全 文 ：*’!#
几种单糖’寡糖 ?6G条件的确立及
草石蚕寡糖中水苏糖含量测定
沈德艳;!郁建平;!!张训海=!王!旋=!时维静=!蔡!立;!杨文锟;
!&+贵州大学生化营养研究所贵州贵阳 HH-H’
-+家禽疫病防控监测安徽省重点实验室安徽凤阳 -!!&#
摘%要目的&建立薄层色谱!?6G#分析几种单糖$寡糖的有效方法并测定草石蚕寡糖中水苏糖含量% 方法&以果糖$
蔗糖$棉子糖和水苏糖为研究对象从斑点分离度$斑点集中与否$有无拖尾现象及展开时间几方面探讨其在不同体系
下的薄层色谱行为’通过薄层色谱扫描!?6G1#测定草石蚕寡糖中水苏糖含量% 结果&确立适合的展开系统为乙酸乙
酯.甲醇.水.冰乙酸!&&+HX!+-X-X!+-#合适的显色剂为茴香醛0浓硫酸显色剂’草石蚕寡糖中水苏糖含量为 ’J+!V%
关键词草石蚕单糖寡糖水苏糖?6G?6G1
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中图分类号?1-$+!%%%%文献标识码I%%%%文 章 编 号&-0!’#-J$J0!’0#
收稿日期-J0’0!%通讯联系人
作者简介沈德艳!&JKH0#女硕士研究生主要从事天然产物研究%
%%草石蚕为我国创汇蔬菜!含有丰富的水苏糖$&% !
在药用和保健食品开发利用方面前景十分广阔$-% #
糖类组成的分离测定方法$!%目前主要有高效液相色
谱法(R)6G)气相色谱法(SG)薄层色谱法(?6G)
等# 由于R)6G和 SG设备昂贵!技术性强!在实际
使用过程中受到一定限制# 薄层色谱法操作简单!
成本低且灵敏度较高!是一种简便有效的定性定量
分析方法$#0’% # 本研究探讨了薄层色谱分析几种单
糖寡糖的有效方法!并通过 ?6G1 测定草石蚕寡糖
中水苏糖含量!为水苏糖产业化发展提供理论依据#
;!材料与方法
;<;!材料与仪器
草石蚕寡糖%本实验室自制&水苏糖标准品%
1=/,*公司&果糖蔗糖棉子糖无水乙醇乙酸乙
酯甲醇冰醋酸吡啶氨水异丙醇丙酮正丁醇
茴香醛浓硫酸苯胺二苯胺磷酸邻苯二甲
酸%均为分析纯&实验用水%超纯水#
1GIBBiM! 薄层色谱扫描仪6=>8,*2H 半自动
点样仪%瑞士卡玛& T40)B电动喷雾器%上海华岩
仪器设备有限公司&mQ\0J&# (‘i型电热恒温鼓
风干燥箱%上海博迅实业有限公司医疗设备厂&
IM0&&#.G型电子分析天平%上海安亭科学仪器
厂&H a-<,高效硅胶薄层板%德国(*<@3E350B*/3A
DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2009.09.063
*’$#
公司&微量点样毛细管& a&<,带盖双槽展开缸%
南京博全科技有限公司#
;<=!实验方法
&+-+&%草石蚕寡糖溶液的制备%称取草石蚕寡糖!
溶于蒸馏水中!使其浓度为 &+,/1,60&#
&+-+-%单糖寡糖及其混合糖标准溶液的制备%称
取果糖蔗糖棉子糖和水苏糖!分别溶于蒸馏水中
制得四种糖标准液!浓度均为 &+,/1,60&# 称取
果糖蔗糖棉子糖和水苏糖!共溶于蒸馏水制得混
合糖标准液# 各糖在混合糖标准液中的浓度为
&+,/1,60&#
&+-+!%展开系统和显色剂的配制%分别从质子受体
溶剂质子给予体溶剂和极性调节溶剂三方面考虑!
设定如下三个展开系统’展开系统’乙酸乙酯.甲
醇.水.冰醋酸(&-X!X-X!+-)&展开系统#’乙酸乙酯.
无水乙醇.水.氨水(&X&XKX+J)&展开系统%’正丁醇.
