSR － PCR［L16(4
4)］
编号 No．
因素 Factor
TaqDNA (U/μl) 10 × buffer(Mg2 +)(mM) dNTP(mM) SSR (μM)
1 0. 05 1. 0 0. 10 0. 2
2 0. 05 1. 5 0. 15 0. 3
3 0. 05 2. 0 0. 20 0. 4
4 0. 05 2. 5 0. 25 0. 5
5 0. 10 1. 0 0. 15 0. 4
6 0. 10 1. 5 0. 10 0. 5
7 0. 10 2. 0 0. 25 0. 2
8 0. 10 2. 5 0. 20 0. 3
9 0. 15 1. 0 0. 20 0. 5
10 0. 15 1. 5 0. 25 0. 4
11 0. 15 2. 0 0. 10 0. 3
12 0. 15 2. 5 0. 15 0. 2
13 0. 20 1. 0 0. 25 0. 3
14 0. 20 1. 5 0. 20 0. 2
15 0. 20 2. 0 0. 15 0. 5
16 0. 20 2. 5 0. 10 0. 4
表 2 PCR扩增退火温度梯度表
Tab． 2 Annealing temperature gradient of PCR amplifucation
编号(No). 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
温度 Annealing temperature(℃) 42 42. 4 43. 2 44. 8 46. 7 49. 3 52. 3 54. 9 56. 9 58. 6 59. 5 60
16第 4 期 张国盛等: 北沙柳 SSR － PCR反应体系优化及引物筛选
表 3 筛选的 SSR引物序列及退火温度
Tab． 3 Seqence information and optimum annealing temperature
引物名称
Primer Codes
引物序列(5＇to3＇)
Nucleotide sequences|
(5 to 3＇)
退火温度/℃
Annealing
temperature
引物名称
Primer Codes
引物序列(5＇to3＇)
Nucleotide sequences
(5 to 3＇)
退火温度/℃
Annealing
temperature
ORPM_306
F:ACACGCTCACATCCTTCCTT
R:ACCAAAGACCACCCACTCAG
52.3 gSlMCT024
F:TCATTTGCTCGATGAGGTTG
R:GTGGTAGTTGCAAAAGGGGA
56.9
ORPM_146
F:CAAAGGAGCTCCAACTCCAA
R:TGGATGGTCAGGTTGTCAAA
54.9 gSlMCT011
F:TTCATCTCCCCGTTCACTTC
R:ACCGTTAGGATGGCATCTCG
56.9
WPMS16
F:CTCGTACTATTTCCGATGATGACC
R:AGATTATTAGGTGGGCCAAGGACT
52.3 SB233
F:AAATTACCGTCCAACTAAAGA
R:CATTAGCCATGAACAAGTAAA
54.9
ORPM_301
F:CAAAGATGGTGACTGGATGC
R:AGCCTATTGCTTCCGATCCT
52.3 gSlMCT035
F:ACACATGACTCCCCTTCGTC
R:TCTTATGGTCGTGGTGGTGA
58.6
PMGC_2889
F:CCCAAGATCCGATTTTTGGG
R:CACAATGTACAAATCGCTGTC
56.9 SB24
F:ACTTCAATCTCTCTGTATTCT
R:CTATTTATGGGTTGGTCGATC
56.9
gSlMCT034
F:TCATCTCCATCACCGACAAG
R:CTGCCGGTTTGTTGCTAGTT
56.9 SB80
F:TAATGGAGTTCACAGTCCTCC
R:ATACAGAGCCCATTTCATCAC
54.9
图 2 正交设计 SSR － PCR反应体系扩增结果
Fig． 2 The amplified results of treatments
in orthogonal experimental design
泳道 1 ～16采用表 2处理组合编号;泳道M为 DNA 标准品
Lane 1 － 16:Treatment1 － 16 as shown
in table 2;Lane M:DNAMarker
图 3 不同模板 DNA浓度扩增结果
Fig． 3 The results of SSR － PCR of different
concentration of template DNA
1 ～4泳道的 SSR －PCR反应体系中模板 DNA分别为20、40、60、80 ng /25μl
The template DNA concentration from
lane 1 － 4 are 20，40，60，80 ng /25μl
3 结论与讨论
SSR 是目前较为理想的遗传标记之一，具有重
复性好、共显性高等特点，特别是在分子标记辅助育
种和比较基因组学研究中优势明显。由于 PCR 扩
增反应中各个因素对总体反应体系都会产生明显的
影响，因此，优化确立一个某物种的 SSR 反应体系是
高效利用 SSR 标记的必要条件。本研究采用正交试
验设计，对影响北沙柳 SSR 反应体系的 10 × buffer
(Mg2 +)、dNTPs、Taq DNA 聚合酶、引物等 4 个主要
因素进行正交实验设计，最终确立北沙柳的最佳
SSR 反应体系为 25 μl 总体，包括 TaqDNA 聚合酶
0. 05 U /μl，10 × PCR buffer(含 Mg2 +)2. 5 mM，DNA
模板 40ng，dNTP0. 25 mM，SSR 引物 0. 5 μM，加
ddH2O补足至 25 μl。
引物退火温度是影响 PCR 扩增效果的诸多因
素之一，虽然每对引物都有其理论的退火温度，但有
时在理论退火温度下，不一定能得到理想的扩增效
果。通用在 SSR － － PCR 扩增时，需要对每对引物
进行适宜退火温度的筛选。对筛选选定的 12 对引
物的退火温度筛选结果表明，12 对引物的退火温度
变化在 52. 3℃ ～ 58. 6℃间，平均为 55. 4℃，确定的
PCR反应程序为:94 ℃预变性 5 min;94 ℃变性 50
s，50℃ ～57℃退火 50 s，72 ℃延伸 1 min，30 个循环;
72 ℃延伸 7 min;最后，于 4 ℃下保存。
本试验从柳属和杨属的 SSR引物中初步筛选出
30 对可以扩增出北沙柳 DNA片段的引物，应用优化
的反应体系采用其中的 12 对引物对 9 个产地的北
沙柳群体进行 PCR扩增，共扩增 73 个位点，其中有
66 个位点是多态性的，多态位点百分率变化幅度为
50% ～100%，总多态位点达到 90. 4%。12 对引物
扩增位点的变化幅度为 2 个 ～ 18 个，平均每对引物
的扩增位点数为 6. 08 个，平均多态位点数为 5. 5
26 内 蒙 古 农 业 大 学 学 报 2013 年
个，证实该体系稳定可靠，可用于进一步的北沙构种 质资源鉴定和遗传多样性及亲缘关系分析的研究。
表 4 北沙柳 SSR引物扩增位点多态性
Tab． 4 Amplification loci polymorphism of primer
引物名称
Primer
位点数
No. of loci
多态位点数
No. of polymorphic loci
多态位点百分率(%)
Percentage of polymorphic loci
ORPM_306 18 18 100
ORPM_146 6 5 83. 3
WPMS16 3 3 100
ORPM_301 10 9 90
PMGC_2889 5 5 100
gS1MCT034 2 1 50
gS1MCT024 3 2 66. 7
gS1MCT011 5 4 80
SB233 3 3 100
gS1MCT035 5 5 100
SB24 4 4 100
SB80 9 7 77. 8
Total 73 66 90. 41
Mean 6. 08 5. 5
致谢:感谢鄂尔多斯市造林总场、沟心召分场、
内蒙古林木种苗站的有关人员对本文调查取样及试
验测定期间给予的帮助与支持。
参 考 文 献:
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