乙酸乙酯.异丙醇.冰醋酸.吡啶.水($X-X&-X$X’X’)#
显色剂的选择如下’显色剂’茴香醛0浓硫酸
试剂(浓硫酸 &,6加到茴香醛 +H,6的冰乙酸 H,6
中!临用前配制)&显色剂#’苯胺0二苯胺0磷酸试剂
(二苯胺 #/苯胺 #,6 KHV磷酸 -,6!共溶于
-,6丙酮中)#
&+-+#%薄层色谱方法
&+-+#+&%点样%将混合糖标准液!已知单糖寡糖标
准液和草石蚕寡糖溶液共 ’ 种样品按一定顺序点样
在薄层板上!起始线距底边 +K<,!点间距为 +’<,!
点样量约 +H!6!分次滴加!点样直径不超过 &,,!点
样过程中用吹风机冷风使样品干燥#
&+-+#+-%展层%将点好样品的薄层板置于密闭的饱
和层析缸中!采用倾斜上行法!将薄层板的下端浸在
展开剂中 +![+H<,!展开距上沿 &<,时取出薄板!
自然风干#
&+-+#+!%显色%用喷雾法显色!&HY烘 &,=>#
&+-+H%薄层色谱扫描
&+-+H+&%对照品和供试品溶液的制备%分别精密配
制 &+,/1,60&水苏糖水溶液作为对照品溶液!
&+,/1,60&草石蚕寡糖水溶液作为供试品溶液#
&+-+H+-%层析条件和扫描条件%供试品用 GI(IS
6=>8,*2H 半自动点样仪带状点样 !!6于薄层板上!
对照品分别点 &!6和 H!6!每个计量设 - 个重复# 展
开系统为乙酸乙酯.甲醇.水.冰乙酸(&&+HX!+-X-X!+-)!
显色剂为茴香醛0浓硫酸显色剂#
在薄层扫描仪上扫描薄层板显色后的斑点!确
定其最大吸收波长为 H-H>,!其它扫描条件为’单波
长反射式线性扫描&狭缝尺寸’#+ a+!,,!灵敏
度’中# _=><*2F软件进行数据处理#
=!结果与分析
=<;!展开系统综合比较
由展层效果图 &[图 ! 的结果比较!展开系统
的展层效果好# 在展开系统中!混合糖各单糖寡
糖的层析点集中无拖尾现象# 在展开系统#%
中!混合糖中单糖和二糖分离不完全# 在三个展开
系统中!草石蚕寡糖样品在于对照品水苏糖色谱相
应位置上都显有斑点!其 M9值在展开系统#中
最小#
另一方面!在展层时间上各系统有明显差别#
展开系统所用的时间最少!有利于样品的快速
分析#
所以!展开系统适合作为果糖蔗糖棉子糖
水苏糖以及草石蚕寡糖薄层层析的展开剂# 三种展
开系统的综合比较结果见表 &#
表 &%三种展开系统的综合比较
展开系统 展开系统# 展开系统%
分离度 完全 不完全 较完全
斑点集中与否 集中 较不集中 较不集中
有无拖尾现象 无 无 无
展开所用时间 K,=>#JF &-,=>-F &!,=>&-F
=<=!最佳展开系统比例的优化
通过多次调配比实验!以展开系统为研究对
象!改变体系的极性!确定展开系统t(乙酸乙酯X甲
醇X水X冰乙酸 &^&+HX!+-X-X!+-)!其展开结果见表 -#
在展开系统t中!混合糖各单糖寡糖的层析点集中
无拖尾现象!且M9值均有所提高!以水苏糖最显著!
为测定草石蚕寡糖中水苏糖含量提供条件#
*’%#
表 -%混合糖在两种展开系统中的比移值
M9值 果糖 蔗糖 棉子糖 水苏糖
展开系统 +H +#& +-& +J
展开系统t +HH +H +!- +&$
=<>!显色剂的比较
-+!+&%显色效果比较%选取最优展开系统(乙酸乙
酯X甲醇X水X冰乙酸 &^&+HX!+-X-X!+-)作为展开剂进行
展层!薄层板晾干后喷洒显色剂(茴香醛0浓硫酸
显色剂)!效果见图 &# 方法同上!喷洒显色剂#(苯
胺0二苯胺0磷酸试剂显色剂)!效果见图 ##
图 #%显色剂#的显色效果
&+混合糖标准液&-+果糖&!+蔗糖&
#+棉子糖&H+水苏糖&’+草石蚕寡糖
苯胺0二苯胺0磷酸显色剂对果糖显红棕色!其
余糖皆显灰色!背景干扰小!但显色斑点不清晰!显
色不持久# 茴香醛0浓硫酸显色剂对各糖均显蓝绿
色!背景干扰小!且显色斑点清晰!显色持久!是较理
想的显色剂#
-+!+-%显色剂稳定性%分别用新配制放置 &;放置
-;的显色剂进行显色效果比较# 新配制的显色剂显
色效果好#
=
对照品在相同位置处有指纹峰!见图 H#
图 H%供试品与对照品的?6G10:)
&- 为 &!6水苏糖标准液&!# 为 !!6草石蚕
透过液&H’ 为 H!6水苏糖
-+#+-%线性关系的考察及含量测定%由线性回归二
点法得到水苏糖标准曲线的回归方程’5^ #!K+H#’ d
&-H+H$Jj!E^ +JJ$KJ!1eb H^+!KV!标准曲线如图 ’#
式中5为斑点面积积分值!j为对照品点样量(!6)#
通过外标两点法得出草石蚕寡糖中水苏糖含量
为 ’J+!V#
=
个样!每个点均为 !!6!扫描测定峰面积!M1e为
!+$V# 对同一斑点连续扫描 H 次!峰面积的 M1e为
图 ’%水苏糖的标准曲线
&+!V!精密度良好#
-+H+-%稳定性实验%对显色后的供试品斑点在 ’
-##K@扫描 & 次!结果样品在 -#@ 内稳定!M1e为
#+-V#
-+H+!%加样回收率实验%取同一批已知含量的样品
H 份!精密称取!分别精密加入水苏糖对照品各
&+,/!按供试品溶液制备方法制备!按测定方法进
行测定!计算回收率!结果见表 !!表明本法具有良好
的回收率#
表 !%回收率实验结果
样品中水
苏糖量
(,/)
水苏糖
添加量
(,/)
测得量
(,/)
回收率
(V)
平均回
收率
(V)
M1e
(V)
&+&&- &+ -+K’ J$+#
&+J &+ &+JJK JK+J
&+&$ &+ -+& JJ+! JK+$# &+&!
&+K &+ &+JK$ J$+J
&+-J &+ -+!& &+-
>!讨论
?6G法常用于天然成分的检测!具有方便快速的
特点!本文探讨了?6G检测几种单糖和寡糖的条件!
最终选取乙酸乙酯.甲醇.水.冰乙酸(&&+HX!+-X-X!+-)
为展开系统!茴香醛 0浓硫酸为显色剂!该检测条件
的确立为继续对草石蚕寡糖中水苏糖含量测定提供
了方便#
糖类组成的分离测定方法目前主要有高效液相
色谱法 (R)6G)气相色谱法 (SG)薄层色谱法
(?6G)等# 采用SG测定糖类!遇到的主要困难$$%是
糖本身没有足够的挥发性!所以必须在气相色谱分
析之前预先转化成易挥发对热较稳定的衍生物!程
序繁琐# 采用R)6G分析时!由于糖类本身没有紫外
吸收$K% !只能采用示差折光检测器(ML)或蒸发光散
射检测器(i61e)检测! ML分辨率低!i61e虽然效
果好但目前价格昂贵!色谱柱的选择也较困难!一般
采用氨基柱但分离效果欠佳!而专用的糖柱又十分
昂贵# 现代薄层色谱配以高质量的薄层扫描仪!用
固定波长对薄层展开的斑点进行薄层扫描得出的图
谱比目测的层析图谱更为客观准确!因而具有更好
的指纹意义!是一种简便低廉有效的检测方式#
实验结果表明!水苏糖标样和草石蚕寡糖样品在相
同位置处都有指纹峰!且水苏糖标准曲线的线性关
系良好!草石蚕水苏糖含量为 ’J+!V# 温度和相对
湿度对其薄层色谱行为具有很大的影响!因此本实
验在-HY的空调房间进行!分析结果和方法的重现
!下转第 !& 页#
*(’#
表 &%四种市售不同批号 11琼脂的比较
编号 & - ! #
大肠杆菌 抑制 抑制不长 抑制 生长
大肠杆菌(临床) 抑制 抑制 生长不好 生长不好
宋内志贺菌 抑制 生长不好特征不明显 生长不好特征不明显 生长特征明显
鼠伤寒沙门氏菌 抑制 生长特征明显 生长不好特征不明显 生长特征明显
鼠伤寒沙门氏菌(临床) 抑制 生长特征不明显 生长不好特征不明显 生长不明显
金黄色葡萄球菌 不生长 不生长 不生长 不生长
表 -%改良配方
配方
蛋白胨
(/)
牛肉膏
(/)
乳糖
(/)
琼脂
(/)
胆盐BW+!
(/)
二水柠檬
酸钠(/)
五水硫代硫
酸钠(/)
柠檬酸铁
(/)
&V中性红
(,6)
+&V煌绿
(,6)
& H+ H+ & &- #+H J+H J+H &+H -+H +-H
- H+ H+ & &- #+! J+H J+H &+H -+H +-H
! H+ H+ & &- #+ J+ J+ &+! -+H +-H
# H+ H+ & &- !+K J+ J+ &+! -+H +-H
H H+ H+ & &- !+K K+H K+H &+& -+H +-H
’ H+ H+ & &- !+’ K+H K+H &+& -+H +-H
$ H+ H+ & &- !+’ K+ K+ +J -+H +-H
K H+ H+ & &- !+! K+ K+ +J -+H +-H
J H+ H+ & &- !+! $+H $+H +$ -+H +-H
注’加蒸馏水 &,6!调 PR$+[$+&#
表 !%改良配方检测结果
配方号
菌株
大肠杆菌 大肠杆菌(临床) 宋内志贺菌 鼠伤寒沙门氏菌 鼠伤寒沙门氏菌(临床) 金黄色葡萄球菌
& 0 0 0 0 0 不生长
- 0 0 d特征不明显 d特征不明显 d特征不明显 不生长
! 0 d 0 d d特征不明显 不生长
# 0 d d特征不明显 d特征不明显 d 不生长
H 0 0 d d特征不明显 d 不生长
’ 0 0 d d d特征不明显 不生长
$ 0 0 d特征不明显 d d 不生长
K d d d d d 不生长
J d d d d d 不生长
注’, d-表示生长&,0-表示抑制#
><=%培养基的质量优劣直接影响致病菌的检出!培
养基的质量检测!目前采用标准菌接种培养基观察生
长情况的定性方法!虽然可以判断培养结果!但野生菌
株的检测就是一个未知数# 因此!要比较配方的优劣!
还应做野生菌株的培养# 本次实验增加了部分野生菌
株的培养实验!得到了较为理想的 11配方#
参考文献
(&) 卫生部医政司+全国临床检验操作规程(()+第 ! 版+南
京&东南大学出版社-’&$-0$!H+
(-) 王钦升等+实用医学培养基手册(()+北京&人民军医出
版社&JJJ&
$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$
&HJ0&’+
!上接第 !K 页#
性基本令人满意#
本实验确立了薄层层析定性分析果糖蔗糖棉
子糖和水苏糖的最佳展开系统和显色剂!并且通过
?6G1测定草石蚕寡糖中水苏糖含量!为水苏糖的进
一步精制和大规模生产提供理论依据#
参考文献
(&)钟先锋黄桂东易军鹏等+银条的开发利用(U)+中国食
物与营养-’!K#&-0--+
(-)李欣易军鹏芦雷鸣+银条的壳聚糖复合涂膜保鲜效果
研究(U)+河南化工-H--!’#&-$0-J+
(!)黄瑞松+中草药多糖含量测定方法概述(U)+中国药师
-HK!&#&’K0$+
(#)王鑫芳刘颖李明江 等+用薄层色谱法检测可霉素‘组
分(U)+中国生化药物杂志-’-$!’#&!$&+
(H)6*N93E463@,*>> U)32E51 Uz1=,PA3=>3jP3>F=D3F5F23,
98ENF=>/2@=> 0A*53E<@E8,*28/E*P@598E,=
(’) 1@=,8l*g*?T8F@=;*14NF*l*73Lz18,3PE8P3E2=3F*>;
*<2=8> ,8;389!&!##0*060/NANE8>*>A5*F39E8,i>23E87*<23E
糖(U)+海峡药学-&&!!##&&&0&-+
(K)欧阳华学黎源倩肖全伟+高效液相色谱法同时测定枸
杞中单糖和低聚糖的含量(U)+四川大学学报-$!K!’#&
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